黃齊林，安雅睿，江小麗，陳 華，畢文姬，張 文*,金利通

（1.華東師范大學(xué)化學(xué)系，上海200062）

（2.玉溪師范學(xué)院化學(xué)系，云南玉溪653100）

動脈粥樣硬化是一種慢性炎癥病變，病理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)巨噬細(xì)胞內(nèi)膽固醇沉積形成粥樣斑塊可引發(fā)血管管腔變細(xì)[1～2]。數(shù)據(jù)表明，動脈粥樣硬化是糖尿病患者發(fā)病和死亡的主要原因，超過65%的糖尿病患者死于動脈粥樣硬化及其并發(fā)癥[3]。研究發(fā)現(xiàn)，大鼠巨噬細(xì)胞內(nèi)膽固醇含量隨著葡萄糖含量的增加而升高，且巨噬細(xì)胞內(nèi)膽固醇的大量沉積是動脈粥樣硬化的主要病因[4～5]。為了探究高血糖和膽固醇在糖尿病引發(fā)動脈粥樣硬化過程中的作用，有必要建立同時檢測大鼠血清和腹腔巨噬細(xì)胞內(nèi)葡萄糖和膽固醇含量的有效實驗方法。

該文研制了一種新型雙酶生物傳感器，用于大鼠血清與腹腔巨噬細(xì)胞（PMs）內(nèi)葡萄糖和膽固醇的同時檢測。首先在雙電極表面電聚合硫堇；然后將金納米粒子固定在聚硫堇（PTH）表面，吸附金納米粒子的聚硫堇不僅能夠保持酶的催化活性，而且可作為介電中心提高電子轉(zhuǎn)移速率；最后用殼聚糖做交聯(lián)劑將葡萄糖氧化酶(GOD)、膽固醇酯酶(ChE)和膽固醇氧化酶(ChOx)分別共價鍵合在雙電極的聚硫堇層上。通過檢測雙電極上的氧化電流大小即可間接檢測到葡萄糖和膽固醇的濃度。葡萄糖傳感器的線性范圍為8.0×10-6～6.0×10-3mol/L， 檢 測 限 為 2.0×10-6mol/L；膽固醇傳感器的線性范圍為2.0×10-6～1.0×10-3mol/L，檢測限為 0.6×10-6mol/L。 結(jié)果顯示該雙酶傳感器靈敏度高，選擇性好。該傳感器成功用于同時檢測糖尿病大鼠血清及腹腔巨噬細(xì)胞內(nèi)的葡萄糖和膽固醇的含量，取得令人滿意的結(jié)果。

1 結(jié)果與討論

1.1 雙酶傳感器的作用機理

同時檢測葡萄糖和膽固醇的電化學(xué)實驗原理是將酶催化反應(yīng)和在酶活性中心和電極表面的電子媒介體（ETM）相結(jié)合。具體機理如圖1所示。GOD和ChOx均含有一種氧化還原活性中心，核黃素腺嘌呤二核苷酸（FAD），該活性中心能夠分別將葡萄糖和膽固醇催化水解為葡萄糖酸內(nèi)酯和4-膽甾烯-3-酮。同時，F(xiàn)AD被還原為FADH2。該催化過程中失去的2個電子將在PTH的兩電子/兩質(zhì)子的可逆?zhèn)鬟f過程中被傳遞至電極表面，兩電極上生成的電流與葡萄糖或膽固醇的濃度相關(guān)。

圖1 雙酶傳感器的作用機理

1.2 線性范圍與檢測限

圖2為葡萄糖傳感器和膽固醇傳感器的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。葡萄糖傳感器在8×10-6～6×10-3mol/L范圍內(nèi)呈線性，線性相關(guān)系數(shù)為0.998 7，檢測下限為 2.0×10-6mol/L（3 倍信噪比）；膽固醇傳感器的線性范圍為2×10-6～1×10-3mol/L，線性相關(guān)系數(shù)為 0.998 3，檢測下限為 0.6×10-6mol/L（3 倍信噪比）。

圖2 （A）葡萄糖傳感器的標(biāo)準(zhǔn)曲線，（B）膽固醇傳感器的標(biāo)準(zhǔn)曲線，內(nèi)插圖均為在0～1.0×10-3mol/L濃度范圍內(nèi)，相應(yīng)傳感器的標(biāo)準(zhǔn)曲線

1.3 雙酶傳感器的選擇性

尿酸（UA）和抗壞血酸（AA）是血清和腹腔巨噬細(xì)胞中的主要電活性小分子，可能會干擾傳感器對被分析物的測定，該文對此進行了討論，如圖3所示。從圖中可以看出，連續(xù)交替加入20 μmol/L UA和20 μmol/L AA對葡萄糖傳感器和膽固醇傳感器都無明顯影響。該文還討論了雙電極之間的交叉干擾。在60 μmol/L UA和60 μmol/L AA的存在下，向溶液中先后連續(xù)加入0.5 mmol/L的膽固醇和葡萄糖，從圖3可以看出，膽固醇傳感器對膽固醇具有良好的電流響應(yīng)，對葡萄糖的加入無明顯響應(yīng)；同樣，葡萄糖傳感器對葡萄糖也有很好的響應(yīng)，對膽固醇無響應(yīng)。

1.4 實際樣品分析

該文利用建立的傳感器對大鼠血清及腹腔巨噬細(xì)胞內(nèi)的葡萄糖和膽固醇進行了同時檢測。實驗結(jié)果如表1所示，與對照組相比，糖尿病大鼠血糖增加了229%，血膽固醇僅增加16%。而巨噬細(xì)胞內(nèi)，膽固醇和葡萄糖的含量均有明顯增加，其中葡萄糖含量增加了258%,膽固醇含量增加了113%。實驗結(jié)果表明糖尿病體內(nèi)高的葡萄糖含量會通過增加巨噬細(xì)胞內(nèi)膽固醇的含量，有可能進而引發(fā)動脈粥樣硬化。

圖3 雙酶傳感器對 UA(20 μmol/L,40 μmol/L,60 μmol/L)、AA(20 μmol/L,40 μmol/L,60 μmol/L)、葡萄糖(0.1 mmol/L,0.2 mmol/L,0.3 mmol/L,0.4 mmol/L,0.5 mmol/L)和膽固醇(0.1 mmol/L,0.2 mmol/L,0.3 mmol/L,0.4 mmol/L,0.5 mmol/L)的電流-時間響應(yīng)

表1 健康大鼠和糖尿病大鼠血清和巨噬細(xì)胞內(nèi)的葡萄糖和膽固醇的含量

致謝:感謝國家自然科學(xué)基金 (21075041)和上海市科委納米專項基金(No.1052nm06500)提供的基金資助!

（略）