田厚軍，陳藝欣，魏 輝，邱良妙，劉其全，石 妍，占志雄

福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所，福建福州350013

芒果橫線尾夜蛾Chlumetia transverse Walker又名蛀梢夜蛾、鉆心蟲，屬鱗翅目夜蛾科。在我國分布于廣東、廣西、海南、云南、福建和臺灣等省，國外芒果產(chǎn)區(qū)如泰國和印度也有廣泛分布。由于芒果經(jīng)濟(jì)價值較高，近年來大量種植。芒果橫線尾夜蛾幼蟲蛀食芒果嫩梢和花穗，引起嫩梢枯死、花序頂部叢生或枯死，影響果樹的正常生長發(fā)育和產(chǎn)量。據(jù)初步調(diào)查，嫩梢的受害率在35%以上，花穗受害率在25%以上(何林和楊永生，2003)。目前，對該蟲的防治基本依賴化學(xué)農(nóng)藥(陳業(yè)淵等，2001;陳永森等，2009;高松峰等，2000;彭正強(qiáng)等，2008)，既污染環(huán)境，又容易產(chǎn)生抗藥性。

目前，國內(nèi)外已對多種鱗翅目昆蟲的觸角感覺器進(jìn)行了表面細(xì)微結(jié)構(gòu)的研究(王桂榮等，2002;楊廣等，2001;Hallberg et al.，1994)，但對橫線尾夜蛾研究較少，且多為發(fā)生為害以及觸角電鏡掃描等的初步描述(馮榮揚(yáng)，1997;何林，2003;莫圣書和趙冬香，2006)。有關(guān)其雌、雄成蟲生理生化特征、幼蟲為害特性、性信息素、寄主選擇機(jī)理等均未見報道。周志軍和王世貴(2005)證實(shí)，橫線尾夜蛾觸角感覺器是接受外界化學(xué)信息的主要結(jié)構(gòu)，具有嗅覺、觸覺和聽覺等功能(劉玉雙和石福明，2005;Zacharuk，1980)。

植物揮發(fā)性次生物質(zhì)是昆蟲借以尋找寄主或產(chǎn)卵場所的一類它感信息化合物，調(diào)控著昆蟲對寄主植物的定向、識別和取食等行為(杜家緯，2001)。不同昆蟲對植物揮發(fā)性物質(zhì)的感受能力有著顯著差異。許多植物在特定時間和空間都會產(chǎn)生具有各自特性的氣味，植食性昆蟲以這些氣味為線索準(zhǔn)確尋找和定位寄主植物(Bruce et al.，2005)。以棉鈴蟲Heliothis armigera(Hubner)為例，寄主植物信號物質(zhì)中的六碳醇和醛能引起其雌、雄蟲觸角電位反應(yīng)(electroantennogram，EAG)(Chen et al.，1997)。本研究采用電生理方法，測定芒果橫線尾夜蛾雌、雄成蟲對12種芒果揮發(fā)物的觸角電位反應(yīng)，為從化學(xué)信號角度闡明其寄主定向和雌、雄交配機(jī)理，探討受害器官與果實(shí)、植物天然化學(xué)信號物質(zhì)、害蟲三者之間的關(guān)系，闡明害蟲致害機(jī)理提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

橫線尾夜蛾幼蟲或成蟲采集于福建省福清市，于福建省植物保護(hù)研究所飼養(yǎng)室用嫩葉、嫩梢飼養(yǎng)。化蛹后用指形管單只分裝，羽化后分別取2日齡未交配雌、雄蛾進(jìn)行電生理行為測定;化蛹后挑取1對蛹分裝于同一只指形管中，羽化并交配后用于電生理行為測定。蛹和成蟲飼養(yǎng)溫度(25±1.0)℃，光照時間16 h·d－1，相對濕度65% ～75%。

根據(jù)本試驗(yàn)測得以及已報道的芒果揮發(fā)物種類及結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，選取具有代表性的信息化合物12種:乙酸乙酯(ethyl acetate)為分析純，購自天津市科密歐化學(xué)試劑開發(fā)中心;純度分別為≥85.0%和≥95.0%的異松油烯(terpinolene)和 α-水芹烯(αphellandrene)購自 Fluka公司;純度分別為≥95.0% 、≥98.5% 、≥97.0% 、≥70.0% 、≥85.0% 、90.0% 、99.0% 、≥98.0% 、99.0% 、98.0% 的 β-香葉烯(β-myrcene)、β-石竹烯(β-carypohyllene)、香橙烯(aromadendrene)、朱欒倍半萜(valencene)、α-法呢烯(α-farnesene)、(+)-3-坎烯［(+)-3-carene］、α-萜品烯 (α-terpinene)、反-2-己烯-1-醛 (trans-2-hexen-1-al)、(1R)-(+)-α-蒎烯［(1R)-(+)-α-pinene］、順-3-己烯醇(Z-3-hexen-1-ol)(作為參照)購自Sigma Aldrich公司。石蠟油(paraffin)購自北京化工廠。

SPME 萃取柄(Supleco公司)，100 μm 聚二甲基硅氧烷(PDMS)萃取頭(Supleco公司)，Saturn 3900/2100氣相色譜—質(zhì)譜聯(lián)用儀(美國Varian公司)。觸角電位儀(荷蘭Syntech公司)主要包括毛細(xì)管電極(內(nèi)徑0.2 mm)、微動操作儀(Syntech MP-15)、直流/交流放大器(Syntech UN-06)和刺激氣流控制裝置(Syntech CS-05)。

1.2 GC-MS 分析條件

色譜條件:美國Varian Saturn 3900/2100氣相聯(lián)用儀(GC-MS)，采用DB-5色譜柱(柱長30 m，內(nèi)徑 0.25 mm，液膜0.25 μm)，進(jìn)樣口溫度250 ℃，起始柱溫 80℃，保持 5 min，以 4℃·min－1升至200℃，保持2 min，以15℃·min－1升至260℃，恒溫至色譜分析結(jié)束。載氣為氦氣，純度＞99.999%。流速1 mL·min－1，不分流進(jìn)樣。

質(zhì)譜條件:電離方式EI，電子能量70 eV，阱溫220℃，傳輸線溫度170℃。GC-MS接口溫度280℃。采集方式為全掃描，質(zhì)量掃描范圍為40～650 amu。

1.3 揮發(fā)性氣體收集

使用前將SPME萃取頭旋入萃取柄，用無水乙醇浸泡萃取頭1 h后，將萃取頭在氣相色譜儀進(jìn)樣口270℃下老化30 min。將不同生長期的芒果梢、花和果實(shí)分別放于小型干燥器內(nèi)，30 min后驅(qū)趕干燥器內(nèi)空氣，然后用無味的透明薄膜封口。將SPME萃取頭插入薄膜內(nèi)吸附揮發(fā)物，30 min后用于GC-MS進(jìn)樣。

1.4 觸角電位測定方法

觸角電位測定方法參照田厚軍等(2011)的研究。將20 μL樣品溶液均勻滴在長5 cm、寬0.5 cm的“V”字形濾紙條上，放入巴斯德滴管中，滴管末端連接刺激氣流控制裝置，送氣管管口與觸角縱向垂直，并相距 1 cm。調(diào)節(jié)連續(xù)氣體流量為124 mL·min－1，刺激氣體流量為20 mL·min－1，每次刺激時間為0.2 s。2次刺激之間間隔40 s，以保證觸角感覺器官功能完全恢復(fù)。同一化合物同一劑量在1根觸角上平行刺激3次，取平均值，每個樣品測試5根觸角。對于每種樣品化合物，刺激順序?yàn)閰⒄?、樣品、參照，前?次參照取平均值。以液體石蠟油為溶劑并作為對照，將12種化合物配制成濃度均為10 μg·μL－1的溶液。每種化合物的EAG 相對反應(yīng)值以 10 μg·μL－1的順-3-己烯醇為參照。

EAG相對反應(yīng)值=(待測樣品的反應(yīng)值－對照反應(yīng)值)/(參照物的平均反應(yīng)值－對照反應(yīng)值)×100%

1.5 數(shù)據(jù)分析

芒果揮發(fā)物成分通過普圖庫(NIST05和WILEY7)進(jìn)行計(jì)算機(jī)檢索并輔以人工識別確定化合物種類，按照面積歸一化法計(jì)算各化合物的相對含量，定量分析在Excel軟件上進(jìn)行。采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行方差分析，數(shù)據(jù)采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤(SE)表示，揮發(fā)物峰面積以及相對含量差異性、EAG反應(yīng)顯著差異性采用Duncan's新復(fù)極差檢驗(yàn)法(SSR，P=0.05)進(jìn)行分析比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 芒果不同部位揮發(fā)性物質(zhì)的化學(xué)成分

芒果3個部位的揮發(fā)性物質(zhì)共檢測到29種，且多為萜烯類化合物。芒果花揮發(fā)物有22種，含量較高的為 α-水芹烯(43.64%)和異松油烯(29.33%);芒果梢有11 種，α-古蕓烯(23.63%)含量最高;成熟芒果有13種，石竹烯含量最高，為29.47%。僅異松油烯和β-蓽澄茄油烯在芒果3個部位中均被檢測到，但含量存在差異。其中，異松油烯在芒果3個部位揮發(fā)物中的含量分別為29.33%、19.99%、0.59%，可見同一物質(zhì)在不同部位揮發(fā)物中的含量差異較大;而β-蓽澄茄油烯在芒果花中的含量為3.51% ，梢中為 2.18%，果實(shí)中為 6.05%(表 1)。

2.2 橫線尾夜蛾成蟲對芒果揮發(fā)性物質(zhì)的觸角電位反應(yīng)

芒果橫線尾夜蛾未交配雌、雄蛾與已交配雌、雄蛾對同一種化合物的EAG相對值之間均無顯著差異(P＞0.05)。未交配雌蛾對反-2-己烯醛的EAG反應(yīng)值與其他化合物相比差異顯著(P＜0.05)。而異松油烯、香橙烯、乙酸乙酯、β-香葉烯、(+)-3-莰烯、α-水芹烯之間，β-石竹烯、α-法呢烯、(1R)-(+)-α-蒎烯之間，(+)-3-莰烯、朱欒倍半萜、β-香葉烯之間，朱欒倍半萜和α-水芹烯之間均無顯著差異(P＞0.05)。其余化合物之間則差異顯著(P＜0.05)。未交配雄蛾對反-2-己烯醛的EAG反應(yīng)值與其他化合物相比差異顯著(P ＜ 0.05)。(1R)-(+)-α-蒎烯和 α-萜品烯之間，(+)-3-莰烯和α-水芹烯之間，香橙烯、朱欒倍半萜、異松油烯之間均有顯著差異;α-萜品烯和α-法呢烯之間、α-萜品烯和 β-石竹烯之間、α-萜品烯和香橙烯之間也差異顯著(P＜0.05)。其余化合物之間則無顯著差異(P＞0.05)(表2)。

交配雌蛾對反-2-己烯醛的EAG反應(yīng)值與其他化合物相比有顯著差異(P＜0.05)。而β-石竹烯、α-法呢烯、(1R)-(+)-α-蒎烯之間，(+)-3-莰烯、朱欒倍半萜、β-香葉烯之間，異松油烯、香橙烯、乙酸乙酯、β-香葉烯、(+)-3-莰烯、α-水芹烯之間，以及朱欒倍半萜和α-水芹烯之間均無顯著差異(P＞0.05)。其余化合物之間則差異顯著(P＜0.05)。交配雄蛾對反-2-己烯醛的EAG反應(yīng)值與其他化合物相比有顯著差異(P＜0.05)。且 α-萜品烯和α-法呢烯之間、α-萜品烯和 β-石竹烯之間，α-萜品烯和香橙烯之間、(1R)-(+)-α-蒎烯和 α-萜品烯之間，(+)-3-莰烯和 α-水芹烯之間，香橙烯、朱欒倍半萜、異松油烯之間差異也均顯著(P＜0.05)。其余化合物之間則無顯著差異(P＞0.05)(表2)。

表1 芒果不同部位揮發(fā)物主要化學(xué)成分及其相對含量Table 1 Comparison of main constituents and their relative content of main volatiles in different parts of mango plants

表2 橫線尾夜蛾成蟲對芒果揮發(fā)性物質(zhì)的EAG相對反應(yīng)值Table 2 Relative EAG amplitude of C.transverse to mango volatiles

3 結(jié)論與討論

本研究結(jié)果表明，芒果果實(shí)、花、梢不僅化學(xué)組分的數(shù)量不同，而且各組分的相對含量差異也較大。僅異松油烯和β-蓽澄茄油烯在3個部位均被檢測到，但相對含量差別較大。異松油烯在芒果花和果實(shí)中的含量分別為29.33%和0.59%。芒果梢中 α-愈創(chuàng)木烯(9.23%)和 α-古蕓烯(23.63%)含量遠(yuǎn)高于芒果花和果實(shí)，這是否與橫線尾夜蛾幼蟲偏愛蛀食芒果嫩梢有關(guān)還有待于趨性行為試驗(yàn)的驗(yàn)證。本研究檢測到的芒果揮發(fā)物成分與文獻(xiàn)中報道的化合物(何方奕等，2008;施偉等，2010;鄭華等，2008)大多相符，主要為異松油烯、β-香葉烯、β-石竹烯、香橙烯、α-水芹烯等。本研究中芒果不同部位揮發(fā)物的種類并不豐富，可能與芒果品種以及不同的地理環(huán)境有關(guān)。

本試驗(yàn)結(jié)果還表明，未交配雌、雄蛾、交配雌、雄蛾對同一種化合物的EAG反應(yīng)值無顯著差異(P＞0.05)。這說明雌、雄蛾交配前后對同一種化合物的敏感性并沒有變化，且雌、雄蛾對其有相似的嗅覺感受能力(Raguso et al.，1996);同時也說明交配對橫線尾夜蛾雌、雄蛾的觸角電位反應(yīng)影響較小。未交配雌、雄蛾與交配雌、雄蛾對反-2-己烯醛的EAG相對反應(yīng)值(100%左右)遠(yuǎn)高于其他化合物，說明反-2-己烯醛對橫線尾夜蛾可能有較高的趨性行為生物活性。EAG相對反應(yīng)值較大的還有α-水芹烯(約65%)和朱欒倍半萜(約64%)，相對反應(yīng)值最小的則為β-石竹烯(約40%)，但除反-2-己烯醛外，其他各化合物之間均無顯著差異(P＞0.05);在所測化合物中，EAG相對反應(yīng)最高值約為最低值的2.5倍，而反應(yīng)次高值約為最低值的1.6倍。這些化合物是否具有生物活性還有待于室內(nèi)定向行為和室外田間行為試驗(yàn)的驗(yàn)證。

目前，利用植物源揮發(fā)物和性信息素之間的互作關(guān)系調(diào)控昆蟲的行為機(jī)制已取得一定進(jìn)展(Reddy＆Guerrero，2004)。王振華等(2008)報道了植物源揮發(fā)物對昆蟲性信息素的增效作用及其增效機(jī)制。蘇茂文和張鐘寧(2007)利用植物源揮發(fā)物對害蟲的引誘作用成功防御了害蟲。但橫線尾夜蛾生活周期較長，室內(nèi)飼養(yǎng)條件不成熟，僅靠野外采樣既費(fèi)時又費(fèi)力。因此，建立一套成熟、可行的室內(nèi)飼養(yǎng)方法尤為重要。同時，植物天然信號物質(zhì)的化學(xué)結(jié)構(gòu)復(fù)雜，且組成比例不同結(jié)果也不同，而目前的研究仍處于初步探索階段，要真正提高其對昆蟲性信息素的增效作用還需大量的工作。后續(xù)研究將關(guān)注橫線尾夜蛾生理生化行為以及性信息素鑒定和性誘劑開發(fā)等方面，以探討芒果揮發(fā)物與橫線尾夜蛾性信息素之間的信號聯(lián)系機(jī)理。

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