曲桂燕, 劉 旭, 汪東風(fēng), 袁 毅, 韓麗君

(1. 中國海洋大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院, 山東 青島266003; 2. 中國科學(xué)院 海洋研究所, 山東 青島266071;3. 安徽農(nóng)業(yè)大學(xué) 茶與食品科技學(xué)院, 安徽 合肥 230036)

巖藻聚糖硫酸酯(fucoidan), 又名巖藻多糖或褐藻糖膠, 是一種水溶性的硫酸雜多糖, 普遍存在于褐藻和一些棘皮動物中。研究發(fā)現(xiàn)巖藻聚糖硫酸酯具有抗凝血[1]、抗氧化[2]、抗腫瘤[3-4]、抗病毒[5-7]等多種生物學(xué)活性, 并且隨著其應(yīng)用價值的不斷提升,需求量也在增加。因此如何提高巖藻聚糖硫酸酯中主要成分的提取率是對其進(jìn)行產(chǎn)業(yè)化利用的關(guān)鍵。

巖藻聚糖硫酸酯的主要成分除了L-巖藻糖和硫酸根外, 還含有半乳糖、木糖、甘露糖、葡萄糖、糖醛酸、蛋白質(zhì)等, 越來越多的研究表明, 其活性與硫酸根含量和位置[2,5]密切相關(guān)。不同的提取方法、提取工藝條件對巖藻聚糖硫酸酯得率有很大影響, 而且對其多糖含量與硫酸根含量的影響不同。雖然劉紅英等[8]和李兆新等[9]對巖藻聚糖硫酸酯的含量測定進(jìn)行了一些探討, 但由于其組成復(fù)雜還沒有標(biāo)準(zhǔn)方法。因此在提取純化過程中, 評價指標(biāo)也各不相同,大部分用粗多糖質(zhì)量[10-18]、粗多糖中多糖含量[19-22]來表示。其他的評價方法有: 根據(jù)劉紅英的方法測定巖藻多糖的含量[23-24]; 根據(jù)多糖和硫酸根的總質(zhì)量分?jǐn)?shù)[25]來評價; 對多個單獨指標(biāo)[23-24,26-31]進(jìn)行綜合考慮。為了得到合理的優(yōu)化結(jié)果, 需要恰當(dāng)?shù)脑u價指標(biāo), 但很少有人關(guān)心評價指標(biāo)對因素選擇的影響。

由于巖藻多糖主要由巖藻糖和硫酸根組成, 這兩者的成分含量對巖藻多糖的活性起很重要的作用,本文以粗多糖提取率(%)、巖藻糖提取率(%)和硫酸根提取率(%)的加權(quán)評分為指標(biāo)通過均勻設(shè)計試驗來優(yōu)化提取工藝并系統(tǒng)分析各實驗因素對不同指標(biāo)的影響, 從而有目的地指導(dǎo)生產(chǎn)。

1 材料與方法

1.1 材料和儀器

1.1.1 試驗材料與試劑

海帶由山東日照潔晶集團(tuán)提供, 于2011年8月在山東榮成采集。將海帶洗凈、40℃烘干、磨碎、過100目篩后, 貯存于密閉玻璃瓶中備用。

95%乙醇; K2SO4、BaCl2、明膠、濃鹽酸;L-半胱氨酸鹽酸鹽、濃硫酸以上試劑均為國產(chǎn)分析純。標(biāo)準(zhǔn)品:L-巖藻糖(Fuc)(Sigma)。

1.1.2 儀器

ADVENTURERTM系列電子天平, 奧豪斯儀器(上海)有限公司; DF-101集熱式恒溫加熱磁力攪拌器, 鄭州長城科工貿(mào)有限公司; SC-3610低速離心機(jī),安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司; RE-2000旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器, 上海亞榮生化儀器廠; LGJ-12冷凍干燥機(jī), 北京松源華興科技發(fā)展有限公司; UV-2000型分光光度計,尤尼柯(上海)儀器有限公司; 數(shù)顯恒溫水浴鍋 HH-4國華電器有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 提取工藝流程

干海帶經(jīng)熱水浸提后, 再經(jīng)離心、濃縮、醇析、冷凍干燥, 得到巖藻聚糖硫酸酯粗品, 稱重后計算得率, 并測定巖藻糖和硫酸根含量。其工藝流程如圖1所示。

圖1 海帶巖藻聚糖硫酸酯提取工藝流程圖Fig. 1 The flow chart of hot water extracting process of fucoidan from Laminaria japonica

Yw: 粗多糖提取率(%)=粗多糖的質(zhì)量/藻粉的質(zhì)量×100%

Yf: 巖藻糖提取率(%)=(粗多糖的質(zhì)量×巖藻糖的百分含量)/藻粉的質(zhì)量×100%

Ys: 硫酸根提取率(%)=(粗多糖的質(zhì)量×硫酸根的百分含量)/藻粉的質(zhì)量×100%

1.2.2 測定方法

巖藻糖含量測定[32]: 采用 Gibbons比色法測定多糖中L-巖藻糖含量。得回歸方程:y=0.0009x-0.0015,R2=0.9934。

硫酸根含量測定[33]: 采用 Dodgson比濁法測定多糖中硫酸根含量。得回歸方程:y=2.6999x+0.0062;R2=0.9969。

1.2.3 提取試驗設(shè)計

在前期預(yù)實驗和參考文獻(xiàn)[11,13,15,17,21,25]的基礎(chǔ)上, 選擇影響提取效果的 3個主要因素: 浸提溫度(X1)、浸提時間(X2)、液料比(X3)進(jìn)行考察, 并以粗多糖提取率(Yw)、巖藻糖提取率(Yf)和硫酸根提取率(Ys)為評價指標(biāo)。

各因素分別選擇6個水平, 因素水平見表1。根據(jù)表1 的因素及水平, 選用均勻設(shè)計表U12* (123),并通過擬水平法適當(dāng)改造, 依據(jù)規(guī)定[34-35]使用, 其均勻性D=0.183 8。

1.2.4 數(shù)據(jù)處理

采用 Minitab軟件對實驗數(shù)據(jù)進(jìn)行逐步回歸分析, 篩選顯著變量, 建立回歸方程, 并通過回歸方程進(jìn)行規(guī)劃求解, 從而得到優(yōu)化的海帶巖藻多糖提取條件。

2 結(jié)果與討論

2.1 試驗方案及分析結(jié)果

表1 因素水平表Tab. 1 The factor-level list for uniform design

采用水提法從海帶中提取巖藻聚糖硫酸酯, 以粗多糖提取率(Yw)、巖藻糖提取率(Yf)和硫酸根提取率(Ys)為評價指標(biāo)指標(biāo), 并采用綜合加權(quán)評分法綜合考慮各試驗因素對以上三個指標(biāo)的影響。綜合加權(quán)評分法是在多指標(biāo)的優(yōu)化試驗中, 根據(jù)每個指標(biāo)優(yōu)選的條件可能會相互矛盾, 對某一指標(biāo)的有利的條件可能對其他指標(biāo)不利, 因此試驗中引入一個綜合指標(biāo), 來考察指標(biāo)的綜合效果。根據(jù)各指標(biāo)的重要性,將粗多糖提取率( %)、巖藻糖提取率(%)、硫酸根提取率(%)的權(quán)重系數(shù)分別設(shè)定為0. 1, 0. 45,0. 45。為在統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)下加權(quán)評分, 分別將最好的試驗結(jié)果定為100, 其他試驗結(jié)果采用適宜的公式酌情記分。根據(jù)選定的均勻設(shè)計表, 在各組條件下進(jìn)行實驗, 結(jié)果見表2。

2.2 各實驗因素對單個評價指標(biāo) Yw、Yf和Ys的影響

2.2.1 優(yōu)化數(shù)學(xué)模型的建立

利用Minitab 16統(tǒng)計軟件分別對粗多糖提取率(Yw)、巖藻糖提取率(Yf)和硫酸根提取率(Ys)進(jìn)行回歸分析, 采用二次型回歸模型, 自變量X1,X2,X3采用中心化處理[35], 并采用逐步回歸的方法篩選變量,得到回歸方程及其顯著性檢驗如表3所示。

表2 熱水提取巖藻聚糖硫酸酯均勻設(shè)計試驗方案及分析結(jié)果Tab. 2 Conditions and analysis results of hot water extracting process of fucoidan from Laminaria japonica by uniform design

表3 Yw、Yf和Ys的回歸方程及其顯著性檢驗Tab. 3 Results and significance tests of quadratic polynomial stepwise regression of significance tests of Yw、Yf and Ys

在上述模型中P值都小于 0.05, 說明回歸方程在α=0.05水平上顯著, 模型方程具有統(tǒng)計學(xué)意義,整體擬合效果不錯。但模型Yw的顯著性P=0.029比模型Yf和Ys要小, 同時模型Yw的復(fù)相關(guān)系數(shù)r=0.811, 決定系數(shù)R2=0.658, 說明模型方程預(yù)測精度較低。由于本實驗沒有進(jìn)一步純化, 存在褐藻膠的干擾, 所以單純以沉淀物干重計算得率會有很大偏差。而以巖藻糖和硫酸根含量計算提取率得到的回歸模型擬合較好, 說明評價指標(biāo)對優(yōu)化工藝上有很大影響。

2.2.2 因素效應(yīng)分析

通過t檢驗得到各相關(guān)系數(shù)的顯著性檢驗結(jié)果如表 4所示。從表中可以看出各實驗因素對評價指標(biāo)的影響大小。

從表4中可以看出各試驗因素對Yw的影響大小為X1>X3>X1X2, 其中X1提取溫度對粗多糖得率影響最顯著, 其次是X3液料比, 而X2提取時間影響效果不顯著, 且與溫度的交互作用對其有負(fù)面影響; 對Yf的影響大小為X12>X2X3>X1, 其中X12提取溫度的二次項對巖藻糖提取率的影響最顯著, 其次是X2X3的交互作用, 而X2、X3單獨影響效果不顯著; 對Ys的影響大小為X1>X32>X1X2>X22>X3, 其中X1提取溫度對硫酸根得率的影響最顯著, 其次是X3液料比的二次項, 而X2提取時間影響效果不顯著。

表4 Yw、Yf和Ys偏回歸系數(shù)的顯著性檢驗Tab. 4 Significance tests of regression coefficients obtained by the quadratic polynomial regression models of Yw, Yf and Ys

經(jīng)上述分析發(fā)現(xiàn), 提取溫度(X1)對粗多糖提取率(%)、巖藻糖提取率(%)、硫酸根提取率(%)影響都最顯著, 液料比(X3)對粗多糖提取率(%)和硫酸根提取率(%)的影響都較顯著, 而提取時間(X2)影響效果不顯著, 且其交互作用都存在負(fù)面影響。因此各實驗因素對巖藻糖含量與硫酸根含量的影響不同, 需綜合考慮。

2.3 各實驗因素對加權(quán)評分的影響

2.3.1 優(yōu)化數(shù)學(xué)模型的建立

按2.2.1對加權(quán)值Y進(jìn)行回歸分析, 得到回歸方程:Y= 65.2 + 0.555x1+ 1.73x2+ 0.587x3+ 0.0236x12+0.0939x32-0.110x1x2;其 中x1=X1-75.0,x2=X2-3.5,x3=X3-22.5。

模型的復(fù)相關(guān)系數(shù)R=0.944;F=6.85,p=0.026<0.05, 說明回歸方程在α=0.05水平上顯著,模型方程具有統(tǒng)計學(xué)意義, 整體擬合效果不錯。模型的決定系數(shù)R2=0.892, 調(diào)整決定系數(shù)R2=0.762, 說明模型方程具有較高的預(yù)測精度。并且通過加權(quán)值Y得到的回歸方程與通過Yw、Yf和Ys得到的回歸方程相比其預(yù)測精度有了很大的提高, 因此, 該模型預(yù)測熱水浸提巖藻多糖的工藝參數(shù)是可行的。

2.3.2 因素效應(yīng)分析

通過 t檢驗得到各相關(guān)系數(shù)的顯著性檢驗結(jié)果如表5所示。從表5中可以看出對加權(quán)值Y的影響大小為X1>X32>X12>X3>X1X2>X2, 其中X1提取溫度對總提取率的影響最顯著, 其次是X3液料比的二次項, 而X2提取時間的單獨影響效果不顯著。

表5 加權(quán)值Y偏回歸系數(shù)的顯著性檢驗Tab. 5 Significance tests of regression coefficients obtained by the quadratic polynomial regression model of Y

2.4 工藝條件參數(shù)優(yōu)化

根據(jù)加權(quán)評分Y得到的回歸方程進(jìn)行規(guī)劃求解,并結(jié)合上述分析, 得到巖藻聚糖硫酸酯最佳提取條件為x1=25,x2=-2.5, x3=12.5(X1=100,X2=1,X3=35),即提取溫度100℃, 提取時間1h, 液料比35(mL:g)。

2.5 驗證試驗

按優(yōu)化后的條件進(jìn)行優(yōu)化工藝驗證試驗, 巖藻聚糖硫酸酯粗多糖得率可達(dá) 6.50%, 其中巖藻糖提取率為2.65%, 硫酸根提取率為1.36%。驗證試驗加權(quán)評分Y實測值為112.01, 比均勻?qū)嶒炛械?2 組實驗結(jié)果都高, 與回歸模型的預(yù)測值 118.38相對誤差為0.0539。由此表明試驗中所設(shè)模型是合適的, 能夠為海帶巖藻聚糖硫酸酯提取工藝提供理論指導(dǎo)。

3 結(jié)論

采用均勻設(shè)計法優(yōu)化海帶巖藻聚糖硫酸酯提取工藝, 首次將粗多糖提取率(Yw)、巖藻糖提取率(Yf)和硫酸根提取率(Ys)同時作為評價指標(biāo), 綜合考慮各試驗因素對以上三個指標(biāo)的影響。結(jié)果表明:

(1)通過加權(quán)值Y得到的回歸方程與通過Yw、Yf和Ys得到的回歸方程相比具有較高精度和顯著性。

(2)利用加權(quán)值Y得到的回歸模型進(jìn)行規(guī)劃求解,得到優(yōu)化提取工藝參數(shù)為提取溫度100℃, 提取時間1 h, 液料比35(mL:g)。

(3)利用回歸模型對實驗結(jié)果進(jìn)行預(yù)測, 其相對誤差為5.39%。并且?guī)r藻聚糖硫酸酯粗多糖得率可達(dá)6.50%, 其中巖藻糖提取率為 2.65%, 硫酸根提取率為1.36%。

因此, 本文探討和建立的海帶中巖藻聚糖硫酸酯提取工藝評價模型, 通過加權(quán)評分作為評價指標(biāo)可綜合考慮海帶巖藻聚糖硫酸酯的產(chǎn)量和其主要成分含量, 對巖藻聚糖硫酸酯的工業(yè)提取提供了理論參考。

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