賈哲宇,劉巖,黃鈺迪,鄭揚,王慧蕊,任丹丹,2,3,4*,何云海,2,3,4,汪秋寬,2,3,4

1(大連海洋大學 食品科學與工程學院,遼寧 大連,116023) 2(遼寧省水產(chǎn)品加工及綜合利用重點實驗室,遼寧 大連,116023)3(國家海藻加工技術(shù)研發(fā)分中心,遼寧 大連,116023) 4(海洋食品精深加工關(guān)鍵技術(shù)省部共建協(xié)同創(chuàng)新中心,大連工業(yè)大學,遼寧 大連,116034)

巖藻聚糖硫酸酯主要來源于褐藻、棘皮動物和單殼軟體動物[1],是一種富含硫酸基的雜多糖[2],主要由巖藻糖、半乳糖、木糖和葡萄糖等單糖組成[3]。它具有良好的抗病毒、抗氧化、抗凝血、抗腫瘤、抗炎[4-8]等生物活性。然而,巖藻聚糖硫酸酯因其分子質(zhì)量大、結(jié)構(gòu)復雜、黏度大等特點,影響了其生物利用率和溶解性[9]。目前,通過降解巖藻聚糖硫酸酯制備低分子質(zhì)量的巖藻寡糖已成為研究熱點。

巖藻聚糖硫酸酯的降解方法有很多種,主要分為化學法、物理法和生物酶法[10]。其中的生物酶降解法反應(yīng)條件較溫和,不會造成活性基團的丟失且降解產(chǎn)物分子質(zhì)量易控制,是一種具有獨特優(yōu)勢的降解方法。然而產(chǎn)巖藻聚糖硫酸酯酶的菌株大多來源于海洋,巖藻聚糖硫酸酯酶不易獲取,且酶活力普遍較低[11]。本文將從巖藻聚糖硫酸酯酶的分類及來源、性質(zhì)及酶解產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)與活性等方面對巖藻聚糖硫酸酯酶進行綜述,以期為巖藻聚糖硫酸酯酶的應(yīng)用提供理論參考。

1 巖藻聚糖硫酸酯酶的分類及來源

1.1 巖藻聚糖硫酸酯酶的分類

催化巖藻聚糖硫酸酯殘基之間糖苷鍵斷裂的酶被稱為巖藻聚糖硫酸酯酶。這些酶屬于糖苷酶(酶代碼EC 3.2.1)。巖藻聚糖硫酸酯降解酶主要有3種分別為α-L-巖藻糖苷酶(Fucosidase,EC 3.2.1.51)、巖藻多糖酶(Fucoidanase,EC 3.2.1.44)和硫酸酯酶(Sulfatase,EC 3.1.6)。它們能將多糖內(nèi)部或者邊緣的糖苷鍵裂解而達到降解巖藻多糖的目的,α-L-巖藻糖苷酶和巖藻多糖酶為構(gòu)型保持酶,通過雙置換催化機制來催化反應(yīng)。而硫酸酯酶的催化機制為酯交換機制,在親核攻擊中使硫酸基團從初始底物中釋放出來。根據(jù)作用機理可以將它們分為內(nèi)切酶和外切酶,其中α-L-巖藻糖苷酶屬于外切酶,其作用方式為從巖藻聚糖硫酸酯的非還原端水解巖藻糖苷鍵,多使巖藻糖和半乳糖之間的α-1→2-糖苷鍵斷裂來完成水解作用,酶解產(chǎn)物為單糖[12]。巖藻多糖酶和硫酸酯酶屬于內(nèi)切酶,巖藻多糖酶能從中間或末端切開糖鏈,多作用于α-1→4-糖苷鍵,而硫酸酯酶主要作用于巖藻聚糖硫酸酯的α-1→3-和α-1→4-連接的巖藻糖殘基,使其發(fā)生區(qū)域選擇性脫硫?qū)е露嗵堑牧呀鈁13]。VANVLIET等[14]研究發(fā)現(xiàn)普朗克菌-疣微菌-衣原體(PVC)門的各種海洋細菌具有大量與硫酸化多糖降解相關(guān)的硫酸酯酶基因,從其分離出的菌株F1,F2是富含硫酸酯酶的厭氧菌。DESCAMPS等[15]從海洋微生物中出分離出α-L-巖藻糖苷酶,經(jīng)過一段時間的培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)該酶有一定的巖藻多糖降解能力。

1.2 巖藻聚糖硫酸酯酶的來源

1.2.1 來源于軟體動物

一部分巖藻聚糖硫酸酯酶來源于海洋棘皮動物與單殼軟體動物,如海參、海膽、鮑魚等,多從它們的內(nèi)臟中分離。THANASSI等[16]從鮑魚肝胰腺中純化出一種α-L-巖藻糖苷酶,這種酶能降解巖藻聚糖硫酸酯,雖然這種酶的活性較低,但酶解后的巖藻聚糖寡糖不會出現(xiàn)硫酸基團脫離的現(xiàn)象。TANAKA等[17]從單殼貝類中分離出一種酶,該酶為α-L-巖藻糖苷酶,可降解巖藻聚糖硫酸酯。從海洋軟體動物中可純化出巖藻聚糖硫酸酯降解酶,其原因可能是這些軟體動物長期食用含有巖藻聚糖硫酸酯的藻類。但從軟體動物中得到的巖藻聚糖硫酸酯酶往往活性較低,無法實現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用。

1.2.2 微生物來源

與海洋動物相比,海洋性微生物是巖藻聚糖硫酸酯酶最主要的來源。SICHERT等[18]從海帶中篩選獲得了一株降解褐藻多糖硫酸酯的菌株RC2-3,它是一種革蘭氏陰性細菌,僅在海水培養(yǎng)基上生長,其最大降解率為54%,用16S RNA基因部分序列的系統(tǒng)分析表明RC2-3菌株屬于黃桿菌科(Flavobacteriaceae)。KIM等[19]從朝鮮海域的裙帶菜孢子葉分離純化出一株以巖藻聚糖硫酸酯為唯一碳源的海洋菌株,經(jīng)過16S rDNA序列分析發(fā)現(xiàn)該菌株為鞘氨醇單胞菌,用全細胞酶制劑實驗發(fā)現(xiàn)顯色底物并未對硝基苯基進行水解,表明該酶可能是具有內(nèi)切作用的巖藻多糖酶,而不是α-L-巖藻糖苷酶。KIM等[20]從海洋細菌鞘氨醇單胞菌PF-1中純化出一種內(nèi)切酶巖藻多糖酶,該酶可將從裙帶菜孢子葉中分離出的硫酸化半乳巖藻聚糖降解為較小分子質(zhì)量的半乳巖藻寡糖(1 000～4 000 Da),該酶的活性比粗酶高約112倍。OHSHIRO等[21]從褐藻岡村枝管藻中分離出一株以褐藻聚糖硫酸酯作為唯一碳源的細菌,經(jīng)鑒定該細菌屬于黃桿菌屬(Flavobacterium)F-31,該細菌能產(chǎn)生一種使巖藻聚糖硫酸酯降解和脫硫的胞內(nèi)酶：硫酸酯酶。IVANOVA等[22]從太平洋千島群島克拉特爾納亞灣采集的褐藻巖藻菌體中分離出11株革蘭氏陰性海洋細菌。通過16S rDNA分析發(fā)現(xiàn)該細菌屬于假交替單胞菌(Issachenkonii),該細菌中含有多種酶,其中的巖藻多糖酶可降解海藻多糖。

除此之外,一些真菌也具有降解巖藻聚糖硫酸酯的能力。張袁等[23]從我國廈門海域采集的樣品中篩選和復篩得到28株巖藻多糖酶產(chǎn)生菌,其中溫特曲霉菌(Aspergilluswentii)的產(chǎn)酶能力最強。該團隊還發(fā)現(xiàn)Fusariumsp.LD8和DendryphiellaarenariaTM94同樣含有巖藻聚糖硫酸酯酶[24-25],可降解巖藻聚糖硫酸酯。RODRGUZE-JASSO等[26]通過2種真菌(PSH 和Mucorsp.3P)的固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)生能降解巖藻聚糖硫酸酯的巖藻多糖酶,其中Mucorsp.3P菌株的產(chǎn)酶活性較高。

綜上所述,大部分的巖藻聚糖硫酸酯降解酶屬于黃桿菌科,還有一部分屬于變形菌屬及一些單細胞細菌、真菌。巖藻聚糖硫酸酯酶的來源稀少,該酶在市場上價格昂貴,尋找能產(chǎn)生高效巖藻聚糖硫酸酯酶的微生物對巖藻聚糖硫酸酯酶的應(yīng)用與發(fā)展至關(guān)重要。

表1 巖藻聚糖硫酸酯酶的來源Table 1 Resources of fucoidan degrading enzyme

2 碳源、氮源、NaCl、金屬離子等對菌株產(chǎn)酶活性的影響

在產(chǎn)酶菌株培養(yǎng)過程中,碳源、氮源、NaCl和金屬離子等因素會影響菌株的產(chǎn)酶能力從而影響酶的活性。SILCHENKO等[27]研究發(fā)現(xiàn),Zn2+,Cu2+對巖藻聚糖硫酸酯酶活力有抑制作用,Ca2+對酶活力有促進作用。

霍利華[32]選擇5種不同氮源發(fā)酵產(chǎn)酶,研究發(fā)現(xiàn)以硫酸銨為唯一氮源的菌株產(chǎn)生的巖藻聚糖硫酸酯酶活力為100%,高于蛋白胨89.5%。以不同濃度的巖藻聚糖硫酸酯為唯一碳源,研究發(fā)現(xiàn)溶液濃度越高,酶活性越強。同時,NaCl的濃度為2.5%左右時巖藻聚糖硫酸酯酶活性最強,其原因可能是海洋產(chǎn)酶菌的生長發(fā)酵的鹽濃度在2.5%左右。且Mg2+對酶活力促進作用明顯,Hg2+對酶活力抑制作用明顯,Cu2+、Ca2+對酶活力抑制作用不明顯。王瑩[12]從昆布中篩選出能產(chǎn)生巖藻聚糖硫酸酯酶的菌株RC2,發(fā)現(xiàn)巖藻聚糖硫酸酯為該菌株的最佳碳源,最佳氮源為蛋白胨和牛肉膏,且氮源濃度為0.4%時酶活性最強;NaCl的濃度對巖藻聚糖硫酸酯酶活性有很大的影響,反應(yīng)體系中無NaCl時酶活性幾乎為零;金屬離子同樣對酶活性有一定的影響,Zn2+,K+,Ca2+對酶活力有促進作用,Cu2+對酶活力抑制作用明顯。張袁等[23]從廈門海域的海水,海沙,藻類中分離得到降解巖藻聚糖硫酸酯的真菌菌株溫特曲酶菌,該酶的最佳氮源為(NH4)2SO4。

目前研究中,通常采用巖藻聚糖硫酸酯作為唯一碳源來篩選含有巖藻聚糖硫酸酯降解酶的微生物,其濃度會對酶活力產(chǎn)生影響;其最佳氮源一般為蛋白胨、硫酸銨;培養(yǎng)條件中的NaCl對巖藻聚糖硫酸酯酶的活性影響較大。Cu2+一般對酶活力抑制作用明顯,其他金屬離子如Zn2+,K+,Ca2+等對不同巖藻聚糖硫酸酯酶活力的影響有所不同,可能是菌株的生長環(huán)境及生長特性不同所導致的。

3 巖藻聚糖硫酸酯酶的酶學性質(zhì)

3.1 巖藻聚糖硫酸酯酶活性的測定方法

巖藻聚糖硫酸酯酶酶活性的測定方法并未統(tǒng)一,目前多用還原糖含量的測定間接測定酶的活性。DNS法和Nelson法是測定巖藻聚糖硫酸酯酶活性的常用方法。它們都是根據(jù)還原糖含量的變化來反映酶的活性,其中DNS法為常量測定方法,Nelson法為微量測定方法。DNS法更為簡單方便,而Nelson法穩(wěn)定性更佳。DNS法的原理為還原糖與DNS的氧化還原反應(yīng),生成棕紅色的C7H6N2O5,用比色法或吸光光度法測定糖的含量,最后用糖含量間接反映酶的活性,這種方法操作簡單,測定巖藻聚糖硫酸酯酶的活性穩(wěn)定性較好。SHUANG等[30]通過固態(tài)發(fā)酵法酵解菌株Fusariumsp.(LD8),該菌株能產(chǎn)生巖藻聚糖硫酸酯酶,并用DNS法測定酶的活性。將由1 mL底物溶液和0.1 mL酶溶液組成的混合物在50 ℃培養(yǎng)10 min,使用滅活的酶溶液作為空白,做標準曲線,以還原糖濃度表示酶的活性。王春霞[33]用DNS法測定巖藻聚糖硫酸酯酶的活性,并繪制DNS曲線,根據(jù)還原糖的量來表示酶的活性。

Nelson法的基本原理是還原糖的羰基,其本身易被氧化,且蔗糖酶可將蔗糖水解為葡萄糖和果糖。它是一種用銅試劑和砷酸鹽試劑測定葡萄糖(或還原當量)的光度方法,顯色的光密度(510 nm)與攝取的葡萄糖成正比,并能在長時間內(nèi)保持穩(wěn)定,從而確定蔗糖酶的活力。SILCHENKO等[27]從海洋軟體動物Lambissp中純化出巖藻聚糖硫酸酯酶,并用尼爾森法測定其活性。王瑩等[34]從海水中篩選出l株高產(chǎn)菌株MD3,用Nelson法以每小時產(chǎn)生1 μmol/L的巖藻糖所需的酶量來表示巖藻聚糖硫酸酯酶的活性。

除此之外還有一些其他測定方法。張翠玉等[35]發(fā)現(xiàn)了測定巖藻聚糖硫酸酯酶活性的PHBH法,該方法為將PHBH溶液加入稀釋后的酶溶液中,迅速冷卻后測定吸光度。最后根據(jù)單位時間內(nèi)產(chǎn)糖量計算酶的活性。該方法靈敏度及精密度優(yōu)于DNS法,且操作簡單,此方法是酶活性的測定的微量方法。DECAMPS等[15]將巖藻聚糖硫酸酯在20 mmol/L Tris-HCl緩沖液(pH 7.5)中與酶在室溫下培養(yǎng),將樣品與含有蔗糖的緩沖溶液混合,用碳水化合物-聚丙烯酰胺凝膠電泳(carbohydrate-polyacrylamide gel electrophoresis,C-PAGE)法進行分析,通過在流動凝膠中出現(xiàn)的陰離子寡糖來檢測巖藻聚糖硫酸酯酶的活性。

3.2 巖藻聚糖硫酸酯酶的最適pH值與溫度

不同來源的巖藻聚糖硫酸酯酶的酶學特性不同,其最適pH及溫度亦存在不同。

一部分巖藻聚糖硫酸酯酶為酸性酶。THANASSI等[16]從鮑魚肝胰腺中純化出的α-L-巖藻糖苷酶在pH 值為6.1時活性最強,其最佳溫度約為38 ℃。KUSAYKIN等[29]從海洋軟體動物濱螺中純化巖藻多糖酶,巖藻聚糖硫酸酯酶的最適pH值為5.4,最適溫度在35 ℃左右。姜琪等[36]用巖藻聚糖硫酸酯酶降解馬尾藻巖藻聚糖的最適pH值為6,最適反應(yīng)溫度為50 ℃。

另一部分巖藻聚糖硫酸酯酶為中性或堿性酶。王春霞[33]從海參中篩選分離出一種能降解巖藻聚糖硫酸酯的海洋細菌,將其命名為HDj3。該巖藻聚糖硫酸酯酶的最適pH為7.5,最適溫度為25 ℃。常耀光[28]用黃桿菌科細菌CZ1127篩選出的巖藻聚糖硫酸酯酶對海參巖藻聚糖硫酸酯進行降解處理,該酶的最適pH值為7,最適溫度為28 ℃。這與王春霞的結(jié)論相似。SILCHENKO等[37]研究發(fā)現(xiàn)來自海洋細菌福爾摩沙藻類KMM 3553T的墨角藻聚糖酶在pH值6.5～9.1的范圍內(nèi)顯示最大活性,最適溫度為45 ℃。

表2 巖藻聚糖硫酸酯酶的最適pH與溫度Table 2 Optimal pH and temperature of fucoidan degrading enzyme

4 巖藻聚糖硫酸酯酶的基因鑒定及外源基因的表達

巖藻聚糖硫酸酯酶是目前巖藻聚糖降解研究的熱點。目前已有多種巖藻聚糖硫酸酯酶的基因序列被測定。截止到2020年7月,CAZy數(shù)據(jù)庫包含來自海洋細菌的巖藻聚糖硫酸酯酶的大約17個氨基酸序列的信息,其中4個存在于海洋細菌WenyingzhuangiafucanilyticaCZ1127T中。近幾年,隨著基因組學的不斷完善,新的能降解巖藻聚糖硫酸酯的酶被發(fā)現(xiàn)并被測序。TAKAYAMA等[38]從海洋細菌Alteromonassp.發(fā)現(xiàn)2種巖藻多糖酶,經(jīng)過基因測序?qū)⑵浞Q為Fda1和Fda2。SAKAI等[31]從海洋細菌Fucobacter中發(fā)現(xiàn)胞外硫酸化巖藻聚糖甘露聚糖裂解酶FdlA和FdlB,作用于來自厚葉海帶巖藻聚糖硫酸化甘露聚糖。通過序列分析,發(fā)現(xiàn)這種裂解酶活性顯然由2個獨立的編碼區(qū)編碼,有56%的氨基酸序列同一性。

為了解決海洋細菌產(chǎn)酶活力低,攜帶毒性因子等問題,人們將巖藻聚糖硫酸酯降解酶在大腸桿菌菌株中進行外源基因的表達,從而為巖藻聚糖硫酸酯酶的工業(yè)化生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。COLIN等[39]從海洋細菌Mariniflexile巖藻聚糖酶SW5T中克隆了編碼巖藻多糖酶的基因,并在大腸桿菌中產(chǎn)生了其蛋白,獲得了重組酶FcnA。該酶被證明是內(nèi)α-L-1→4-巖藻聚糖酶,它是糖苷水解酶家族(GH107)的第一種酶。Fda1和Fda2和重組酶FcnA同屬GH107家族,Fda1和Fda2與FcnA的氨基酸序列相同性分別為24%和23%。SILCHENKO等[40]對來自海洋細菌Formosaalgae(KMM 3553T)的2種巖藻多糖酶FFA1和FFA2進行了鑒定,并在大腸桿菌中產(chǎn)生了該蛋白,序列分析顯示巖藻聚糖酶FFA1屬于GH107 家族。ZUEVA等[41]克隆了編碼2種巖藻聚糖酶fwf1和fwf2的基因,并在大腸桿菌細胞中產(chǎn)生了FWf1和FWf2蛋白,對其生化特性進行了研究,發(fā)現(xiàn)FWf1和FWf2的氨基酸序列分別與WenyingzhuangiafucanilyticaCZ1127T有41%和51%的同一性,具有已建立的三維結(jié)構(gòu)。

5 酶降解產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)

巖藻聚糖硫酸酯的結(jié)構(gòu)顯示出復雜性,通過巖藻聚糖硫酸酯酶降解能保持天然多糖的結(jié)構(gòu)特征,巖藻聚糖硫酸酯酶的結(jié)構(gòu)更易被人們了解。巖藻聚糖硫酸酯的結(jié)構(gòu)為α-(1→2),α-(1→3)或α-(1→4)連接構(gòu)成主鏈和較多的分支結(jié)構(gòu),主鏈通常被大量的硫酸鹽、乙酸鹽和各種單糖殘基取代,產(chǎn)生極其復雜的多相分子混合物。硫酸基團主要結(jié)合在C4位上,其他單糖在聚合物糖鏈上隨機連接。

巖藻多糖的化學組成和糖基連接方式多樣,其結(jié)構(gòu)復雜,而巖藻多糖降解酶可作用于特定的糖苷鍵,與紅外光譜、核磁共振、氣相質(zhì)譜聯(lián)用等方法聯(lián)合使用是推斷巖藻多糖結(jié)構(gòu)的有效手段。不同來源的巖藻聚糖硫酸酯及酶解產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)一般不同。YU等[42]用酶解法制備了低分子質(zhì)量梅花參巖藻聚糖硫酸酯,并用核磁共振進行了分析,發(fā)現(xiàn)該海參巖藻聚糖硫酸酯的基本結(jié)構(gòu)為重復的四巖藻糖單元,且保留了巖藻聚糖硫酸酯的結(jié)構(gòu)特征,結(jié)構(gòu)為：[→3-α-L-Fucp-1→3-α-L-Fucp2,4(OSO3-)-1 →3-α-L-Fucp-1→3-α-L-Fucp2(OSO3-)-1→]n。CHEN等[43]和LI等[44]經(jīng)降解得到的海參巖藻聚糖硫酸酯的基本結(jié)構(gòu)也為四糖單元,這與YU等[42]得到的結(jié)論一致。SAKAI等[45]用從海洋細菌中獲得的巖藻多糖酶降解褐藻巖藻聚糖硫酸酯,并通過核磁共振分析確定其結(jié)構(gòu),它的結(jié)構(gòu)為：[-3L-Fucpα1-3L-Fucp(4-O-sulfate)α1-3L-Fucp(4-O-sulfate)α1-3(D-GlcpUAα1-2)L-Fucpα1]n-3L-Fucpα1-3L-Fucp(4-O-sulfate)α1-3L-Fucp(4-O-sulfate)α1-3L-Fucp(n=0,1,2,or 3)。COLIN等[39]用新型巖藻多糖酶FcnA降解鹿角藻巖藻聚糖硫酸酯,得到的低分子質(zhì)量巖藻聚糖硫酸酯的基本結(jié)構(gòu)為重復的二糖單元:[3)-α-L-Fucp-(2OSO3-)-1→4-α-L-Fucp-(2,3OSO3-)-(1→]n。SILCHENKO等[40]鑒定、克隆了海洋細菌F.algae中編碼巖藻聚糖硫酸酯酶ffa1的基因,并在大腸桿菌中產(chǎn)生了蛋白(FFA1),重組巖藻聚糖酶FFA1用于降解馬尾藻巖藻聚糖硫酸酯。通過核磁共振譜確定了聚合度為4～10的5種硫酸化寡糖的結(jié)構(gòu),基本結(jié)構(gòu)為重復的三糖單元:[→3-α-L-Fucp(2SO3-)-1→4-α-L-Fucp(2,3SO3-)-1→3-α-L-Fucp(2,4SO3-)-1]n,具有(α-L-Fucp-1→2-α-L-Fucp-1→)結(jié)構(gòu)的側(cè)鏈結(jié)合在C4位上。CHEVOLOT等[46]研究發(fā)現(xiàn)泡葉藻巖藻聚糖硫酸酯寡糖的基本結(jié)構(gòu)為重復的二糖單元：[→3)-α-L-Fuc(2SO3-)-(1→4)-α-L-Fuc(2,3 diSO3-)-(1]n。

綜上所述,來源于棘皮動物的巖藻聚糖硫酸酯通常由重復的四糖單元組成,而來自于褐藻的巖藻聚糖硫酸酯多由重復的二或三糖單元組成。由于巖藻聚糖硫酸酯的結(jié)構(gòu)十分復雜,很難通過常規(guī)的分析手段來確定其精細的化學結(jié)構(gòu)。但使用巖藻聚糖硫酸酯酶降解后,通過降解得到的低分子質(zhì)量巖藻聚糖硫酸酯的結(jié)構(gòu)解析將有助于推測巖藻聚糖硫酸酯的結(jié)構(gòu)。

表3 巖藻聚糖硫酸酯及酶降解產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)Table 3 Structures offucoidan degrading enzyme and its degradation products

6 酶解產(chǎn)物的活性

研究發(fā)現(xiàn),經(jīng)酶解后得到的低分子質(zhì)量巖藻聚糖硫酸酯較未處理的巖藻聚糖硫酸酯具有更強的生物活性,如抗氧化活性、抗腫瘤活性、抗黑色素生成能力及增強免疫活性。HIFNEY等[47]用發(fā)酵真菌中獲得的巖藻聚糖硫酸酯酶對其進行處理,產(chǎn)生具有較低分子質(zhì)量結(jié)構(gòu)松散的巖藻聚糖硫酸酯寡糖,研究發(fā)現(xiàn)酶處理后的寡糖具有更優(yōu)異的抗氧化能力。RASIN等[48]用重組巖藻聚糖酶FFA1水解巖藻聚糖硫酸酯,其較高分子質(zhì)量部分用陰離子交換色譜法分級,得到3種不同分子質(zhì)量(63～138 kDa)的低分子質(zhì)量寡糖片段F1,F2,F3。研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)過酶處理后的F3組分對DLD-1細胞的集落形成表現(xiàn)出最有效的抗腫瘤和抗輻射作用。CHEN等[49]用從黃桿菌RC2-3純化的酶降解巖藻聚糖硫酸酯,發(fā)現(xiàn)經(jīng)酶處理后的分子質(zhì)量在5～10 kDa之間的巖藻聚糖組分在B16細胞中表現(xiàn)出最佳的酪氨酸酶抑制活性、抗氧化活性和優(yōu)異的抗黑素生成能力,可用作美白功能化妝品的開發(fā)。KUZNETSOVA等[50]比較了褐藻巖藻聚糖硫酸酯及其酶轉(zhuǎn)化產(chǎn)物和低分子質(zhì)量產(chǎn)物對人外周血多形核白細胞先天免疫細胞功能活性的影響,研究發(fā)現(xiàn)酶法生產(chǎn)的低分子質(zhì)量產(chǎn)物比相應(yīng)的天然高分子質(zhì)量巖藻聚糖具有更好的體外先天免疫細胞功能活性。

7 展望

海洋大型藻類是低成本,安全的可再生資源,用于許多生物技術(shù)應(yīng)用,如生物活性化合物和生物能源生產(chǎn)。大多數(shù)藻類中含有巖藻聚糖硫酸酯,而巖藻聚糖硫酸酯的高分子質(zhì)量、不規(guī)則結(jié)構(gòu)和黏度是提供用于可溶性和濃縮藥物用途的均勻制劑的障礙。通過酶法降解處理,可得到分子質(zhì)量較窄且均一性好的低分子質(zhì)量巖藻聚糖硫酸酯。因此,如何獲得高效降解巖藻聚糖硫酸酯的酶成為低分子質(zhì)量巖藻聚糖硫酸酯生產(chǎn)的關(guān)鍵。

今后,人們對巖藻聚糖硫酸酯酶的研究還將集中在：找尋能產(chǎn)生高效巖藻聚糖硫酸酯酶的微生物,巖藻聚糖硫酸酯酶的作用方式與機理,巖藻聚糖硫酸酯酶的序列分析與重組技術(shù)研究等。并在此基礎(chǔ)上,進一步深入研究酶法得到的巖藻聚糖硫酸酯寡糖的結(jié)構(gòu)及生物活性作用等。隨著基因測序的快速發(fā)展,多種巖藻聚糖硫酸酯酶已被鑒定,這為巖藻聚糖硫酸酯酶的工業(yè)化生產(chǎn)提供了可能,巖藻聚糖硫酸酯酶將具有廣闊的應(yīng)用前景。