張振巍，張娜娜，石 磊，張建民，白丹丹

進(jìn)行高效液相色譜分析時(shí)，兩種洗脫方法：等度洗脫和梯度洗脫。等度洗脫是由不同溶劑構(gòu)成的固定比例的流動(dòng)相，在整個(gè)洗脫過(guò)程中，流動(dòng)相的極性、離子強(qiáng)度、pH值等因素皆保持不變。對(duì)于較復(fù)雜的中藥成分來(lái)說(shuō)，只單純的用等度洗脫來(lái)分析中藥的成分，顯然有些力不從心，為此采用梯度洗脫，在此過(guò)程中可調(diào)節(jié)流動(dòng)相的極性，改善樣品中每個(gè)組分的分離度從而達(dá)到徹底分離的目的。本文以反相鍵合相高效液相色譜為例，并以實(shí)際中藥材溶液作為樣品，介紹用二元混合溶劑流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫的一般步驟，并優(yōu)化梯度洗脫參數(shù)的方法。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 島津LC2010CHT型高效液相色譜儀 （四元泵、在線脫氣、自動(dòng)冷卻裝置、全自動(dòng)進(jìn)樣器、紫外檢測(cè)器）；梅特勒-托利多AB135-S雙量程電子天平 （瑞士）；AS10200ADT型超聲波清洗器。色譜甲醇（山東禹王實(shí)業(yè)有限公司化工分公司，批號(hào)20110103061）；實(shí)驗(yàn)用水采用雙重蒸餾水；其它試劑均為分析純。

1.2 試藥 以赤芍藥材為樣品，按照2005版藥典第一部對(duì)赤芍藥材進(jìn)行處理得到樣品溶液[2]。

2 優(yōu)化梯度洗脫方法的一般步驟

色譜柱Shim-Pack VP-ODS C18色譜柱（250mm×4.6mm，5 μm)；流動(dòng)相甲醇-0.1%磷酸梯度洗脫；流速為 1.0 ml/min；檢測(cè)波長(zhǎng)為227 nm；柱溫30℃，流動(dòng)相∶溶劑 A-B∶甲醇-水（φA可變）。

2.1 建立梯度洗脫方法 用10%～100%甲醇－水溶液，以流速0.5 ml/min沖洗色譜柱，直至基線穩(wěn)定，按照2005版藥典第一部方法對(duì)赤芍藥材進(jìn)行處理并作為樣品溶液，每次進(jìn)樣10 μl。

在30 min內(nèi)，進(jìn)行由10%～30%甲醇－水線性梯度洗脫（流速1.0 ml/min），流動(dòng)相中強(qiáng)洗脫劑甲醇以每分鐘0.6%的梯度陡度進(jìn)行洗脫。如圖1所示。

圖1 10%～30%甲醇-水線性梯度HPLC色譜圖

圖1中顯示死時(shí)間tM＝1.0 min，樣品中第一個(gè)峰與最后一個(gè)峰分的保留時(shí)間分別為ti＝1.105 min和tf＝23.366 min，此時(shí)末峰與首峰的保留時(shí)間差 Δtg為：Δtg＝tf-ti＝23.366 min-1.105 min＝22.261 min，梯度洗脫時(shí)間 tG為 30 min，依據(jù) Δtg/tG的比值，來(lái)判定是否需要進(jìn)行梯度洗脫。判斷標(biāo)準(zhǔn)為[3]：Δtg/tG≤0.25，進(jìn)行等度洗脫；Δtg/tG>0.25，進(jìn)行梯度洗脫；在本分離中：Δtg/tG＝22.261/30＝0.742，由于 0.742>0.25，所以本次分離應(yīng)進(jìn)行梯度洗脫。

由圖1可以看出，首次進(jìn)行梯度洗脫所確定的梯度洗脫時(shí)間tG并不合適，因在色譜圖中中部和結(jié)束存在時(shí)間上的浪費(fèi)，經(jīng)DAD光譜掃描5號(hào)色譜峰純度不高，在219.4 nm和261.8 nm處各有1個(gè)強(qiáng)吸收峰，估計(jì)是沒有得到完全分離。此時(shí)的梯度陡度T=ΔφA/tG=0.2/30=0.0067，需要減小此時(shí)的梯度陡度，以改善分離情況，見圖2。

圖2 5號(hào)光譜圖

2.2 改變梯度洗脫條件 由圖1中造成洗脫時(shí)間浪費(fèi)的原因，是由于梯度洗脫中強(qiáng)溶劑A選擇濃度A%變化范圍太寬引起的，為此可縮小A濃度的變化范圍，于是改用2次梯度洗脫的方法，在 0～10 min 內(nèi)采用 φA：10%～20%，此時(shí)的梯度陡度 T=ΔφA/tG=0.1/10=0.01，以縮短 1、2、3 號(hào) 3 個(gè)峰的保留時(shí)間；10～30 min 20%～30%，此時(shí)的梯度陡度 T=ΔφA/tG=0.1/20=0.005，以改善色譜峰5的分離情況。按照設(shè)置條件進(jìn)行第二次梯度洗脫，獲得圖譜如圖3。

圖3 20%～30%甲醇-水線性梯度HPLC色譜圖

由圖3可以看出1號(hào)色譜峰之前，應(yīng)該還有色譜峰的出現(xiàn)；原來(lái)的5號(hào)色譜峰已經(jīng)分離開6號(hào)，另外在4號(hào)峰前面又分離出8號(hào)峰，說(shuō)明梯度條件的改善的確帶動(dòng)了色譜峰的分離，由于5、6號(hào)2個(gè)色譜峰沒有徹底分開，所以要保持時(shí)間不變的情況下降低梯度陡度T，即0～10 min φA的比例變化為 15%～20%；10～30 min為 20%～35%，以改善色譜峰的分離。從而得到色譜圖4。

由圖4可以看出，色譜峰基本都已經(jīng)得到分離，并且此時(shí)得到的色譜峰數(shù)目最多，此時(shí)的梯度陡度 T0～10=ΔφA/tG=0.05/10=0.005，T10～30=ΔφA/tG=0.15/20=0.0075。筆者按照此流動(dòng)相梯度把進(jìn)樣時(shí)間提高到60 min未見有色譜峰的出現(xiàn)，確定赤芍藥材的色譜峰已經(jīng)分離完全。

圖4 20%～35%甲醇-水線性梯度HPLC色譜圖

3 討 論

為獲得理想的梯度洗脫分離效果和良好的重現(xiàn)性，必須在實(shí)驗(yàn)中注意以下問題：

3.1 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇 本文中采用二級(jí)管陣列檢測(cè)器對(duì)赤芍藥材的三維圖譜進(jìn)行掃描，考察了257、260.5、263、265 nm，4個(gè)波段，綜合出峰最多、分離情況最好、基線最穩(wěn)定等因素選擇了260.5 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)?？紤]到赤芍藥材自身的穩(wěn)定性，所以在用赤芍藥材進(jìn)行梯度洗脫時(shí)還要考慮到赤芍成分的穩(wěn)定性和重現(xiàn)性，在24 h以后赤芍中的有些成分的色譜峰面積出現(xiàn)下降的趨勢(shì)，可能是藥材中某些成分的不穩(wěn)定導(dǎo)致。如果藥材本身的穩(wěn)定性差，更要優(yōu)化好梯度的條件，以使藥材成分在最短的時(shí)間內(nèi)得到較好的分離。

3.2 色譜柱的平衡 每一次梯度洗脫分析結(jié)束時(shí)，流動(dòng)相的組成已和梯度洗脫開始時(shí)大不相同，為了進(jìn)行下一次的梯度洗脫，必須用起始濃度的梯度流動(dòng)相平衡一下色譜柱，直至基線穩(wěn)定。實(shí)驗(yàn)證明用起始流動(dòng)相使色譜柱平衡周期足夠長(zhǎng)，才能獲得重現(xiàn)性較好的色譜圖。針對(duì)赤芍藥材，每次進(jìn)樣結(jié)束以后都要進(jìn)行一次較長(zhǎng)時(shí)間的平衡色譜柱，才能在下次進(jìn)樣時(shí)得到重現(xiàn)性較好的圖譜。如果色譜柱平衡的時(shí)間不夠，在色譜圖中早期洗脫峰的保留時(shí)間將會(huì)發(fā)生改變，而后洗脫譜峰的保留時(shí)間一般不受影響，當(dāng)進(jìn)行反相色譜梯度洗脫時(shí)，最好從5%或者超過(guò)5%的有機(jī)相開始，可縮短柱平衡的時(shí)間；若從純水開始進(jìn)行梯度洗脫，則色譜柱就需要較長(zhǎng)的平衡時(shí)間。

3.3 空白梯度 當(dāng)開始進(jìn)行梯度洗脫前，要進(jìn)行一次空白溶液的梯度洗脫，即不注入樣品，僅按照梯度洗脫程序運(yùn)行得到的基線?？瞻滋荻葘?shí)驗(yàn)于樣品梯度洗脫程序完全相同的條件下進(jìn)行，以確定所用的溶劑對(duì)色譜干擾程度，應(yīng)盡量選擇干擾比較小的空白溶劑，得到置信度較高的色譜信息。筆者對(duì)空白梯度的流動(dòng)相進(jìn)行考察，選用去離子水、雙蒸水、超純水三者對(duì)比進(jìn)樣，圖譜顯示使用超純水進(jìn)行梯度空白可有效減少基線干擾。

3.4 梯度開始時(shí)間的滯后問題 當(dāng)確定了洗脫程序以后，從t＝0開始梯度洗脫實(shí)驗(yàn)操作，但由于實(shí)現(xiàn)梯度洗脫的儀器設(shè)備結(jié)構(gòu)或者電子控制系統(tǒng)的多種原因，使實(shí)際觀測(cè)到的梯度洗脫總是向后平移了一段時(shí)間，稱為梯度系統(tǒng)的滯后時(shí)間。并且由于水和有機(jī)溶劑的混合不是在無(wú)限小的空間內(nèi)完成的，而是在具有一定體積的梯度混合器內(nèi)實(shí)現(xiàn)，并與脈動(dòng)阻尼器和連接的體積有關(guān)，這些體積越大，梯度洗脫的線性就越差，這同時(shí)也是衡量HPLC系統(tǒng)梯度洗脫線性優(yōu)劣的判定標(biāo)準(zhǔn)。

3.5 梯度方案的優(yōu)化 在本文中以改變梯度陡度，根據(jù)實(shí)際情況改變洗脫時(shí)間，從而達(dá)到優(yōu)化目的；也可以固定時(shí)間而通過(guò)改變梯度陡度達(dá)到洗脫的目的。如果在一個(gè)梯度洗脫中，聚集在色譜圖中間部分的組成過(guò)于密集，未能實(shí)現(xiàn)理想的分離，此時(shí)也可以改變梯度洗脫程序曲線的形狀，由一階梯度洗脫變成二階梯度洗脫，即在有2個(gè)梯度陡度的一階梯度洗脫中間部分加入適當(dāng)時(shí)間間隔的等度洗脫部分，這樣就可以使色譜中間部分的組分色譜峰獲得理想的分離效果。

[1]Jandera P,Churacek J.Gradient elution in column liquid chormatograghy[M].Theory and Practice,Amsterdam,Elsevier,1985.59-129.

[2]國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典.2010年版一部[M].北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2005.109.

[3]于世林.高效液相色譜方法及應(yīng)用[M].北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2005.122-140.