鄧世果， 吳干華，2， 楊會(huì)杰

（1上海理工大學(xué) 管理學(xué)院，上海 200090；2華南師范大學(xué) 南海學(xué)院，佛山 528225）

系統(tǒng)生物學(xué)的一個(gè)重要任務(wù)是認(rèn)識(shí)細(xì)胞內(nèi)調(diào)控和代謝關(guān)系.代謝網(wǎng)絡(luò)依據(jù)基因組數(shù)據(jù)將代謝系統(tǒng)表示為一個(gè)圖，為代謝組學(xué)數(shù)據(jù)的分析提供可視化的研究平臺(tái).隨著基因組測序技術(shù)的迅速發(fā)展，到目前為止，包括細(xì)菌、古生菌、真核生物在內(nèi)的數(shù)百種生物全基因組序列先后測序完成.根據(jù)基因組注釋信息可以按功能的不同將基因分成不同的組，其中較大的組是可指導(dǎo)合成酶的基因組.酶可催化細(xì)胞內(nèi)代謝反應(yīng)，依據(jù)代謝反應(yīng)可構(gòu)造代謝網(wǎng)絡(luò).人們構(gòu)建了專門的代謝反應(yīng)數(shù)據(jù)庫，如KEGG、BioCyc、PUMA2等，這些數(shù)據(jù)可以用于構(gòu)建代謝網(wǎng)絡(luò)，并且可以對(duì)代謝網(wǎng)絡(luò)作進(jìn)一步分析.作為復(fù)雜非線性動(dòng)態(tài)調(diào)控系統(tǒng)，代謝網(wǎng)絡(luò)的研究越來越受到重視［1］.

基因組范圍的代謝網(wǎng)絡(luò)包含的代謝物很多，傳統(tǒng)的方法（如代謝控制）不太實(shí)用.Ma等［2－3］首次提出具有可操作性的圖論方法用以構(gòu)造和分析代謝網(wǎng)絡(luò)，得到普遍認(rèn)可，成為當(dāng)前對(duì)代謝系統(tǒng)的整體結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析的主要手段.構(gòu)造的代謝網(wǎng)絡(luò)有3類：用節(jié)點(diǎn)表示代謝物，用節(jié)點(diǎn)間的連線表示代謝反應(yīng)，構(gòu)成代謝物網(wǎng)絡(luò)；以代謝反應(yīng)為節(jié)點(diǎn)，以節(jié)點(diǎn)之間連線表示代謝物，就是反應(yīng)網(wǎng)絡(luò)［4－5］；以反應(yīng)所需的酶為節(jié)點(diǎn)，以節(jié)點(diǎn)間連線表示代謝物，得到酶網(wǎng)絡(luò)［6－8］.以上構(gòu)建代謝網(wǎng)絡(luò)方法的基本步驟是：a.從KEGG數(shù)據(jù)庫取得某一個(gè)特定物種細(xì)胞內(nèi)全基因組注釋信息，得到所有可能的酶；b.根據(jù)酶催化的代謝反應(yīng)數(shù)據(jù)庫，得到選取的物種細(xì)胞內(nèi)所有可能的化學(xué)反應(yīng)，確定出這些化學(xué)反應(yīng)的底物和產(chǎn)物；c.確定出每個(gè)化學(xué)反應(yīng)的反應(yīng)方向；d.將每個(gè)化學(xué)反應(yīng)的反應(yīng)物和底物用有向邊連接起來，得到代謝物網(wǎng)絡(luò).其它類代謝網(wǎng)絡(luò)可以采取相似的辦法得到.

上述步驟中的關(guān)鍵問題和需要深入考慮的問題包括：a.網(wǎng)絡(luò)節(jié)點(diǎn)的確定.因?yàn)楹芏嗌磻?yīng)涉及到水、氧氣、三磷酸腺苷（ATP）、二磷酸腺苷（ADP）等物質(zhì)，如果在代謝網(wǎng)絡(luò)中保留這些物質(zhì)的話，大部分的節(jié)點(diǎn)之間通過這類節(jié)點(diǎn)就彼此相連了，整個(gè)網(wǎng)絡(luò)將是以這些節(jié)點(diǎn)為核心的致密結(jié)構(gòu)，核心致密的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)掩蓋了人們感興趣的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu).同時(shí)，ATP和ADP等只是在反應(yīng)中提供能量，并不參與物質(zhì)的合成和分解.因此，這類物質(zhì)應(yīng)該去掉，以凸顯代謝網(wǎng)絡(luò)的非平凡結(jié)構(gòu).有些文獻(xiàn)依據(jù)經(jīng)驗(yàn)，簡單地將節(jié)點(diǎn)度（也就是與其它節(jié)點(diǎn)聯(lián)結(jié)的數(shù)目）大于10的節(jié)點(diǎn)刪除掉；有些文獻(xiàn)則將節(jié)點(diǎn)按照度排序，將排在前20位的節(jié)點(diǎn)刪除掉；有些文獻(xiàn)比較保守，保留了這些度大的節(jié)點(diǎn)，同時(shí)也列出了這些特殊節(jié)點(diǎn)作為分析代謝網(wǎng)絡(luò)的參考［9］.b.生化反應(yīng)方向的確定.Ma等［2］提出的方案中，系統(tǒng)地列舉了多種情況，如消耗氧氣、產(chǎn)生二氧化碳等，認(rèn)為這些化學(xué)反應(yīng)是不可逆的.并且對(duì)整個(gè)化學(xué)反應(yīng)庫進(jìn)行了系統(tǒng)的鑒別.但是，這一方法本身需要經(jīng)驗(yàn)的累計(jì)，不可避免地有人為因素起作用.特別是他們的工作是在本世紀(jì)初完成的，而近10年來代謝數(shù)據(jù)庫不斷地進(jìn)行更新，需要有更具可操作性的代謝網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)造方法.本文在對(duì)前人文獻(xiàn)總結(jié)的基礎(chǔ)上，以構(gòu)建魚腥藻代謝網(wǎng)絡(luò)為例，試圖對(duì)這兩個(gè)關(guān)鍵問題提出一些可行的解決方案.

1 代謝數(shù)據(jù)庫

通過基因組注釋信息可以識(shí)別出能指導(dǎo)合成催化代謝反應(yīng)的酶的基因.到目前為止出現(xiàn)了多種用于預(yù)測物種特異的酶基因、酶、以及酶催化反應(yīng)的方法，由此產(chǎn)生了許多優(yōu)秀的代謝數(shù)據(jù)庫，如表1所示.這些數(shù)據(jù)庫是代謝網(wǎng)絡(luò)重建的必要資源［10－12］.

表1 常用生物數(shù)據(jù)庫Tab.1 Common biological databases

2 圖論術(shù)語

在圖論中，圖表示元素與元素之間的二元關(guān)系，其中，元素表示為圖的頂點(diǎn)，元素之間的關(guān)系表示為頂點(diǎn)之間的連線.1個(gè)無向圖G＝ （V，E），由頂點(diǎn)集合V和邊集合E構(gòu)成，每條邊代表1個(gè)頂點(diǎn)對(duì)（u，v）間的無方向連線.1個(gè)有向圖D＝ （V，A），由頂點(diǎn)集合V和弧集合A構(gòu)成，其中，每條弧代表1個(gè)頂點(diǎn)對(duì)（u，v）間從u到v的有向邊.如果忽略其中所有弧的方向，則一個(gè)有向圖就成為無向圖［13］.復(fù)雜系統(tǒng)諸多元素作為節(jié)點(diǎn)，元素之間的關(guān)系作為邊，構(gòu)造出來的圖就是復(fù)雜系統(tǒng)的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)描述，如描寫代謝系統(tǒng)結(jié)構(gòu)的代謝網(wǎng)絡(luò).

3 重構(gòu)代謝網(wǎng)絡(luò)

3.1 代謝圖數(shù)據(jù)

3.1.1 反應(yīng)數(shù)據(jù)

KEGG數(shù)據(jù)庫中文件reaction.list包含迄今發(fā)現(xiàn)的所有生化反應(yīng).每個(gè)反應(yīng)都有各自的編號(hào)，以R開頭后跟5位數(shù)字；每個(gè)化合物也都有各自的編號(hào)，以C開頭后跟5位數(shù)字.如化學(xué)反應(yīng)R00480：

L－Aspartate＋ATP＝4－Phospho－L－aspartate＋ADP

在reaction.list文件中表示為R00480：

C00049＋C00002→C03082＋C00008

生物體內(nèi)的很多代謝反應(yīng)都是有方向的，不可逆性是代謝反應(yīng)的一個(gè)本質(zhì)特點(diǎn).而KEGG并沒有給出這些信息，Ma和Zeng整理并提出了11種不可逆反應(yīng)［2］：

a.有氧生成的反應(yīng)；

b.大多數(shù)有二氧化碳生成的反應(yīng)；

c.大多數(shù)有氨氣生成的反應(yīng)；

d.大多數(shù)有磷酸鹽生成的反應(yīng)；

e.由S－Adenosyl－L－methionine生成 S－Adenosyl－L－h(huán)omocystine，提供一個(gè)甲基的反應(yīng)；

f.有四氫葉酸生成，轉(zhuǎn)移一個(gè)碳原的反應(yīng)；

g.大多數(shù)消耗ATP，且沒有其它高能代謝物（GTP、CAP等）參與的反應(yīng)；

h.消耗UDP－sugar，轉(zhuǎn)移糖的反應(yīng)；

i.消耗 CDP－diacylglycerol，轉(zhuǎn)移磷脂酰基的反應(yīng)；

j.類似于PAPS＋A＝PAP＋B的反應(yīng)；

k.幾種水解反應(yīng).

然后Ma和Zeng又對(duì)所有的生化反應(yīng)進(jìn)行了判別，給出化學(xué)反應(yīng)的方向.

實(shí)際上，文獻(xiàn)［2］中對(duì)代謝途徑有著更加全面深入的研究，對(duì)代謝途徑中發(fā)生的化學(xué)反應(yīng)方向等有著明確的結(jié)論，這些信息保存在KEGG數(shù)據(jù)庫的reaction＿mapformula.lst文件中.這一文件收集了文獻(xiàn)中可以找到的生化反應(yīng)的方向、化學(xué)反應(yīng)發(fā)生所在的代謝途徑等信息.因此，本文采取一個(gè)新的解決方案，即可以采取一個(gè)組合的策略確定生化反應(yīng)的方向：a.在reaction＿mapformula.lst里邊能查到的化學(xué)反應(yīng)，其反應(yīng)方向采用這里邊已經(jīng)明確的反應(yīng)方向；b.剩余的化學(xué)反應(yīng)，能采用Ma等提出的11條規(guī)則判斷反應(yīng)方向；c.前兩個(gè)策略不能判斷的其它化學(xué)反應(yīng)，設(shè)為雙向的［2，14－15］.

3.1.2 反應(yīng)與酶的關(guān)系

從KEGG數(shù)據(jù)庫提取酶與反應(yīng)的有關(guān)信息，見“reaction”文件，其中，給出了每個(gè)反應(yīng)以及催化該反應(yīng)所需的酶的信息，酶都有各自的EC編號(hào)，以EC開頭，后跟4個(gè)整數(shù)，整數(shù)之間用點(diǎn)隔開，4個(gè)整數(shù)依次對(duì)酶的功能類別進(jìn)行詮釋，越后面的整數(shù)對(duì)酶的功能描述得越詳盡.如R00480：2.7.2.4，表示EC2.7.2.4催化反應(yīng)R00480.

3.1.3 酶與基因的對(duì)應(yīng)關(guān)系

KEGG數(shù)據(jù)庫中含有enzyme文件，enzyme文件對(duì)酶的相關(guān)信息描述得非常詳盡，包括名稱、參與生化反應(yīng)過程和方式、所在的代謝路徑、不同物種中對(duì)應(yīng)的基因名稱、數(shù)據(jù)來源等.可由該數(shù)據(jù)得到某一特定物種里邊存在的所有的酶.

3.2 初步代謝圖

連接初步代謝反應(yīng)網(wǎng)絡(luò)圖的具體做法為：對(duì)每個(gè)反應(yīng)，以代謝物和代謝底物為節(jié)點(diǎn)，以反應(yīng)為有向邊，從代謝物指向代謝底物.如化學(xué)反應(yīng)R00480：

C00049＋C00002→C03082＋C00008

如果不可逆，從該反應(yīng)可獲得4條有向邊：

如果可逆，則可將反應(yīng)拆成方向相反的兩個(gè)反應(yīng)，方法同上.把所有反應(yīng)都轉(zhuǎn)化一遍后就構(gòu)建完成了一個(gè)初步代謝圖，以糖酵解過程為例，如圖1所示（見下頁）.

3.3 代謝圖的修正

在圖1（b）中可以發(fā)現(xiàn)藍(lán)色框中的代謝物（CO2、H2O2等）的度比較大，稱為通用代謝物（currency metabolite）［4］.然而這些通用代謝物一般是電子轉(zhuǎn)移或某些功能基團(tuán)（磷酸基、氨基、一碳單位、甲基等）轉(zhuǎn)移的攜帶者，只是協(xié)助代謝底物生成代謝產(chǎn)物，并未參與代謝產(chǎn)物的合成.包含有通用代謝物的代謝網(wǎng)絡(luò)表現(xiàn)出與真實(shí)生物意義不符的結(jié)論，使得代謝網(wǎng)絡(luò)的平均最短路徑縮短［5，8］.如從草酸到氧氣只需要兩步反應(yīng)（見下頁圖1），顯然這在細(xì)胞內(nèi)是無法完成的，與細(xì)胞內(nèi)的真實(shí)生化反應(yīng)不符.

因此，為了使細(xì)胞中主要化合物的轉(zhuǎn)化表現(xiàn)得更明顯，在代謝網(wǎng)絡(luò)中確切地顯示生化反應(yīng)的步驟，人們通常將這些通用代謝物及一些小分子化合物（如水、氨氣、二氧化碳、氧等）從代謝網(wǎng)絡(luò)中移出.現(xiàn)介紹一種對(duì)此問題的處理方法.

文獻(xiàn)［2］在KEGG代謝反應(yīng)數(shù)據(jù)庫的基礎(chǔ)上進(jìn)行手工修正補(bǔ)充后得到一個(gè)新的數(shù)據(jù)庫，去掉了每個(gè)反應(yīng)中的通用代謝物及小分子化合物，并明確地給出了每個(gè)反應(yīng)的可逆性信息.在這個(gè)數(shù)據(jù)庫中，他們并不是統(tǒng)一地將通用代謝物都去掉，而是根據(jù)每個(gè)反應(yīng)來確定其中的通用代謝物.例如，在許多反應(yīng)中，谷胺酸（glutamate，GLU）和α－酮戊二酸（2－oxoglutarate，AKG）都是用于轉(zhuǎn)移氨基的通用代謝物，然而在反應(yīng)中AKG參與了合成GLU，因此

AKG＋NH8＋NADPH→GLU＋NADP＋＋H2O＋AKG在此反應(yīng)中它們都是主要代謝物，它們之間的連接應(yīng)保留［9］.由于該數(shù)據(jù)庫幾乎全部用手工構(gòu)建，因此，質(zhì)量有所保證，已被許多研究者采用.但是，他們的處理依據(jù)經(jīng)驗(yàn)，帶有人為性質(zhì)，并且也已經(jīng)有近10年的歷史，面臨數(shù)據(jù)更新問題.

圖1 糖酵解過程Fig.1 Glycolysis process

因此，本文提出另外一個(gè)可行的辦法.在KEGG數(shù)據(jù)庫的LIGAND部分包含的文件reaction＿mapformula.lst中給出了代謝路徑中的化學(xué)反應(yīng)，即包含了每個(gè)反應(yīng)的方向以及主要代謝物，而省略了如ATP、NADH這一類的輔助因子（cofactor）.確定這些主要代謝物采用的標(biāo)準(zhǔn)和文獻(xiàn)［2］使用的標(biāo)準(zhǔn)是相同的.上述采用的標(biāo)準(zhǔn)只是針對(duì)代謝路徑中存在的化學(xué)反應(yīng)進(jìn)行了處理，而不是所有的化學(xué)反應(yīng)都處理過.因此，本文中采用的策略：a.在reaction＿mapformula.lst中出現(xiàn)的化學(xué)反應(yīng)，采用該文件中的信息；b.對(duì)比reaction＿mapformula.lst與reaction中相同的化學(xué)反應(yīng)，確定出所有可能的通用代謝物.將這些通用代謝物從a不能判斷的化學(xué)反應(yīng)中剔除掉.通過以上方法修正后，之前的R00480：

就從4條邊減少為只有1條邊：C00049→C03082這是因?yàn)镃0002和C0008均為通用代謝物，這2個(gè)節(jié)點(diǎn)和與之相連的邊都要去掉.這樣就可以得到一個(gè)完整的代謝物網(wǎng)絡(luò)，可在此基礎(chǔ)上開展進(jìn)一步的研究，如網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)、動(dòng)力學(xué)、代謝功能之間的關(guān)系的討論等.

3.4 反應(yīng)圖

圖2為將代謝物網(wǎng)絡(luò)圖轉(zhuǎn)化為反應(yīng)圖的示意圖.反應(yīng)圖就是以反應(yīng)為節(jié)點(diǎn)，如果兩個(gè)反應(yīng)（反應(yīng)A和反應(yīng)B）共用一個(gè)或多個(gè)代謝物或代謝底物，且反應(yīng)A得到的產(chǎn)物是反應(yīng)B的底物，就將這兩個(gè)反應(yīng)連起來，由A指向B，這樣就構(gòu)成了一個(gè)有向的反應(yīng)圖，如圖2（c）所示.相對(duì)代謝圖而言，反應(yīng)圖離酶圖關(guān)系更近了些.具體細(xì)節(jié)和需要注意的問題與代謝圖類似.

圖2 代謝反應(yīng)網(wǎng)絡(luò)圖Fig.2 Metabolic reaction network

3.5 酶 圖

酶圖與反應(yīng)圖也并非一一對(duì)應(yīng)，因?yàn)椋环N酶可以催化不同的反應(yīng)，一種反應(yīng)也可能需要多種酶共同參與.酶圖以酶為節(jié)點(diǎn)，以酶A和酶B為例，如果酶A參與的反應(yīng)產(chǎn)生的產(chǎn)物正好是酶B參與的反應(yīng)的底物，則就連接酶A與酶B，且由酶A指向酶B.

4 以魚腥藻代謝網(wǎng)絡(luò)為例的網(wǎng)絡(luò)圖

通過以上代謝網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)造方法，構(gòu)造出魚腥藻的代謝網(wǎng)絡(luò)，并對(duì)該網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行了社團(tuán)劃分，如圖3所示，當(dāng)分為23個(gè)社團(tuán)時(shí)，聚類系數(shù)Q值最大，此時(shí)Q＝0.799.

為了更清楚地看清網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，圖3沒有顯示度是1的節(jié)點(diǎn)，也刪除掉了2個(gè)孤立的節(jié)點(diǎn).不同顏色表示不同的社團(tuán)結(jié)構(gòu).

本文計(jì)算了網(wǎng)絡(luò)度分布（圖4）和平均聚類系數(shù).由圖4可知，該網(wǎng)絡(luò)的度分布De服從冪律分布，冪律指數(shù)α＝－3.0，其聚集系數(shù)C（k）與節(jié)點(diǎn)度k的關(guān)系如圖5所示，因此，不滿足，C（k）～k∝k－α，即該網(wǎng)絡(luò)不存在層次結(jié)構(gòu).經(jīng)計(jì)算，該代謝網(wǎng)絡(luò)的網(wǎng)絡(luò)直徑為D＝21，平均最短路經(jīng)約為8.從圖6（見下頁）可知，最可幾分布Me發(fā)生在最短路徑d＝7的位置，最可幾概率為0.12.以上結(jié)論與一般生物代謝網(wǎng)絡(luò)的性質(zhì)大體上一致，因此，該重建代謝網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)造方法是可行的.

圖3 魚腥藻代謝圖Fig.3 Topological structure for anabaena metabolic network

圖4 魚腥藻代謝網(wǎng)絡(luò)的度分布Fig.4 Degree distribution of anabaena metabolic network

圖5 平均集聚系數(shù)與度的關(guān)系圖Fig.5 Relationship of average clustering coefficient versus degree

圖6 最短路經(jīng)分布Fig.6 Distribution function for shortest paths

5 結(jié) 論

代謝網(wǎng)絡(luò)重建是系統(tǒng)生物學(xué)的基本任務(wù)，是采用復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)觀點(diǎn)分析代謝數(shù)據(jù)的基礎(chǔ).隨著數(shù)據(jù)的日益增多和不斷更新，設(shè)計(jì)合理可行的代謝網(wǎng)絡(luò)重建方法成為迫切需要解決的課題.

本文在總結(jié)前人工作基礎(chǔ)上，就構(gòu)建代謝網(wǎng)絡(luò)步驟中的兩個(gè)核心問題，提出了可行的解決方法.依據(jù)KEGG中文件reaction＿mapformula.lst提供的化學(xué)反應(yīng)的方向信息，提出確定代謝網(wǎng)絡(luò)中邊的方向的規(guī)則；并且與reaction文件中的化學(xué)反應(yīng)比較，提出確定通用代謝物的規(guī)則，用于確定代謝物網(wǎng)絡(luò)里的節(jié)點(diǎn).以魚腥藻為例，對(duì)構(gòu)造出來的代謝網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行了討論.

代謝網(wǎng)絡(luò)的重建是一個(gè)復(fù)雜的過程，也因研究目的的不同而不同.本文討論的方法適合于復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)及其與代謝功能相關(guān)性分析.當(dāng)討論代謝網(wǎng)絡(luò)動(dòng)力學(xué)，特別是代謝網(wǎng)絡(luò)上的流問題的時(shí)候，則需要更加準(zhǔn)確的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，必須考慮到化學(xué)反應(yīng)在細(xì)胞內(nèi)發(fā)生的位置信息、特定環(huán)境和細(xì)胞生命周期中基因表達(dá)量等.因此，高精度的代謝網(wǎng)絡(luò)涉及脫氧核糖核酸DNA測序和注釋、化學(xué)反應(yīng)位置確定、基因表達(dá)、化學(xué)反應(yīng)方向、通用代謝物確定等多個(gè)復(fù)雜環(huán)節(jié)，是一個(gè)復(fù)雜的系統(tǒng)工程.本文的構(gòu)造方法也可用于構(gòu)造人際關(guān)系等網(wǎng)絡(luò).

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