辛洪奎，張 超，王德利，吳劍宏，王超峰，何 勍，阮狄克

椎間盤退變所導(dǎo)致的椎間盤突出、椎管狹窄等疾病是臨床常見病。傳統(tǒng)外科治療手段存在可能的穩(wěn)定性丟失及相鄰節(jié)段退變等不足。近年來再生醫(yī)學(xué)的迅速發(fā)展，啟發(fā)了從事骨科臨床及基礎(chǔ)研究工作的學(xué)者們以重建的角度審視椎間盤退行性疾病，積極探索通過生物技術(shù)修復(fù)甚至重建病變的椎間盤，以期在不遠(yuǎn)的將來代替?zhèn)鹘y(tǒng)治療措施。椎間盤退變最為重要的機制就是髓核組織內(nèi)細(xì)胞數(shù)量的減少及活性的降低[1]，從這一角度來說，通過補充退變髓核內(nèi)的細(xì)胞數(shù)量來修復(fù)椎間盤退變是良好的選擇。本課題小組前期開展了以髓核細(xì)胞為基礎(chǔ)的組織工程技術(shù)修復(fù)退變椎間盤的探索性研究[2]，研究結(jié)果提示通過組織工程手段將髓核細(xì)胞植入退變椎間盤內(nèi)的確可以起到延緩?fù)俗兊男Ч?。雖然髓核細(xì)胞增殖能力的有限性及其體外培養(yǎng)的去分化現(xiàn)象限制了其在這一領(lǐng)域的應(yīng)用前景[3-4]，但天然髓核細(xì)胞表型的固有優(yōu)越性是其他細(xì)胞來源如骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞、脂肪干細(xì)胞無法比擬的，因此需通過適當(dāng)?shù)募夹g(shù)手段促進(jìn)髓核細(xì)胞的活性及其增殖能力。

本研究通過人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(human telomerase reverse transcriptase，hTERT)基因轉(zhuǎn)染的方式將外源性基因?qū)胨韬思?xì)胞，以期獲得增殖能力及生物學(xué)活性更強的細(xì)胞作為椎間盤退行性疾病生物治療的種子細(xì)胞。在完成基因轉(zhuǎn)染后，擬通過目的基因表達(dá)及細(xì)胞功能蛋白表達(dá)水平評估hTERT基因?qū)θ韬思?xì)胞生物學(xué)活性的影響。

1 材料與方法

1.1 犬髓核細(xì)胞的體外培養(yǎng) 8周齡幼犬，肌內(nèi)注射氯胺酮與速眠新麻醉，按背部正中切口備皮及消毒，切開皮膚及皮下組織，分離椎旁肌，切斷肋骨，離斷胸段及腰段脊柱，水平切開椎間盤，刮取膠凍狀髓核置于15 ml離心管中，2 g/L膠原酶(GIBCO公司，美國)消化2 h后1 000 r/min離心5 min，磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered solution，PBS)沖洗 2 次，收集細(xì)胞接種于100 ml培養(yǎng)瓶，加入含10%胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)的F12培養(yǎng)基(GIBCO公司，美國)，37℃，5%CO2，飽和濕度下培養(yǎng)，倒置顯微鏡觀察生長情況。細(xì)胞貼壁生長后換液，每周換液2次，細(xì)胞融合單層后傳代，取傳2代細(xì)胞作為種子細(xì)胞進(jìn)行基因轉(zhuǎn)染。

1.2 rAAV2-hTERT體外轉(zhuǎn)染髓核細(xì)胞 本實驗所使用2型重組腺相關(guān)病毒(recombinant adeno-associated virus type-2，rAAV2)-hTERT病毒載體由北京五加和生物技術(shù)有限公司完成。病毒滴度=1×1012cfu/ml。實驗分組:實驗組用 rAAV2-hTERT病毒載體以復(fù)合感染(multiplicity of infection，MOI)為1×105v.g/cell轉(zhuǎn)染犬髓核細(xì)胞;rAAV2-EGFP(enhanced green fluorescent protein，增強綠色熒光蛋白)病毒以相同的MOI轉(zhuǎn)染髓核細(xì)胞作為陰性對照。具體的轉(zhuǎn)染方法:6孔板內(nèi)單層培養(yǎng)的傳2代髓核細(xì)胞達(dá)80%融合后，棄去上清，PBS漂洗3次，取1孔細(xì)胞消化計數(shù)以確定每個培養(yǎng)孔所需病毒數(shù)量。向每個培養(yǎng)孔內(nèi)加入適量病毒使得轉(zhuǎn)染復(fù)數(shù)保持于1×105v.g/cell。向每孔內(nèi)加入達(dá)爾伯克改良伊格爾培養(yǎng)基(Dulbecco's modified Eagle's medium，DMEM)2 ml，37℃，5%CO2，飽和濕度下孵育 2 h 完成病毒轉(zhuǎn)染。2 h后棄去上清，PBS漂洗3次，10%FBS，37℃，5%CO2，飽和濕度下培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞3 d換液1次，轉(zhuǎn)染后5 d起激光共聚焦顯微鏡(Bio-Rad Radiance 2100TMconfocal system in conjunction with a Nikon TE300 microscope)觀察EGFP表達(dá)情況。

1.3 轉(zhuǎn)基因髓核細(xì)胞hTERT蛋白及mRNA的表達(dá)

1.3.1 反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(reverse transcription polymerase chain reaction，RT-PCR)檢測 hTERT mRNA的表達(dá) 在轉(zhuǎn)染后5、10、15、30 d以及60 d分別收集實驗組及對照組細(xì)胞，Trizol法提取總RNA。利用AMV逆轉(zhuǎn)錄酶random dT primer和AMV逆轉(zhuǎn)錄酶在42℃條件下孵育1 h，將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，以cDNA為模板在PCR儀上進(jìn)行PCR反應(yīng)檢測基因轉(zhuǎn)染后髓核細(xì)胞hTERT mRNA的表達(dá)，選擇犬甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)為內(nèi)參。RT-PCR引物序列為:

對于PCR產(chǎn)物以2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測。溴化乙錠(ethidium bromide，EB)染色后紫外燈下觀測，hTERT mRNA的陽性表達(dá)可擴增出128 bp的陽性條帶。采集結(jié)果，并進(jìn)行目的條帶與內(nèi)參條帶之間的灰度值比較，對結(jié)果進(jìn)行半定量分析。

1.3.2 Western-blot檢測hTERT蛋白的表達(dá) 轉(zhuǎn)染后5、10、15、30 d以及60 d分別收集實驗組及對照組細(xì)胞，冷PBS洗滌3次后加入預(yù)冷的細(xì)胞裂解液裂解(1%髓核細(xì)胞40.20 mmol/L三羥甲基氨基甲烷 Tris pH 7.4，150 mmol/L NaC1，10% 甘油，1 mmol/L苯甲基磺酰氟，10 ml抑菌肽，1 g/ml亮肽素，500 mmol/L正礬酸鈉)?；靹颍戏胖?0 min后4℃ 12 000×g離心20 min，提取總蛋白，Bio-Rad酶定量法蛋白定量后調(diào)整蛋白濃度一致。94℃變性10 min。配制150 L的聚丙烯酰胺分離膠，每孔上樣60 μg蛋白，8%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)電泳分離蛋白后，轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜，5%的脫脂牛奶封閉l h后，以鼠抗 hTERT(Abcam公司，美國)單克隆抗體4℃孵育過夜。Tris緩沖液(Tris buffered saline，TBS)/0.1%聚氧乙烯山梨醇單月桂酸酯(Tween)-20洗滌3次后，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔/鼠(1∶2 000)，37℃孵育l h，TBS/0.1%Tween-20洗膜后，用增強化學(xué)發(fā)光法檢測目的條帶的表達(dá)。圖像掃描進(jìn)行Western blot免疫印跡分析。另配置120 g/L的分離膠，按傳統(tǒng)方法作為內(nèi)參GAPDH的Western-blot免疫印跡。以發(fā)光條帶的灰度值進(jìn)行半定量分析。

1.4 實時定量PCR法檢測PG及COL1、COL2 mRNA含量 實時定量(real-time quantitative)PCR法是目前被廣泛應(yīng)用的具有較高準(zhǔn)確性及較強可重復(fù)性的檢測目的基因mRNA表達(dá)的方法。其原理為SYBR Green熒光染料在雙鏈DNA中可發(fā)出熒光，且熒光強度在一定范圍內(nèi)與DNA雙鏈數(shù)量成正比。通過使用實時定量PCR熱循環(huán)儀(MinOpticon real-time PCR，Bio-Rad)檢測熒光強度對mRNA含量進(jìn)行半定量分析。本研究選擇對基因轉(zhuǎn)染后的髓核細(xì)胞表達(dá)的PG及COL1、COL2 mRNA行實時定量PCR分析。在轉(zhuǎn)染后5、10、15、30 d以及60 d分別收集實驗組及對照組細(xì)胞，細(xì)胞各自混勻后，Trizol法提取各組RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，方法同前，以cDNA為模板，按照SYBR Premix Ex Taq試劑盒說明書進(jìn)行操作，ABI 7500實時熒光定量PCR儀上進(jìn)行PCR反應(yīng)。使用GAPDH作為內(nèi)參對PG及COL1、COL2 mRNA的含量進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。

1.5 酶聯(lián)免疫吸附測定(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)法檢測Ⅱ型膠原及蛋白多糖表達(dá)量 于基因轉(zhuǎn)染后的5、10、15、30 d以及60 d，收集達(dá)80%～90%融合的細(xì)胞培養(yǎng)液上清2 ml，每組細(xì)胞平均取3孔細(xì)胞培養(yǎng)上清，將腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(brain deried neurotrophic factor，BDNF)標(biāo)準(zhǔn)品和細(xì)胞培養(yǎng)上清液加人96孔板，每個樣品設(shè)3個復(fù)孔。牛Ⅰ型和Ⅱ型膠原蛋白(Sigma-Aldrich公司，美國)溶液配制Ⅰ型和Ⅱ型膠原蛋白標(biāo)品，分別加入96孔板。4℃孵育過夜，0.01 mol/L PBS和0.5%Tween-20洗滌后1%牛血清室溫下封閉1 h。0.01 mol/L PBS和0.5%Tween-20洗滌，以鼠源性Ⅰ型、Ⅱ型膠原單克隆抗體(1∶1 000，Sigma-Aldrich公司，美國)室溫下孵育2 h，0.01 mol/L PBS和 0.5%Tween-20洗滌?？故?IgG抗體 (Sigma-Aldrich公司，美國)室溫下孵育1 h，再次洗滌后，以交聯(lián)磷酸酶的生物素(Sigma-Aldrich公司，美國)孵育1 h，每孔中加入p-nitrophenyl phosphate(Sigma-Aldrich公司，美國)20 μl孵育 20 min，3 mol/L NaOH 中和反應(yīng)，置入酶標(biāo)儀(Bio-Rad公司，美國)中，讀取405 nm處吸光度，按繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線計算各樣本中Ⅱ型膠原及蛋白多糖含量。

1.6 統(tǒng)計學(xué)處理 應(yīng)用統(tǒng)計軟件SPSS 13.0進(jìn)行統(tǒng)計分析。計量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，各組均數(shù)間的比較用方差分析，均數(shù)間兩兩比較用q檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 犬髓核細(xì)胞的分離培養(yǎng)及熒光標(biāo)記 8周齡幼犬髓核呈半透明膠凍狀。經(jīng)膠原酶消化2 h后，大量椎間盤細(xì)胞可被分離出來形成細(xì)胞懸液。接種培養(yǎng)瓶后48 h內(nèi)細(xì)胞即可貼壁伸展。鏡下可見細(xì)胞胞質(zhì)豐富，胞體飽滿，呈短梭形，有2個或2個以上長短不一的突起，并隨培養(yǎng)時間延長而向外延展(圖1)。原代椎間盤細(xì)胞生長迅速，培養(yǎng)1周即可鋪滿瓶底80%，達(dá)到傳代要求。隨傳代次數(shù)增加，細(xì)胞極性逐漸增強，呈長梭形，似成纖維細(xì)胞，生長變緩。

圖1 傳2代犬髓核細(xì)胞

2.2 rAAV2病毒載體體外轉(zhuǎn)染髓核細(xì)胞 以rAAV2-EGFP作為標(biāo)記基因的測定結(jié)果顯示，使用rAAV2可成功轉(zhuǎn)染犬髓核細(xì)胞，EGFP可在被轉(zhuǎn)染髓核細(xì)胞中正確表達(dá)。在轉(zhuǎn)染后的第10天，EGFP的表達(dá)達(dá)到高峰，隨著細(xì)胞傳代次數(shù)的增加，其表達(dá)量逐漸減低，至第30天時其表達(dá)量明顯減少(圖2)。rAAV2-hTERT轉(zhuǎn)染髓核細(xì)胞后5 d，即可檢測到hTERT mRNA及蛋白的表達(dá)，而陰性對照組未檢測到相應(yīng)mRNA及蛋白的表達(dá)(圖3、4)。

2.3 hTERT基因表達(dá)結(jié)果的動態(tài)檢測 在轉(zhuǎn)染后5、10、15、30 d 以及 60 d，均可于基因和蛋白水平檢測到hTERT基因在髓核細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)，而在所有觀察時間點內(nèi)，對照組未能檢測到hTERT基因表達(dá)。通過對不同時間點的實驗組細(xì)胞進(jìn)行目的條帶與內(nèi)參條帶灰度值的比較顯示，轉(zhuǎn)染后第10天hTERT基因的表達(dá)的相對水平最高，而隨著細(xì)胞傳代次數(shù)的增加，hTERT基因表達(dá)的相對水平也逐漸降低(圖5)。

圖2 激光共聚焦顯微鏡觀察EGFP在髓核細(xì)胞中的表達(dá)

圖3 RT-PCR檢測rAAV2-hTERT轉(zhuǎn)染后5 d髓核細(xì)胞hTERT mRNA的表達(dá)

圖4 Westernblot檢測rAAV2-hTERT轉(zhuǎn)染后5 d髓核細(xì)胞hTERT蛋白的表達(dá)

圖5 實驗組髓核細(xì)胞hTERT基因表達(dá)結(jié)果的動態(tài)觀察

2.4 實時定量PCR法檢測PG及COL1、COL2 mRNA含量 實時定量PCR檢測結(jié)果顯示:rAAV2-hTERT轉(zhuǎn)染后第5天，實驗組細(xì)胞PG及COL1、COL2 mRNA含量較EGFP對照組未見明顯增加;而在轉(zhuǎn)染后的第10天，實驗組PG、COL2 mRNA的表達(dá)量分別較對照組增加了62%和50%(P＜0.05);而這一mRNA表達(dá)量的增加在隨后的觀察中繼續(xù)升高，在第15天分別達(dá)到了最高的132%和87%(P＜0.05)。15 d后，雖然mRNA表達(dá)量增加的幅度較最高峰有所下降，但仍明顯高于對照組細(xì)胞的mRNA表達(dá)(P＜0.05)。而對COL1 mRNA表達(dá)的分析可見雖然實驗組髓核細(xì)胞轉(zhuǎn)染后COL1 mRNA表達(dá)量有小幅增加，但同對照組相比無明顯差別，結(jié)果無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。見圖6。

圖6 PG及COL1、COL2 mRNA表達(dá)量的實時定量PCR分析

2.5 蛋白多糖及Ⅱ型膠原表達(dá)量的檢測 通過ELISA法對蛋白多糖及Ⅱ型膠原表達(dá)量的分析提示:rAAV-hTERT在轉(zhuǎn)染后第5天，實驗組細(xì)胞PG、COL2的表達(dá)量較EGFP對照組未見明顯增加;而在轉(zhuǎn)染后的第10天，實驗組PG、COL2的表達(dá)量顯著增加，并在第15天達(dá)到52.48 ng/ml及4.69 ng/ml的高值。在30 d和60 d時，實驗組PG、COL2的表達(dá)量仍維持在較高水平;對照組細(xì)胞隨著培養(yǎng)時間及代次的延長，在第30天后蛋白多糖表達(dá)量出現(xiàn)較為明顯的下調(diào)。通過單因素方差分析進(jìn)行兩組間的統(tǒng)計比較，自第10天至第60天，實驗組PG、COL2的表達(dá)量均明顯高于對照組(P＜0.05)。見圖7、8。

圖7 PG表達(dá)量的ELISA分析

圖8 COL2表達(dá)量的ELISA分析

3 討論

許多因素在椎間盤退變的過程中發(fā)揮重要作用，包括年齡、吸煙、喝酒、機械應(yīng)力、營養(yǎng)缺乏以及遺傳因素等[5-7]。椎間盤退變的實質(zhì)是椎間盤組織及細(xì)胞在這些因素的作用下所產(chǎn)生的一系列復(fù)雜病理生理改變。首先出現(xiàn)的是髓核內(nèi)細(xì)胞數(shù)量的不足或由于缺乏足夠的營養(yǎng)導(dǎo)致的細(xì)胞功能的下降[8]，這引起細(xì)胞外基質(zhì)成分Ⅱ型膠原及蛋白多糖等表達(dá)量的降低，從而導(dǎo)致髓核及纖維環(huán)組織強度及韌性的減低，在外力的作用下更易發(fā)生纖維環(huán)或髓核組織的破壞，繼發(fā)椎間盤突出、椎管狹窄等退變相關(guān)疾病，引起臨床癥狀，從而影響患者工作及生活。

運用生物技術(shù)手段延緩甚至逆轉(zhuǎn)椎間盤退變的進(jìn)展，從結(jié)構(gòu)及功能上實現(xiàn)椎間盤的修復(fù)重建，理論上具有巨大的優(yōu)勢。椎間盤退變最直接的原因在于椎間盤內(nèi)細(xì)胞數(shù)量的減少及活力的下降。因此，通過生物技術(shù)增強椎間盤內(nèi)細(xì)胞的活力或直接增加細(xì)胞的數(shù)量具有相當(dāng)?shù)目尚行浴?/p>

20世紀(jì)90年代醫(yī)學(xué)研究成果證實[9-10]，端粒長度會隨著細(xì)胞的分裂增殖而逐漸縮短，細(xì)胞每增殖1倍，端粒長度可能會損失50～200個核苷酸，而當(dāng)端?？s短到一定程度時，則會導(dǎo)致細(xì)胞的死亡[11]。端粒酶是一種RNA和蛋白質(zhì)構(gòu)成的復(fù)合體，具有逆轉(zhuǎn)錄酶的活性，它能以自身RNA(人端粒酶反向hTR)為模板，從頭合成端粒DNA并加到染色體末端，維持染色體的穩(wěn)定性[12]。運用hTERT來延長細(xì)胞的生命周期是近年來發(fā)現(xiàn)的一種新促進(jìn)細(xì)胞增殖的方法。迄今為止學(xué)者們已經(jīng)利用hTERT基因成功構(gòu)建了多種組織“永生化”細(xì)胞[13-14]。同時，相關(guān)研究表明hTERT基因轉(zhuǎn)染在促進(jìn)細(xì)胞生物學(xué)活性的同時可有效避免致瘤性的出現(xiàn)[15]。本實驗借鑒上述研究的成功經(jīng)驗，擬通過 rAAV2病毒將hTERT基因轉(zhuǎn)入髓核細(xì)胞，以期促進(jìn)髓核細(xì)胞的增殖能力及表型維持，為椎間盤退行性疾病的生物治療提供較為理想的種子細(xì)胞選擇。通過轉(zhuǎn)染后第5天對實驗組細(xì)胞hTERT基因及蛋白表達(dá)的分析，證實rAAV2-hTERT病毒載體可成功轉(zhuǎn)染犬髓核細(xì)胞并實現(xiàn)表達(dá)hTERT基因及蛋白的目的。

永生化細(xì)胞的實質(zhì)是細(xì)胞獲得了無限增殖的能力。從這一意義上來說，除了腫瘤細(xì)胞之外，目前多數(shù)“永生化”的細(xì)胞都只是相對的，即細(xì)胞的增殖潛能被相對放大，并非真正意義上的永生化。本研究使用rAAV2-hTERT病毒載體轉(zhuǎn)染髓核細(xì)胞的目的在于使髓核細(xì)胞獲得更長的生命周期，在其生命周期內(nèi)，可以更好地維持細(xì)胞表型，實現(xiàn)更長時間的功能表達(dá)，而不是一味追求將其“永生化”。實驗中我們發(fā)現(xiàn)rAAV2-hTERT轉(zhuǎn)染后的60 d之內(nèi)，hTERT基因及蛋白的表達(dá)得到了很好的保持，其高峰出現(xiàn)在轉(zhuǎn)染后的第10天，雖然此后有一定程度下降，但在第60天仍可以明顯地觀察到其陽性表達(dá)。我們認(rèn)為hTERT基因及蛋白表達(dá)在第10天之后出現(xiàn)下調(diào)的原因在于隨著培養(yǎng)時間的延長及傳代次數(shù)的增加，rAAV2-hTERT陽性轉(zhuǎn)染細(xì)胞逐漸丟失，從而降低了其調(diào)節(jié)髓核細(xì)胞活性的效率。峰值之后hTERT基因及蛋白表達(dá)的下行趨勢進(jìn)一步證實使用rAAV2-hTERT轉(zhuǎn)染髓核細(xì)胞無法實現(xiàn)真正意義的永生化，而是相對于未處理的髓核細(xì)胞，獲得了更長的生命周期。

hTERT基因轉(zhuǎn)染髓核細(xì)胞及其mRNA與蛋白的表達(dá)只是本研究的第一步，基因轉(zhuǎn)染的目的是獲得活力更強的種子細(xì)胞以進(jìn)一步探索椎間盤退行性疾病的生物治療。同對照組相比，實驗組細(xì)胞Ⅱ型膠原及蛋白多糖表達(dá)量的顯著上調(diào)充分驗證了hTERT蛋白對于體外培養(yǎng)的髓核細(xì)胞表型及功能的良好維持。Ⅱ型膠原和蛋白多糖是椎間盤細(xì)胞外基質(zhì)的重要組成成分，當(dāng)髓核細(xì)胞由于發(fā)生退變而導(dǎo)致兩者表達(dá)量下降時，椎間盤的結(jié)構(gòu)和形狀就會發(fā)生改變，從而降低其吸收和分散負(fù)荷的能力，在長期機械負(fù)荷的作用下，退行性變進(jìn)一步進(jìn)展，從而形成椎間盤退變的惡性循環(huán)[8，16]。本實驗中，通過hTERT基因的作用，我們實現(xiàn)了體外培養(yǎng)髓核細(xì)胞Ⅱ型膠原及蛋白多糖表達(dá)量的提高，這一結(jié)果對于rAAV2-hTERT-髓核細(xì)胞在椎間盤退行性疾病治療中的應(yīng)用具有相當(dāng)?shù)囊饬x。通過對實驗結(jié)果的RTPCR半定量及ELISA定量分析，可見兩者表達(dá)量在轉(zhuǎn)染后的第15天達(dá)到高峰，這一峰值較hTERT基因及蛋白表達(dá)高峰相對滯后，可能原因在于hTERT主要通過保證細(xì)胞增殖過程中的端粒長度來維持細(xì)胞的正常代謝，同時上調(diào)細(xì)胞周期中同細(xì)胞增殖、DNA修復(fù)及染色質(zhì)重組相關(guān)的基因表達(dá)水平[17-18]，這些機制傳到細(xì)胞蛋白的表達(dá)需要相對較為緩慢的過程。因此，在以Ⅱ型膠原及蛋白多糖為指標(biāo)衡量細(xì)胞表型及功能時，其表達(dá)量的提升要相對滯后。但hTERT基因?qū)τ诩?xì)胞功能的調(diào)節(jié)和保持效果具有相對的持續(xù)性，這反應(yīng)在至第60天時，實驗組Ⅱ型膠原及蛋白多糖表達(dá)量仍明顯高于對照組。正常髓核細(xì)胞少量表達(dá)Ⅰ型膠原。通過RT-PCR對不同時間點Ⅰ型膠原表達(dá)量進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)實驗組同對照組無明顯區(qū)別，說明rAAV2-hTERT轉(zhuǎn)染對髓核細(xì)胞Ⅰ型膠原的表達(dá)無明顯促進(jìn)或抑制作用。

綜上所述，本研究結(jié)果提示rAAV2-hTERT病毒轉(zhuǎn)染可成功實現(xiàn)體外培養(yǎng)條件下髓核細(xì)胞增殖能力及細(xì)胞功能蛋白表達(dá)的上調(diào)，這將可能提高其在椎間盤退行性疾病中的應(yīng)用潛力。

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