韓建明，鄭宏倩

（江蘇省農(nóng)科院原子能農(nóng)業(yè)利用研究所，江蘇南京 210014）

螺旋藻（spirulina）作為人類未來重要的健康營養(yǎng)資源，自上世紀(jì)70年代開始工廠化、商品化生產(chǎn)以來，其養(yǎng)殖規(guī)模、養(yǎng)殖方式和養(yǎng)殖技術(shù)都得到了很大的發(fā)展[1－3]。然而，隨著室外大規(guī)模開放式生產(chǎn)體系的形成，經(jīng)濟(jì)簡易營養(yǎng)液配方的應(yīng)用及鹽堿湖水、海水和污水的資源化利用[4－6]，螺旋藻高成本投入和高環(huán)境要求的產(chǎn)業(yè)屬性正在逐漸弱化，脅迫螺旋藻生長的逆境因素也愈來愈多，有些甚至是毀滅性的，輪蟲（wheel animalcule）危害即是其中之一。輪蟲是一群微小的多細(xì)胞原腔動物，主要以微型浮游生物（藻類、原生動物等）、細(xì)菌、有機(jī)碎屑等為食，體長0．04～2 mm，大多不超過0．5 mm，孤雌生殖為主，繁殖速度極快，幾乎呈“爆發(fā)式”增殖。螺旋藻藻池受輪蟲污染初期，早晨觀察池面藻體間呈現(xiàn)有銹紅色的點斑狀或不規(guī)則線狀，如不防治，數(shù)天內(nèi)即可將藻絲吃光，導(dǎo)致絕收。由于輪蟲和螺旋藻生長的適宜溫度和光照等自然環(huán)境條件具有相當(dāng)程度的重疊性，加之其遇不良環(huán)境特有的隱生（cryptosis，俗稱假死）特性及卵遇逆境脅迫時呈休眠狀態(tài)，既耐旱又抗寒，生存能力極強(qiáng)，對一般藥物不敏感[7－8]，因此一旦爆發(fā)極難根治。筆者早在1996年螺旋藻大規(guī)模養(yǎng)殖實踐中，經(jīng)過多種化學(xué)制劑和方法的研究篩選，發(fā)現(xiàn)碳酸氫銨（NH4HCO3）殺滅輪蟲的效果十分顯著，并沿用至今，安全有效地解決了螺旋藻生產(chǎn)中輪蟲危害的難題，為區(qū)域性螺旋藻產(chǎn)業(yè)的快速健康發(fā)展作出了積極的貢獻(xiàn)。

1 材料和方法

1．1 等量（22 L）提取受輪蟲嚴(yán)重污染的同一開放式螺旋藻培養(yǎng)池藻液置于露天食品周轉(zhuǎn)箱中，施用碳酸氫銨進(jìn)行殺蟲試驗，碳酸氫銨用量為 50 mg/L、100 mg/L、150 mg/L、200 mg/L、250 mg/L、300 mg/L、350 mg/L、400 mg/L 和 500 mg/L，分別在處理后 0．5 h、1．0 h、2．0 h、4．0 h、8．0 h、16．0 h 和 24．0 h 用吸管吸取充分?jǐn)嚢杈鶆虻膸x藻液通過顯微鏡觀察統(tǒng)計輪蟲的死亡數(shù)（包括已失去活動能力的個體）和活體數(shù)，比較碳酸氫銨不同用量在不同時間內(nèi)的殺蟲效果。試驗期間平均氣溫24．5℃。開放式螺旋藻池培養(yǎng)液的基礎(chǔ)配方為：NaHCO310．0 g/L,NaNO31．0 g/L,NaCl 1．0 g/L,KCl 0．5 g/L,KH2PO40．25 g/L，MgSO40．1 g/L,FeSO40．01 g/L,CO(NH2)20．05 g/L。藻體生長過程中營養(yǎng)物添補(bǔ)模式一般為：NaHCO30．3 g/L/3 d，CO(NH2)20．01 g/L/d，具體視藻體生長速度、收獲量、水分蒸發(fā)及降雨等情況而定。

1．2 等量（22L）提取未受輪蟲污染的同一開放式螺旋藻培養(yǎng)池藻液置于露天食品周轉(zhuǎn)箱中，施用碳酸氫銨作為螺旋藻培養(yǎng)液的添加物，碳酸氫銨用量為150 mg/L、200 mg/L、250 mg/L和300 mg/L（考慮到試驗的主要目的是防治輪蟲，參照1．1殺蟲試驗的結(jié)果，碳酸氫銨＜150 mg/L用量未作處理，也未設(shè)添補(bǔ)其它N源處理作對照），處理后分別在24 h(D1)、48 h(D2)、和72 h(D3)用721分光光度計測定螺旋藻藻液的OD560值，比較不同處理間螺旋藻群體生長增殖（OD560增加值）的差異。試驗期間日平均氣溫為24～26℃。開放式螺旋藻池培養(yǎng)液的基礎(chǔ)配方和藻體生長過程中營養(yǎng)物的添補(bǔ)模式同1．1。

1．3 生產(chǎn)實踐中，考慮到白天和夜間螺旋藻生長特性的不同和輪蟲活動分布特點的差異，隨機(jī)將受輪蟲污染危害的開放式螺旋藻培養(yǎng)池分成兩組，分別在上午8：00－9:00時和下午19:00－20:00時進(jìn)行殺蟲處理，碳酸氫銨用量為200 mg/L，并分別于24 h、48 h、72 h后用721分光光度計測定螺旋藻藻液的OD560值，比較碳酸氫銨不同時間防治輪蟲螺旋藻生長的差異。試驗期間日平均氣溫為 25～26℃。

2 結(jié)果和分析

2．1 由表1可以明顯看出：碳酸氫銨用量為500 mg/L時，半小時左右?guī)缀?00%的輪蟲個體完全喪失活性，碳酸氫銨用量為400～300 mg/L時則大概需要1．0～2．0 h；碳酸氫銨用量在250～200 mg/L時，經(jīng)過8～16 h殺蟲效果可達(dá)到95%以上；碳酸氫銨用量為150 mg/L時，即使在一天一夜后尚有10%以上的輪蟲個體存活。當(dāng)碳酸氫銨用量為50－100 mg/L時，根據(jù)本試驗觀察到的結(jié)果，24 h內(nèi)的輪蟲防治效果只有50%左右或者更低，很顯然這在螺旋藻大規(guī)模開放式養(yǎng)殖實踐中無實際應(yīng)用價值。

表1 碳酸氫銨不同用量對螺旋藻培養(yǎng)液輪蟲的防治效果Tab.1 The control efficiency of NH4HCO3by dose

2.2 圖1所示，碳酸氫銨用量為300 mg/L時，對螺旋藻群體的生長有一定的傷害和抑制作用，這種影響尤以最初24 h最為明顯（OD560增加值為負(fù)），其后逐步恢復(fù)，72 h后趨于正常，這一結(jié)果可能與NH4HCO3溶水后初期高濃度NH3的集中釋放、相對較高的NH4-N濃度產(chǎn)生一定的毒副作用抑制螺旋藻細(xì)胞生長或直接導(dǎo)致藻體死亡有關(guān)[9]；當(dāng)碳酸氫銨用量為150～200 mg/L時，螺旋藻群體生長效應(yīng)始終表現(xiàn)為正值，并在處理后24～48 h間出現(xiàn)一個明顯的增殖高峰，第3天生長趨緩，這無疑與NH4HCO3溶水后為螺旋藻細(xì)胞生長提供了適宜的NH4-N源所致；當(dāng)碳酸氫銨用量為250 mg/L時，螺旋藻群體的生長效應(yīng)雖然仍為正值，但小于150～200 mg/L處理，這表明在此濃度下，螺旋藻細(xì)胞的增殖已受到某種程度的影響，而且這種影響會延續(xù)（但有較大弱化）達(dá)48 h，第3天則完全恢復(fù)，這種先抑后揚(yáng)的生長過程應(yīng)該與NH4HCO3溶水后培養(yǎng)液中NH3和NH4-N的濃度隨著攪拌揮發(fā)和藻細(xì)胞吸收而發(fā)生改變有關(guān)。由此可見，施用碳酸氫銨作為螺旋藻培養(yǎng)液的添加物，在150～200 mg/L時對螺旋藻細(xì)胞的生長增殖有著相對較好的積極作用，但當(dāng)用量達(dá)到250～300 mg/L時，螺旋藻群體的生長增殖會受到相對不同程度的抑制和傷害。

2.3 圖2所示，碳酸氫銨不同時間防治輪蟲，螺旋藻的生長表現(xiàn)出一定的差異，這種差異主要出現(xiàn)在最初24 h內(nèi)，其后基本消失。這種差異現(xiàn)象的出現(xiàn)可能與螺旋藻的生長增殖特性和輪蟲的活動分布特點在白天、夜間有所不同有關(guān)。白天由于光照影響，輪蟲一般分散在螺旋藻培養(yǎng)液的中下層，而在夜間則喜聚于中上層，結(jié)合碳酸氫銨溶水后其水解產(chǎn)物NH3的揮發(fā)性質(zhì)來看，上午8:00-9:00時施用碳酸氫銨防治輪蟲較之19：00-20:00時防治處理在最初12 h內(nèi)的殺蟲效率可能會稍低，從而造成相對更多的藻體細(xì)胞損失。但由于總的防治效果在24 h后并沒有實質(zhì)性的差異（表1），因而24 h后兩種處理藻體生長的速度趨于一致。

圖1 碳酸氫銨不同用量對螺旋藻生長的影響Fig.1 The influence on spirulina growth of NH4HCO3

圖2 碳酸氫銨不同時間防治輪蟲螺旋藻生長的差異Fig.2 The influence on spirulina growth of NH4HCO3by time

3 討論

在螺旋藻大規(guī)模開放式培養(yǎng)過程中，面對復(fù)雜無序的自然環(huán)境及一些人為因素的影響，輪蟲的污染危害是不可避免的，其對螺旋藻產(chǎn)量的影響也是相當(dāng)大的，有時甚至是災(zāi)難性的?？紤]到螺旋藻產(chǎn)品主要作為人類健康營養(yǎng)食品，使用常規(guī)藥物（如硫酸銅、敵百蟲、敵殺死等）進(jìn)行防治，既存在嚴(yán)重的質(zhì)量安全隱患，又極易對螺旋藻細(xì)胞本身產(chǎn)生毒害[10]。NH4HCO3雖然也是一種化學(xué)合成物質(zhì)，但其分解過程中并無有害的中間產(chǎn)物，最終分解產(chǎn)物亦無毒、無害、無殘渣、無污染，既環(huán)保又安全。并且NH4HCO3水解過程中產(chǎn)生的HCO3-、CO2還可直接補(bǔ)充為螺旋藻生長所需的C源，NH4+則可直接補(bǔ)充為N源。因此，選擇碳酸氫銨防治輪蟲如果使用確當(dāng)對防治輪蟲和提高螺旋藻產(chǎn)量可以起到雙贏的效果。參照本文試驗結(jié)果，螺旋藻大規(guī)模開放式養(yǎng)殖過程中利用碳酸氫銨防治輪蟲的適宜用量（以殺蟲為主要目的）推薦為200 mg/L左右，此用量8～16 h內(nèi)防治效果可達(dá)95%以上，同時對螺旋藻群體的生長增殖幾乎不存在實質(zhì)性的影響。但在實踐中，這一用量應(yīng)根據(jù)培養(yǎng)液連續(xù)使用時間的長短，藻體細(xì)胞和培養(yǎng)液滲透壓差的大小（暴雨侵襲后短時間內(nèi)滲透壓差會加大），輪蟲危害程度的輕重，培養(yǎng)液中有機(jī)污染物的多少（藻細(xì)胞、微生物、浮游動植物、昆蟲等生物體的死亡和腐解及風(fēng)、雨、污水、灰塵、肥料等均可能導(dǎo)致有機(jī)污染物的增加），培養(yǎng)液N含量水平的高低，藻群體密度的大小及氣候等因素進(jìn)行調(diào)節(jié)。培養(yǎng)液連續(xù)使用時間越長（有害物質(zhì)積累多）、藻體和培養(yǎng)液滲透壓差越大（藻細(xì)胞易破裂）、有機(jī)物污染越重（藻細(xì)胞抗環(huán)境條件突變能力差）、藻群體密度越?。ㄔ寮?xì)胞吸收消耗的NH4-N總量相對較少）等，碳酸氫銨用量應(yīng)適當(dāng)降低，反之則可適當(dāng)增加。碳酸氫銨用量為150 mg/L時，一方面在處理后長達(dá)16 h內(nèi)有60%左右輪蟲還沒有被殺死，危害仍在相當(dāng)程度上持續(xù)擴(kuò)大，這將導(dǎo)致螺旋藻產(chǎn)量進(jìn)一步損失；另一方面雖然在處理24 h后防治效果亦可能近90%，但大面積進(jìn)行輪蟲防治時，碳酸氫銨質(zhì)量差異、人工操作均勻程度、培養(yǎng)液攪拌導(dǎo)致NH3的揮發(fā)、尤其是有效殺死輪蟲時間過程越長氣候更是變幻莫測（特別在多雨季節(jié)）等因素，都可能導(dǎo)致防治效果的下降。加之考慮到輪蟲極強(qiáng)的繁殖能力，選用這一劑量無疑存在著短時間內(nèi)輪蟲再度爆發(fā)危害的風(fēng)險，并由此還可能更容易產(chǎn)生輪蟲抗性的積累。盡管如此，實踐中這一劑量可以推薦在螺旋藻培養(yǎng)池尚未受到輪蟲污染或污染極其輕微時作為預(yù)防目的應(yīng)用。當(dāng)在螺旋藻池基礎(chǔ)培養(yǎng)液使用初期階段并且其N含量水平處于相對較低水平而藻細(xì)胞密度又相對較高時，如發(fā)生輪蟲嚴(yán)重危害，參照本文的試驗結(jié)果，筆者認(rèn)為碳酸氫銨施用量也可謹(jǐn)慎加大至250～300 mg/L，處理后伴以較長時間的連續(xù)性攪拌，這樣能夠達(dá)到盡快地消除并可以在一定程度上和一定時間內(nèi)根治輪蟲危害的目的。

輪蟲依靠體皮滲透作用進(jìn)行呼吸，需要較高的溶解氧。白天螺旋藻利用陽光進(jìn)行光合作用，吸收二氧化碳放出氧氣，再加上光線較強(qiáng)（輪蟲適宜光照為全暗-10 000 Lx），因此輪蟲較多分散于培養(yǎng)液的中下層；夜間螺旋藻呼吸耗氧，導(dǎo)致螺旋藻生長池內(nèi)溶解氧含量下降，加之輪蟲具有一定的趨光性，星月、燈光均可誘導(dǎo)其聚集于培養(yǎng)液的上表層?？紤]到NH4HCO3水解過程中在一定時間內(nèi)形成的高濃度NH3具有向上揮發(fā)的特性，因此試驗中19:00-20:00時進(jìn)行碳酸氫銨殺蟲處理后螺旋藻群體的生長表現(xiàn)在最初24 h要稍優(yōu)于8:00-9:00時處理。盡管如此，實踐中具體防治時間應(yīng)根據(jù)天氣狀況、輪蟲危害程度及便于人工操作等實際情況靈活安排。

[1]胡鴻均．螺旋藻生物學(xué)及生物技術(shù)原理[M]．北京：科學(xué)出版社,2003:1-36.

[2]張以芳,楊志雷．螺旋藻的研究和開發(fā)進(jìn)展[J]．海洋科學(xué),1998(5)：68-70．

[3]Zhang Xuecheng.Large scale cultivation of Spirulina in China:Today and Tomorrow[J].Biosystem Studies,1998(1):66-73.

[4]王丙春,毛煥蘭,焦?jié)杉t,等.程海螺旋藻養(yǎng)殖農(nóng)業(yè)氣象條件分析[J].云南地理環(huán)境研究,2009（6）：25-28.

[5]田立丹,王素英.常見廢水與螺旋藻生長的適配性研究[J].水產(chǎn)科學(xué),2011（6）：325-330.

[6]李榮冠,謝耀生.東山灣海水螺旋藻spirulina大面積養(yǎng)殖探討[J].福建水產(chǎn),1998（2）：11-16.

[7]梁象秋,方紀(jì)祖,楊和荃.水生生物學(xué)[M].北京：中國農(nóng)業(yè)出版社,2005:193-206.

[8]閆東春,閆俊浩,鄧延平.輪蟲危害的研究現(xiàn)狀[J].水利漁業(yè),2007（5）:105-107.

[9]李 博,康瑞娟,張 栩,等．銨鹽對螺旋藻生長的影響[J]．過程工程學(xué)報,2005(12)：684-687．

[10]于修舉.用硫酸銅殺滅輪蟲和原生動物的試驗[J].海洋科學(xué),1993（6）：12-14.