陳麗華，呂 新，林碧嬌，李 巍，李玥仁

福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院中心實(shí)驗(yàn)室，福建省精密儀器農(nóng)業(yè)測試重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建福州350003

隨著轉(zhuǎn)基因作物的大面積種植，其潛在的環(huán)境安全性問題備受關(guān)注。轉(zhuǎn)基因作物的生態(tài)風(fēng)險評估主要包括靶標(biāo)害蟲對轉(zhuǎn)基因作物的抗性、轉(zhuǎn)基因作物對非靶標(biāo)生物的影響、轉(zhuǎn)基因作物對生物多樣性及環(huán)境生態(tài)系統(tǒng)的影響、轉(zhuǎn)基因作物與近緣物種之間的基因漂移等(郭建英等，2008;王振等，2007)。其中，轉(zhuǎn)基因作物的外源基因和基因表達(dá)產(chǎn)物通過根系分泌物和殘體降解進(jìn)入土壤生態(tài)系統(tǒng)，可能對土壤微生物群落組成以及土壤生態(tài)系統(tǒng)造成影響(宋亞娜等，2012;王振等，2007)，因此，該領(lǐng)域的內(nèi)容已成為研究熱點(diǎn)。Lin＆Pan(2010)通過DGGE分析認(rèn)為，轉(zhuǎn)抗黃瓜花葉病毒的西紅柿對土壤微生物群落的影響非常小。Chun et al.(2011)研究表明，原卟啉氧化酶轉(zhuǎn)基因水稻與非轉(zhuǎn)基因水稻在微生物群落多樣性及群落組成上沒有差異。陳曉雯等(2011)通過DGGE和Biolog技術(shù)分析了轉(zhuǎn)Bt基因水稻對土壤微生物群落結(jié)構(gòu)及功能的影響，結(jié)果表明，在水稻不同生育期，轉(zhuǎn)Bt基因水稻與其對照對土壤細(xì)菌數(shù)量、土壤微生物遺傳多樣性及功能多樣性的影響存在一定差異，但這種差異并不持久。袁紅旭等(2005)對轉(zhuǎn)幾丁質(zhì)酶和葡聚糖酶基因的抗真菌水稻七轉(zhuǎn)39種植后根際土壤微生物群落和酶活性進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)七轉(zhuǎn)39根際土壤真菌和細(xì)菌數(shù)量少于非轉(zhuǎn)基因水稻七絲軟粘。李本金等(2006)研究表明，與相應(yīng)非轉(zhuǎn)基因水稻七絲軟粘相比，轉(zhuǎn)基因水稻七轉(zhuǎn)39、E90、E10根際土壤細(xì)菌、放線菌和真菌數(shù)量發(fā)生了一定的變化，但差異不顯著。

水稻收獲后的殘茬常重返稻田以提高土壤肥力，但其可能對土壤微生物產(chǎn)生影響。本研究通過室內(nèi)模擬田間秸稈還田試驗(yàn)，分析抗真菌轉(zhuǎn)基因水稻秸稈降解對土壤細(xì)菌數(shù)量及多樣性的影響，以期為抗真菌轉(zhuǎn)基因水稻的環(huán)境安全性評估提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試土壤取自福建省福州市閩侯縣良種場水稻田(未種植過轉(zhuǎn)基因水稻)0～20 cm土層。將取回的土壤剔除雜質(zhì)后室溫下自然晾干，于德國萊馳超離心研磨儀(ZM200)中研磨，過20目篩網(wǎng)后，儲存于4℃冰箱備用。土壤為黃紅壤，部分理化性狀:pH 5.00，總碳20.35 g·kg-1，總氮5.51 g·kg-1，有效磷 27.20 mg·kg-1，速效鉀 27.74 mg·kg-1。

供試水稻種子由廣東海洋大學(xué)提供，分別為含有RC24和β-1，3-Glu基因的雙價抗真菌轉(zhuǎn)基因水稻轉(zhuǎn)品8，含RC24、RCH10、RAC22基因的三價抗真菌轉(zhuǎn)基因水稻轉(zhuǎn)品1以及相應(yīng)非轉(zhuǎn)基因水稻七絲軟粘。其中，RC24和RCH10為水稻堿性幾丁質(zhì)酶基因，RAC22為水稻酸性幾丁質(zhì)酶基因，β-1，3-Glu是來源于苜蓿的葡聚糖酶基因。轉(zhuǎn)品1和轉(zhuǎn)品8是通過基因槍法將串聯(lián)的2～3個外源基因?qū)肫呓z軟粘中，經(jīng)多代(R8代)選育，證實(shí)外源基因能穩(wěn)定遺傳并對稻瘟病和紋枯病表現(xiàn)出中抗的轉(zhuǎn)基因水稻品系(馮道榮等，1999、2001)。

試驗(yàn)所用秸稈為轉(zhuǎn)品1、轉(zhuǎn)品8和七絲軟粘收獲后的秸稈，將其曬干后分別剪成小于1 cm的碎段，置于德國萊馳超離心研磨儀(ZM200)中研磨，過10目篩后存于陰涼處備用。

1.2 土壤處理

試驗(yàn)設(shè)4個處理(趙勇等，2005):不加秸稈的土壤(S)，含50 g·kg-1轉(zhuǎn)品1秸稈的土壤(S-Z1)，含50 g·kg-1轉(zhuǎn)品8秸稈的土壤(S-Z8)，含50 g·kg-1七絲軟粘秸稈的土壤(S-CK)。將樣品充分混勻后，分裝于25個100 mL的燒杯中，每個燒杯裝處理土樣50 g，用滅菌的去離子水調(diào)節(jié)含水量至最大后，室溫黑暗培養(yǎng)，進(jìn)行室內(nèi)秸稈降解試驗(yàn)。培養(yǎng)過程中通過稱重法保持土壤含水量一致。試驗(yàn)設(shè)3次重復(fù)。

1.3 土壤細(xì)菌數(shù)量的測定

黑暗培養(yǎng)后0、10、20、30、40、50、90 d 取樣，每次每個處理隨機(jī)取樣3次。采用稀釋平板法測定可培養(yǎng)細(xì)菌數(shù)量，培養(yǎng)基為牛肉膏蛋白胨。細(xì)菌總數(shù)的測定:取一定稀釋度的土壤懸液，依次過8、5、3 μm濾膜，去除大部分土壤顆粒，然后參照肖琳等(2004)測定水體中細(xì)菌的方法，以吖啶橙染色后在熒光顯微鏡(Olympus，BX51)上觀察并計算土壤懸液的細(xì)菌數(shù)，最后換算成單位樣品中的細(xì)菌數(shù)。

1.4 土壤細(xì)菌群落多樣性分析

1.4.1 DNA的提取 稱取0.5 g土壤樣品，按照FastDNA?SPIN for Soil Kit(MP Biomedicals，LLC.)的步驟提取土壤樣品微生物總DNA，并將其置于-20℃保存待用。

1.4.2 PCR擴(kuò)增 使用細(xì)菌通用引物357f和518r(Yu＆ Morrison，2004)擴(kuò)增16S rRNA V3區(qū)。引物序列:357f為5'-CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGGCCTACGGGAGGCAGCAG-3'，518r為5'-ATTACCGCGGCTGCTGG-3'。反應(yīng)體系:5 μL 10 ×Taq-Plus buffer，4 μL dNTPs(2 mmol·L-1)，10 μmol·L-1上、下游引物各1 μL，DNA 模板約20 ng，2 U Taq-Plus DNA polymerase，無菌超純水補(bǔ)足50 μL。以無菌超純水作為陰性對照。反應(yīng)條件:94℃3 min;94℃ 1 min，60℃ 1 min，72℃ 2 min，35個循環(huán);72℃ 10 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%(w/v)瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.4.3 DGGE分析 丙烯酰胺凝膠濃度為8%，變性劑梯度為40% ～60%［100%變性劑中包含7 mol·L-1尿素和40%(v/v)去離子甲酰胺］。將凝膠板制做好后，組裝放入1×TAE緩沖液中，60℃恒溫、90 V恒壓下電泳18 h(INGENY phorU-2 system)。待電泳結(jié)束后，SYBR Gold避光染色20 min，在 Kodak Gel Logic 2200成像系統(tǒng)下拍照。

1.5 數(shù)據(jù)處理

采用Microsoft Excel 2003進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析與做圖，對不同土壤處理采用SPSS 13.0中的隨機(jī)單位組設(shè)計的兩因素?zé)o重復(fù)觀察值方差分析進(jìn)行比較。通過Quantity One軟件(Bio-Rad)對DGGE圖譜中條帶的位置和亮度進(jìn)行數(shù)字化處理，并采用Shannon-Wiener多樣性指數(shù)(H′)、均勻度(J′)和豐富度(S)來評價土壤樣品的細(xì)菌群落多樣性(李剛等，2011)。

其中，Pi為第i條帶灰度占樣品總灰度的比率;S為DGGE圖譜泳道中的條帶數(shù)，也稱為豐富度。

2 結(jié)果與分析

2.1 秸稈降解對可培養(yǎng)細(xì)菌數(shù)量的影響

秸稈降解過程中，不同處理土壤可培養(yǎng)細(xì)菌數(shù)量的變化趨勢見圖1。0～20 d，4種處理的可培養(yǎng)細(xì)菌數(shù)量均呈上升趨勢。20～40 d，S-Z1、S-Z8和S呈下降趨勢;而S-CK呈上升趨勢。40～90 d，S和S-Z1的變化趨勢一致，均為略下降后再上升;而S-Z8和S-CK的變化則完全相反，前者為先上升后下降，后者為先下降后上升。在整個降解過程中，S的可培養(yǎng)細(xì)菌數(shù)量均最低，且顯著低于轉(zhuǎn)基因和非轉(zhuǎn)基因處理(P＜0.05)。雖然轉(zhuǎn)基因和非轉(zhuǎn)基因處理的變化趨勢有所差別，但是SPSS分析結(jié)果表明，兩者的土壤可培養(yǎng)細(xì)菌數(shù)量無顯著差異(P＞0.05)。

2.2 秸稈降解對細(xì)菌總數(shù)的影響

秸稈降解過程中，不同處理土壤細(xì)菌總數(shù)的變化趨勢見圖2。4種處理均表現(xiàn)相似的變化趨勢:0～30 d，緩慢上升;30～40 d，急劇上升，到第40天時達(dá)到最大值;40～90 d，急劇下降。在整個降解過程中，空白對照的細(xì)菌總數(shù)與轉(zhuǎn)基因和非轉(zhuǎn)基因處理之間差異顯著 (P＜0.05)，而轉(zhuǎn)基因與非轉(zhuǎn)基因處理土壤細(xì)菌總數(shù)之間差異不顯著(P＞0.05)。

2.3 不同處理土壤細(xì)菌群落多樣性

對細(xì)菌16S rRNA擴(kuò)增產(chǎn)物的DGGE指紋圖譜分析(圖3)表明，不同處理土壤間有很強(qiáng)的相似性，大多數(shù)為共有條帶，且在轉(zhuǎn)基因和非轉(zhuǎn)基因處理之間未發(fā)現(xiàn)特異性條帶。從表1可以看出，不同溫育時間下，4種處理土壤細(xì)菌群落的豐富度沒有顯著差異;在秸稈降解的整個時期，多樣性指數(shù)和均勻度在4種處理間均無顯著差異，但在不同降解時間有所差別，其中，黑暗培養(yǎng)0 d的多樣性指數(shù)相對最高，黑暗培養(yǎng)40 d的多樣性指數(shù)次之。

圖3 不同處理土壤細(xì)菌的PCR-DGGE指紋圖譜Fig.3 DGGE fingerprinting of bacteria in different soil treatments

表1 不同處理土壤細(xì)菌群落的豐富度、多樣性指數(shù)和均勻度Table 1 Abundance，Shannon-Wiener index and evenness of bacterial community in different treatments

3 討論

目前，關(guān)于轉(zhuǎn)基因水稻對土壤微生物數(shù)量及多樣性的影響還存在爭議。有研究認(rèn)為，轉(zhuǎn)基因水稻對土壤微生物沒有顯著影響(宋亞娜等，2012;Liu et al.，2008;Lu et al.，2010b、2010c);也有研究認(rèn)為，轉(zhuǎn)基因水稻對土壤微生物存在一定的影響(王洪興等，2004;Lu et al.，2010a;Wu et al.，2004a、2004b)。本研究結(jié)果與前一種觀點(diǎn)一致，認(rèn)為抗真菌轉(zhuǎn)基因水稻秸稈降解對土壤細(xì)菌數(shù)量的影響不顯著(P＞0.05)，且轉(zhuǎn)基因土壤樣品與非轉(zhuǎn)基因土壤樣品之間的多樣性指數(shù)、均勻度和豐富度均無顯著差異(P＞0.05)。

本試驗(yàn)不僅采用傳統(tǒng)的平板計數(shù)法測定了土壤中可培養(yǎng)細(xì)菌的數(shù)量，而且利用表面熒光顯微鏡直接計數(shù)法(epifluorescence direct counting method，F(xiàn)DC)測定了土壤中的細(xì)菌總數(shù)，比較全面地分析了抗真菌轉(zhuǎn)基因水稻秸稈降解過程中細(xì)菌數(shù)量的變化情況。對于轉(zhuǎn)基因水稻土壤細(xì)菌數(shù)量的分析，研究人員一般只測定可培養(yǎng)細(xì)菌數(shù)(李本金等，2006;王洪興等，2004)。本研究對土壤樣品進(jìn)行前處理時，先通過振蕩培養(yǎng)獲得土壤細(xì)菌懸浮液，再通過微孔濾膜過濾去除殘留的大部分土壤顆粒，從而在熒光顯微鏡下計數(shù)時能比較清楚地計算細(xì)菌總數(shù)。由于FDC操作過程比較費(fèi)時，且成本高，本試驗(yàn)在計算細(xì)菌總數(shù)時，把每次取樣時的3個重復(fù)樣品等量混合成一個樣品來制備土壤細(xì)菌懸浮液，然后計數(shù)至少400個細(xì)菌細(xì)胞以得到較為精確的結(jié)果。此外，由于DGGE圖譜條帶復(fù)雜，DGGE與克隆測序相結(jié)合的方法常被用來分析不同處理間微生物菌群的變化。本研究也利用PCR-DGGE技術(shù)分析了不同處理土壤細(xì)菌多樣性的變化情況。筆者還將進(jìn)一步通過克隆測序分析來明確轉(zhuǎn)基因水稻秸稈降解過程中存在的主要細(xì)菌類群。

轉(zhuǎn)基因水稻的種植以及秸稈還田對土壤生態(tài)系統(tǒng)的影響是一個長期的過程，其潛在的生態(tài)風(fēng)險可能要在相當(dāng)長的時期內(nèi)才能表現(xiàn)出來。因此，有必要對抗真菌轉(zhuǎn)基因水稻做長期的跟蹤監(jiān)測研究，同時應(yīng)結(jié)合其他非生物因素(如土壤類型、氣候因子、生長時期等)對其環(huán)境安全性進(jìn)行全面、客觀的評價。

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