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(浙江大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，浙江杭州 310058)

人類疾病動(dòng)物模型是研究疾病病因、揭示疾病發(fā)生機(jī)理及評(píng)價(jià)治療措施等的重要實(shí)驗(yàn)對(duì)象和材料。由于基因修飾小鼠疾病模型存在著極其重要的理論研究?jī)r(jià)值和廣泛的實(shí)際應(yīng)用潛力，所以對(duì)小鼠模型進(jìn)行長(zhǎng)期保種顯得越來(lái)越重要。常規(guī)保種方法用于大量基因修飾小鼠維持時(shí)，存在許多不足，如維持成本高、疾病威脅、遺傳漂變等，且這些小鼠往往對(duì)營(yíng)養(yǎng)、環(huán)境等因素的要求也不一樣[1]。胚胎和精子的冷凍保存及復(fù)蘇技術(shù)則可彌補(bǔ)常規(guī)動(dòng)物保種和繁育方法的缺陷。

FVB小鼠是一種常用的實(shí)驗(yàn)小鼠品系，起源于遠(yuǎn)交系Swiss小鼠。1935年，該小鼠飼養(yǎng)于美國(guó)NIH研究所，1966年起開(kāi)始選育。20世紀(jì)70年代初，在HSFS/N系小鼠培育至第八代時(shí)，發(fā)現(xiàn)部分小鼠攜帶Fv1 b基因，表現(xiàn)對(duì)B strain Friend白血病毒敏感，隨后育成Fv1 b同型合子近交系，稱作FVB品系。FVB繁殖力較強(qiáng)，窩產(chǎn)仔數(shù)多，受精卵前核大而顯著，易于顯微注射DNA，是適用于轉(zhuǎn)基因?qū)嶒?yàn)的小鼠品系[2]。EIIa-Cre小鼠是以FVB小鼠為背景制作的轉(zhuǎn)基因小鼠品系，轉(zhuǎn)入的基因?yàn)榧兒献樱嫌贜o 6染色體第18 -95 Mbp的DNA區(qū)間，是廣泛應(yīng)用于突變和轉(zhuǎn)基因研究的工具鼠[3]。

本研究以EIIa-Cre小鼠和其背景鼠FVB為研究對(duì)象，進(jìn)行胚胎冷凍保存方法及其影響因素的研究。采用慢速冷凍和快速冷凍方法，探索其解凍和復(fù)蘇程序的最佳條件，并比較兩種方法的優(yōu)缺點(diǎn)，為建立基因修飾小鼠胚胎保存資源庫(kù)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1小鼠來(lái)源及胚胎獲取

小鼠來(lái)源。EIIa-Cre和FVB小鼠均購(gòu)于南京大學(xué)模式生物研究所，飼養(yǎng)于屏障設(shè)施內(nèi)。

受精卵獲取。選取成熟未配雌性小鼠(4～6周齡[4])，腹腔注射PMSG 5～10 IU/只，48 h后腹腔注射HCG 5～10 IU/只，隨即與同基因型的成年雄性小鼠合籠。然后于注射HCG 14～16 h后處死雌鼠，連同子宮一起取出輸卵管，用解剖針刺破輸卵管膨大部，引出卵子團(tuán)至HTF培養(yǎng)基中，置培養(yǎng)皿于37℃、5%CO2孵箱中培養(yǎng)。

2-細(xì)胞期胚胎獲取。同上述超排交配(以陰栓為準(zhǔn))24 h后處死雌鼠，連同子宮一起取出輸卵管(然后剪下輸卵管)，用注射器進(jìn)行灌流沖洗，沖出胚胎，再將含有胚胎的培養(yǎng)基滴入培養(yǎng)皿中。

1.2玻璃化液配制

DAP213的配制。先用4M的DMSO和6M的PG(propylene glycol)溶解在PB1溶液中，形成A液；然后將2M的AA(acetamide)溶解在PB1中，形成B液。

最后A液和B液等量混合在一起，即形成DAP213抗冷凍劑[5]。

1.3胚胎冷凍

室溫下配置1M的DMSO溶液，按冷凍麥管數(shù)量在直徑3 cm的培養(yǎng)皿中制成數(shù)個(gè)液滴，每個(gè)液滴約100 μL。

將待冷凍的胚胎移入DMSO中，每個(gè)液滴約移入40個(gè)胚胎，然后依次將其他麥管中的胚胎移入液滴中，讓其自然沉降至液滴底部。將5 μL的1M DMSO溶液與胚胎一起移至冷凍管中，放入0℃的冷卻裝置內(nèi)。

5 min后，將預(yù)先冷卻的胚胎保存液(DAP213)45 μL移入裝有胚胎的冷凍管內(nèi)。再經(jīng)5 min后，將冷凍管放入固定裝置，直接放入液氮中。

1.4冷凍胚胎的融解

將解凍液(0.25M蔗糖溶液)放入37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中平衡30 min。

從液氮罐中取出冷凍管，倒掉管內(nèi)液氮，室溫下放置約30 s。將預(yù)熱的解凍液注入冷凍管中，并用移液器迅速吹吸約10次，然后將內(nèi)容物移至培養(yǎng)皿中，回收胚胎。

用嘴吸式移液器將回收的胚胎移入KSOM培養(yǎng)液滴中，靜止10 min，沖洗胚胎2次后，在解剖鏡下進(jìn)行形態(tài)學(xué)檢查。

1.52-細(xì)胞期胚胎的移植

選擇10周齡左右母鼠制作備用的假孕受體母鼠。

先將母鼠放入輸精管結(jié)扎的雄性小鼠合籠，進(jìn)行交配。次日，將確認(rèn)有陰道栓的雌鼠作為胚胎移植受體小鼠，麻醉后在其腰椎處剃毛，沿正中位置開(kāi)一小口，再在腹部?jī)蓚?cè)肌肉分別開(kāi)0.5 cm的小口，從腹腔內(nèi)引出卵巢、輸卵管和子宮。

確認(rèn)輸卵管喇叭口和膨大部位，在喇叭口之間的輸卵管壁上剪開(kāi)一切口，將移植針插入到輸卵管中，植入胚胎，縫合后將小鼠放在37℃環(huán)境下保溫，直到蘇醒。

1.6統(tǒng)計(jì)方法

采用SAS 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素三水平方差分析。

分析比較兩品系小鼠的受精卵和2-細(xì)胞胚胎期卵細(xì)胞的超排效率，胚胎復(fù)蘇率、妊娠率和產(chǎn)仔率。

2 結(jié)果與分析

2.1超排卵數(shù) 詳見(jiàn)表1。

表1 FVB和EIIa-Cre小鼠超排卵數(shù)測(cè)定結(jié)果

由表1可知，F(xiàn)VB和EIIa-Cre小鼠超排后獲取的受精卵數(shù)量分別為33.71枚和24.23枚，發(fā)育至2-細(xì)胞期的數(shù)量分別為30.43枚和17.08枚，EIIa-Cre的胚胎數(shù)明顯少于FVB。超排后直接獲取2-細(xì)胞期胚胎平均數(shù)分別為28.17枚和19.70枚，EIIa-Cre的胚胎數(shù)也明顯少于FVB。

2.2胚胎復(fù)蘇移植結(jié)果 詳見(jiàn)表2。

表2 FVB和EIIa-Cre的復(fù)蘇移植結(jié)果

由表2可知，F(xiàn)VB和EIIa-Cre小鼠的胚胎復(fù)蘇率、妊娠率和產(chǎn)仔率均存在較大差異，分別為77.7%和63.0%、80.0%和57.1%、13.6%和8.2%，F(xiàn)VB小鼠明顯高于EIIa-Cre小鼠。

3 討論

3.1小鼠超排卵效果受多種因素影響，其中主要因素有小鼠周齡、激素注射劑量、PMSG和HCG注射間隔時(shí)間及健康狀態(tài)等。

關(guān)于激素注射劑量、PMSG和HCG注射間隔時(shí)間的研究，相關(guān)報(bào)道較多[6-7]。董婉維等[4]報(bào)道4～6周齡FVB超排效果最佳，這可能與雌鼠性成熟程度有關(guān)，4～6周齡小鼠已達(dá)到性成熟，卵泡成熟周期已經(jīng)開(kāi)始，對(duì)卵泡刺激素(FSH)有反應(yīng)的卵泡數(shù)達(dá)峰值，排卵數(shù)明顯高于6～10周齡的FVB小鼠。

EIIa-Cre為FVB背景小鼠，采用相同方案，取得了較好的超排效果，表明兩者的最佳超排條件可能相近。

本研究顯示，EIIa-Cre的胚胎數(shù)(受精卵或2-細(xì)胞期)明顯少于FVB小鼠，這可能與其遺傳背景改變有關(guān)，Spearow J L等[8]和Byers SL等[9]曾報(bào)道小鼠品系的遺傳背景是影響超排效果的主要因素之一。

3.2胚胎凍存復(fù)蘇技術(shù)是一種簡(jiǎn)單、實(shí)用、經(jīng)濟(jì)而可靠的保種方法，可降低動(dòng)物飼養(yǎng)和繁育成本，擴(kuò)大動(dòng)物品系的保存能力，也可隨時(shí)為其它胚胎工程技術(shù)，如胚胎移植、胚胎分割、體外受精、動(dòng)物性別控制、轉(zhuǎn)基因動(dòng)物技術(shù)和胚胎干細(xì)胞技術(shù)等提供可用胚胎。

通過(guò)建立胚胎庫(kù)，可在世界范圍內(nèi)運(yùn)送胚胎，從而取代活體運(yùn)輸，既降低了費(fèi)用又可避免疾病傳播，還能解決遺傳漂變及人為、環(huán)境因素造成的動(dòng)物生物學(xué)特征和遺傳特性的改變等問(wèn)題。

隨著基因修飾動(dòng)物品系的急劇增加，對(duì)胚胎冷凍技術(shù)提出了更高的要求，不同品系最佳凍存復(fù)蘇條件存在差異，人們又很難逐個(gè)品系摸索其最佳凍存復(fù)蘇條件。本研究通過(guò)開(kāi)展基因修飾品系與其背景品系的凍存復(fù)蘇對(duì)比研究，嘗試建立背景品系最佳凍存復(fù)蘇條件用于各個(gè)基因修飾品系胚胎保存的可能性。

結(jié)果顯示，相同方法 EIIa-Cre的各項(xiàng)效率均低于其背景品系FVB，但其各項(xiàng)數(shù)據(jù)均不影響該品系成功保種，筆者采用適當(dāng)增加EIIa-Cre超排個(gè)體可明顯提高保種效率。所建立的方法，可為今后其他基因修飾動(dòng)物品系的胚胎保存提供參考。

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