朱本偉 , 李富超 秦 松

(1. 中國科學院 煙臺海岸帶研究所, 山東 煙臺 264003; 2. 中國科學院 海洋研究所 海洋生物學重點實驗室,山東 青島 266071; 3. 中國科學院 研究生院, 北京 100049)

半個世紀以來, 陸生微生物成為抗生素等各種生物活性物質(zhì)的重要來源, 但由于資源匱乏、研究方法滯后及篩選模型的陳舊, 近年來尋找到具有全新結(jié)構(gòu)或特殊活性化合物的幾率大幅度下降。海洋中蘊藏著豐富的微生物資源, 海洋微生物可能具有陸生微生物所不具有的化合物結(jié)構(gòu)及生物活性, 海洋微生物尤其是海洋放線菌成為新結(jié)構(gòu)活性化合物的重要來源[1]。近年來, 每年發(fā)現(xiàn)的新穎海洋新天然產(chǎn)物化合物分子超過1 000個, 而其中海洋微生物來源的新化合物也呈逐年遞增的趨勢[2-4]。

青島膠州灣是典型的半封閉型淺水海灣, 水產(chǎn)養(yǎng)殖、港口設(shè)施等人類活動影響明顯, 陸源物質(zhì)輸入豐富, 微生物種類繁多, 尤其是海洋放線菌多樣性豐富。本實驗室開展了多年的膠州灣沉積物海洋放線菌次級代謝產(chǎn)物的研究, 發(fā)現(xiàn)了一批具有抗菌、抗腫瘤等顯著生物活性的新結(jié)構(gòu)化合物[5-9], 并且建立了培養(yǎng)條件的優(yōu)化技術(shù), 通過海洋鏈霉菌培養(yǎng)條件的改變, 誘導其產(chǎn)生了一系列新結(jié)構(gòu)化合物[5-6]。因此本研究對分離自膠州灣沉積物中的一株海洋鏈霉菌M506, 進行形態(tài)特征觀察、生理生化特征實驗及分子鑒定, 并通過培養(yǎng)條件優(yōu)化, 研究其次級代謝產(chǎn)物對受試細菌的生物活性。

1 材料與方法

1.1 材料

菌株M506分離自青島膠州灣沉積物, 保存于高氏一號固體培養(yǎng)基中。選擇 6種培養(yǎng)基進行培養(yǎng)條件優(yōu)化: 高氏一號培養(yǎng)基(GI)、Zobell海洋細菌培養(yǎng)基(ZB)、蛋白胨-酵母粉培養(yǎng)基(LB), 以及豆粉-甘露醇培養(yǎng)基(SM)、麥芽浸粉培養(yǎng)基(M2+)和牛肉浸膏培養(yǎng)基(ME)[6]。

受試菌株: 金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus), 大腸桿菌(Escherichia coli), 枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis), 蘇云金芽孢桿菌(Bacillus thuringiensis), 受試菌培養(yǎng)基為LB培養(yǎng)基。

1.2 培養(yǎng)特征

菌株M506劃線接種于M2+固體培養(yǎng)基中, 將滅菌后的蓋玻片斜插到培養(yǎng)基中, 28℃恒溫培養(yǎng)4～5 d,使菌絲體和孢子能附著生長在蓋玻片上, 取出蓋玻片分別置于光學顯微鏡和掃描電子顯微鏡下觀察菌絲體形態(tài)和孢子特征。

1.3 生理生化特征

參照《鏈霉菌鑒定手冊》及國際鏈霉菌計劃(ISP),并補充使用杭州微生物試劑有限公司生產(chǎn)的非發(fā)酵細菌生化編碼鑒定管, 對菌株M506進行生理生化特征實驗。

1.4 16S rDNA序列測定與系統(tǒng)發(fā)育分析

菌株 M506基因組總 DNA提取: 參照文獻[10]的酚/氯仿抽提方法。

16S rDNA的PCR擴增和測序: 以菌株M506基因組DNA為模板, 利用引物P1 (27F): 5'-AGAGTTT GATCATGGCTCAG-3'和P2 (1390R): 5'-ACGGGC GGTGTCTACAA-3'進行 PCR擴增。PCR總體系為20 μL: 超純水 14.4 μL, 10×PCR Buffer 2 μL, 引物P1 和 P2 各 1 μL, 10 mmol/L dNTP 0.4 μL, Taq 酶 0.2 μL, 基因組DNA1μL。PCR反應(yīng)程序為: 94℃預(yù)變性5 min; (94℃變性50 s, 56℃退火50 s, 72℃延伸1.5 min)×30個循環(huán); 72℃延伸10 min。把PCR產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳, 然后利用 TIANgel Midi Purification Kit(天根生化科技有限公司)進行 DNA 回收,回收產(chǎn)物連接到 pMD18-T(TakaRa公司)載體, 并轉(zhuǎn)化到大腸桿菌Top10中, 挑取陽性克隆, 送上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司測序。

系統(tǒng)發(fā)育樹分析: 通過BLAST軟件從GenBank獲得與菌株 M506親緣關(guān)系最近的典型鏈霉菌菌株的16S rDNA序列, 用Clustal X軟件進行多序列比對,利用MEGA 4.0軟件包進行統(tǒng)計及聚類分析, 采用鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)進化樹, 通過自舉分析(bootstrap)進行置信度檢測, 自舉數(shù)據(jù)集為1 000次。

1.5 不同培養(yǎng)基對抑菌活性的影響

從菌株M506固體培養(yǎng)基上, 切取長有豐富菌落的1 cm2大小的瓊脂塊, 接種到250 mL的GI、ZB、 L B、SM、M2+和ME六種液體培養(yǎng)基中, 28℃振蕩培養(yǎng)4～5 d。發(fā)酵液冷凍干燥后, 用乙酸乙酯浸提5～6次, 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)后獲得粗提物, 溶于 1 mL甲醇/氯仿(1:1)混合溶劑中備用。

抑菌試驗采用抑菌紙片法: 將培養(yǎng)至對數(shù)期的受試菌株培養(yǎng)液和熔化的LB固體培養(yǎng)基混合, 倒入已鋪有一層LB固體培養(yǎng)基的平皿中, 待培養(yǎng)基充分凝固。用已消毒過的直徑6 mm的濾紙片吸取30 μL粗提物溶液, 充分揮干溶劑后, 將紙片貼于培養(yǎng)基表面, 于 37℃培養(yǎng) 24 h后, 測量透明圈直徑, 每株受試菌做三組平行實驗, 抑菌圈直徑取平均值。

2 結(jié)果

2.1 菌株的培養(yǎng)特征

鏈霉菌 M506在 M2+固體培養(yǎng)基上生長良好, 產(chǎn)生灰色孢子, 基內(nèi)菌絲體無可溶性色素, 菌絲體短而彎曲, 分支少, 無橫隔, 頂端斷裂成孢子, 孢子呈橢球狀, 表面有突起(圖 1-a), 孢子鏈呈螺旋狀(圖 1-b), 孢子斷裂方式可能為孢子兩端向中心收縮。

圖1 菌株M506孢子鏈的顯微照片F(xiàn)ig. 1 Spore micrograph of marine strain M506

2.2 菌株的生理生化特征

如表1所示, 菌株M506可以利用葡萄糖、果糖、木糖及阿拉伯糖, 具有明膠液化、牛奶凝固、牛奶胨化等產(chǎn)酶活性。

表1 菌株M506與灰略紅鏈霉菌的生理生化特征比較Tab. 1 Comparison of physiological and biochemical characteristics between strain M506 and Streptomyces griseorubens

2.3 菌株M506的16S rDNA序列分析

圖2 菌株M506及相關(guān)菌株的16S rDNA 系統(tǒng)發(fā)育樹Fig. 2 Phylogenetic tree based on 16S rDNA sequence showing the positions of strain M506 and related taxa.

菌株M506的16S rDNA序列測定結(jié)果共1381bp,GenBank登錄號為 JQ327839。序列經(jīng)過校對后, 與GenBank序列數(shù)據(jù)庫中的已有序列進行比較, 根據(jù)序列同源性從高到低的次序選取典型菌株的序列用于序列分析和構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹, 如圖 2所示, 菌株M506與灰略紅鏈霉菌Streptomyces griseorubensNBRC 12780親緣關(guān)系最近, 相似性為99%, 結(jié)合生理生化特征, 可以利用葡萄糖, 不能利用蔗糖, 不產(chǎn)硫化氫, 氧化酶水解陽性, 硝酸鹽還原酶陰性等, 大部分特征一致[11-12], 因此將菌株M506可以鑒定為灰略紅鏈霉菌。

2.4 不同培養(yǎng)基對菌株代謝產(chǎn)物組成及抑菌活性影響

通過抑菌紙片法活性試驗發(fā)現(xiàn), 菌株 M506在M2+培養(yǎng)基和 SM 培養(yǎng)基中培養(yǎng)得到的粗提物對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌和蘇云金芽孢桿菌均具有較強的抑制活性(抑菌圈直徑大于16 mm), 如表2所示。而在其他四種培養(yǎng)基中培養(yǎng)所得到的粗提物只對枯草芽孢桿菌具有抑制活性, 因此, 海洋鏈霉菌M506在不同的培養(yǎng)條件下所產(chǎn)生的次級代謝產(chǎn)物組分和活性均有顯著差異, 可以指導我們選擇合適的培養(yǎng)條件有目的分離純化有活性的化合物。

表2 菌株M506在不同培養(yǎng)條件下的粗提物抑菌活性Tab. 2 Antimicrobial activities of strain M506 crude extracts from different culture conditions

3 討論

近年來, 陸地放線菌產(chǎn)生新穎結(jié)構(gòu)化合物的概率在下降, 而新的疾病和病原微生物耐藥性的增加,使尋找新型活性先導化合物顯得極為迫切, 而海洋放線菌尤其是海洋鏈霉菌由于其生存環(huán)境的特殊性與多樣性, 使其具有特殊次級代謝途徑的潛力, 成為新穎活性物質(zhì)的重要來源。本實驗室通過對膠州灣海洋鏈霉菌的分離和篩選, 建立了包括培養(yǎng)條件優(yōu)化、活性篩選以及化學去重復等一系列有效的天然產(chǎn)物研究方法, 鑒定出了一批具有良好生物活性的新結(jié)構(gòu)化合物[5-9]。其中采用 6種不同培養(yǎng)基, 24種培養(yǎng)條件對海洋鏈霉菌M045的代謝產(chǎn)物分析, 獲得了具有較強抗腫瘤活性的新結(jié)構(gòu)化合物chinikomycin A和chinikomycin B[6]。對海洋鏈霉菌M518培養(yǎng)條件進行優(yōu)化, 獲得了抗腫瘤活性極強的新結(jié)構(gòu)星形孢菌素等化合物[7]。因此本論文針對海洋鏈霉菌 M506, 通過不同培養(yǎng)基進行培養(yǎng), 研究了其代謝產(chǎn)物的組分和活性差異, 發(fā)現(xiàn)在M2+和SM培養(yǎng)基中的代謝產(chǎn)物對于大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌和蘇云金芽孢桿菌均具有較強的抑制活性, 抑菌圈直徑大于 16 mm, 代謝產(chǎn)物的薄層層析分析(結(jié)果未顯示), 直觀地反映出其代謝產(chǎn)物組成上的差別, 可以有效指導我們下一步活性化合物的分離。因此, 在海洋鏈霉菌次級代謝產(chǎn)物分離中,培養(yǎng)條件優(yōu)化是提高新結(jié)構(gòu)活性化合物發(fā)現(xiàn)幾率的很好的策略。

本研究同時對菌株M506進行了鑒定, 通過形態(tài)觀察具有典型的鏈霉菌特征, 16S rDNA序列分析發(fā)現(xiàn)其與灰略紅鏈霉菌Streptomyces griseorubensNBRC 12780親緣關(guān)系最近, 相似性高達99%, 結(jié)合生理生化特征實驗, 與灰略紅鏈霉菌的典型菌株特征基本相同, 所以我們把菌株M506鑒定為灰略紅鏈霉菌的一個菌株。而葉亮[11]、楊文鴿[12]以及肖靜[13]等也分別報道了從海洋沉積物中分離得到了與灰略紅鏈霉菌相似的鏈霉菌, 并且發(fā)現(xiàn)代謝產(chǎn)物具有抗菌和抗腫瘤等活性[14]。與陸生鏈霉菌-灰略紅鏈霉菌相比較, 該菌株在形態(tài)特征方面基本上無明顯差異,但在碳源利用等生理生化特性方面較有不同, 由于該菌株采自海底沉積物, 由于生境的不同, 會造成兩者在代謝途徑、遺傳及生態(tài)功能方面存在差異。本研究通過培養(yǎng)條件優(yōu)化, 獲得了海洋鏈霉菌M506產(chǎn)抑菌活性次級代謝產(chǎn)物的培養(yǎng)條件, 而海洋灰略紅鏈霉菌次級代謝產(chǎn)物的分離純化鮮有報道, 因此該研究下一步工作將對鏈霉菌 M506進行大規(guī)模發(fā)酵培養(yǎng), 從其次級代謝產(chǎn)物中分離得到具有活性的化合物分子。

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