謝 勝 梅 妍

（昆明醫(yī)學(xué)院附屬昆華醫(yī)院，云南省第一人民醫(yī)院，昆明 650032）

糖尿病視網(wǎng)膜病變（Diabetic retinopathy，DR）是糖尿病最常見(jiàn)最嚴(yán)重的慢性并發(fā)癥之一，極具視力威脅。DR 是一種多因素的復(fù)雜疾病，其發(fā)病機(jī)制經(jīng)過(guò)多年的研究尚未完全明確，近年研究發(fā)現(xiàn)光感受器功能相關(guān)基因在糖尿病視網(wǎng)膜病變過(guò)程中有所表達(dá)，其中色素上皮細(xì)胞特異蛋白65（Retina pigment epithelia－specific protein 65，RPE65）突變可導(dǎo)致視網(wǎng)膜中視紫紅質(zhì)含量降低，相當(dāng)于視網(wǎng)膜長(zhǎng)時(shí)間處于暗環(huán)境中［1－4］，從而造成光感受器細(xì)胞不能對(duì)光發(fā)生反應(yīng)，到疾病晚期發(fā)生視錐和視桿細(xì)胞變性導(dǎo)致嚴(yán)重的視力喪失。實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)Rpe65 敲除小鼠在生后2～3周即可出現(xiàn)視錐細(xì)胞變性，且隨著年齡的增加視桿細(xì)胞也逐漸發(fā)生變性［5］。這種視網(wǎng)膜光損傷的易感性是由基因決定的，而Rpe65在其中起重要作用［6］。我們采用實(shí)時(shí)熒光定量多聚酶鏈反應(yīng)（RT－PCR）技術(shù)，初步分析Rpe65在不同病程糖尿病大鼠視網(wǎng)膜組織上的表達(dá)量。

1 材料與方法

1.1 糖尿病動(dòng)物模型

SD 大鼠32只，雌性，體重：56～460g（昆明醫(yī)學(xué)院動(dòng)物中心提供）。SPF 級(jí)GK2 型糖尿病大鼠32只，雌性，體重：98～442g（上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供）。動(dòng)物按標(biāo)準(zhǔn)試驗(yàn)動(dòng)物要求飼養(yǎng)。按糖尿病病程分為四組，即糖尿病4w 組、8w 組、16w組、24w 組，每組8只。對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組周齡相對(duì)應(yīng)分組，每組8只。

1.2 視網(wǎng)膜總RNA提取及純度檢測(cè)

取對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組各32只大鼠，血糖值范圍分別為5.2～6.7mmol／L（均值5.8mmol／L）和11.8～22.3mmol／L（均值17.9 mmol／L）。3%戊巴比妥按2ml／kg體重腹腔注射深麻醉后取視網(wǎng)膜。用TRIZOL試劑盒，按說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作提取總RNA。4%瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度儀檢測(cè)結(jié)果顯示RNA 含量及純度達(dá)到試驗(yàn)要求。

1.3 RT－PCR

分別取正常組、實(shí)驗(yàn)組樣本總RNA 各1ml，設(shè)計(jì)引物序列Rpe65F和Rpe65R 分別為5′－actgtcctcaccactaac－3′和5′－aggctcagatccaacttc－3′（分子量為106BP），GAPDHF 和GAPDHR 分別為5′－gtgacttcaacagcaactc－3′和5′－gtccagggtttcttactcc－3′，由上海生工公司合成引物。由此逆轉(zhuǎn)錄生成cDNA，并進(jìn)行RT－PCR測(cè)定。擴(kuò)增反應(yīng)完畢后根據(jù)融解曲線分析PCR 產(chǎn)物的特異性，由Light Cycler PCR 儀分析其Ct值，并與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較得到定量結(jié)果。采用相對(duì)雙Delta Ct法（DDCT／2－ΔΔCT）進(jìn)行結(jié)果分析，公式：2－ΔΔCT。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組測(cè)量指標(biāo)的比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)或配對(duì)樣本的t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＜0.01為差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

Rpe65和GAPDH 溶解曲線呈單一峰值，特異性較好，結(jié)果可靠；Rpe65和GAPDH 擴(kuò)增曲線呈S型，擴(kuò)增效果良好。實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組間的平均Ct值具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（見(jiàn)表1）。結(jié)果表明：RT－PCR 檢測(cè)視網(wǎng)膜內(nèi)Rpe65的表達(dá)，與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組糖尿病大鼠視網(wǎng)膜中Rpe65 的表達(dá)隨周齡的增加呈下降趨勢(shì)，即4W＞8W＞16W＞24W。

表1 對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組各周齡大鼠的Rpe6表達(dá)的定量PCR結(jié)果Table 1 The level of Rpe6expression of different aged rats in control and experiment groups

3 討論

Rpe65由Hamel等于1993 年發(fā)現(xiàn)，定位于染色體1p31，是視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞特異性表達(dá)、高度保守的蛋白序列。在視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞中大量特異性表達(dá)，尤其以視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞微粒體膜表達(dá)為主。其含有14 個(gè)外顯子，編碼533 個(gè)氨基酸，分子量為65KD，被認(rèn)為是催化全－反－視黃酯轉(zhuǎn)變成11－順－視黃醇的異構(gòu)酶之一，后者再經(jīng)過(guò)一系列代謝轉(zhuǎn)變成視紫紅質(zhì)，參與光信號(hào)的傳導(dǎo)過(guò)程［7］。

通常認(rèn)為糖尿病視網(wǎng)膜病變主要是視網(wǎng)膜微血管病變。然而，越來(lái)越多的證據(jù)表明，糖尿病視網(wǎng)膜病變出現(xiàn)微血管病變以前，神經(jīng)視網(wǎng)膜已有病變改變，即視功能損害早于微血管病變發(fā)生。研究顯示，早期糖尿病患者視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞和雙極細(xì)胞功能就已有異常改變［8］。在眼底血管出現(xiàn)熒光造影異常前就表現(xiàn)出視覺(jué)電生理、色覺(jué)和視野檢查的異常［9－10］。Kirwin等［11］應(yīng)用PCR和免疫組化實(shí)驗(yàn)技術(shù)顯示，Rpe65在糖尿病4周時(shí)表達(dá)降低，并隨病程持續(xù)下降至3個(gè)月后，證明在糖尿病早期，神經(jīng)膠質(zhì)和神經(jīng)元功能障礙已導(dǎo)致視覺(jué)損害。梅妍等［12］實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，糖尿病早期，代謝的異常已經(jīng)對(duì)視網(wǎng)膜光感受器的功能產(chǎn)生了影響。光感受器功能相關(guān)基因的表達(dá)異常有可能是糖尿病早期微血管病變發(fā)生前視力下降、色覺(jué)喪失、對(duì)比敏感度降低和視網(wǎng)膜電流圖異常的重要原因。電生理研究提示，早期糖尿病患者視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞功能就已有異常改變。形態(tài)學(xué)研究究也提示，神經(jīng)視網(wǎng)膜變性先于微血管損害發(fā)生［13－14］。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)檢測(cè)2 型糖尿病大鼠不同病程中Rpe65的表達(dá)量，探討其在2型糖尿病視網(wǎng)膜病變過(guò)程中的作用。結(jié)果顯示：與正常對(duì)照組相比，糖尿病組各期Rpe65表達(dá)下降，且隨著病程的延長(zhǎng)，表達(dá)逐漸降低。表明Rpe65 表達(dá)變化與DR 發(fā)生有關(guān)，其在視網(wǎng)膜上的表達(dá)水平與2型糖尿病模型大鼠的病程呈負(fù)相關(guān)性。提示糖尿病影響了Rpe65在糖尿病大鼠視網(wǎng)膜上的表達(dá)，這種表達(dá)的改變可能參與了糖尿視網(wǎng)膜病變的發(fā)生，并且這種表達(dá)的改變有可能是糖尿病視網(wǎng)膜病變發(fā)生發(fā)展的促進(jìn)因素之一，對(duì)糖尿病視網(wǎng)膜病變并非僅是微血管病變的觀點(diǎn)起到了一些支持作用，也為進(jìn)一步探索預(yù)防早期糖尿病視網(wǎng)膜病變的進(jìn)展和開(kāi)辟治療糖尿病視網(wǎng)膜病變的新途徑提供了一些新的線索。

［1］Rednlond TM，Yu S，Lee E，et al.Rpe65is necessary for production of 11－cis－vitamin A in the retinal visual cycle［J］.Nat Genet，1998，20：344.351.

［2］Hamel CP，Tsilou E，Pfeffer BA，et al.Molecular cloning and expression of RPE65，a novel retinal pig－ment epithelium－specific microsomal protein that is post－transcrip－tionally regulated in vitro［J］.J Biol Chem，2003；268：15751－15757.

［3］Nicoletti A，Wong DJ，Kawase K，et al.Molecular characterization of the human gene encoding an abundant 61kDa protein specific to the retinal pigment epithelium［J］.Hum Mol Genet，2005；4：641－649.

［4］Hamel CP，Tsilou E，Pfeffer BA，et al.A developmentally regulated microsomal protein specific for the pigment epitheliumof the vertebrate retina［J］.J Neurosci Res，2003；34：414－425.

［5］Znoiko SL，Rohrer B，Lu K，et al.Downregulation of conespecific gene expression and degeneration of cone photoreceptors in the rpe65－／－mouse at early ages［J］.Invest Ophthalmol Vis Sci，2005，46（4）：1473－1479.

［6］Wenzel A，Reme CE，WIilliams TP，et al.The Rpe65 Leu450Met Variation Increases Retinal Resistance agajnst Lightinduced Degeneration by Slowing Rhodopsin Regeneration［J］.J Neurosci，2001，21：53－58.

［7］Remond TM，Yu S，Lee E，et al.Rpe65is Necessary for Production of 11－cis－vitamin A in the Retinal Visual Cycle［J］.Nat Genet，1998。20：344－351.

［8］Greenstein VC，Holopigian K，Seiple W，et al.Atypical multifocal ERG responses in patients with diseases affecting the photoreceptors［J］.Vision Res，2004，44：2867－2874.

［9］Comi G.Evoked potentials in diabetes mellitus［J］.Clin Neurosci，1997.6：374－379.

［10］Nomura R，Terasaki H，Hirose H，et al.Blue－on yellow perimetry to evaluate S cone sensitivity in diabetics［J］.Ophthalmic Res，2000，23：69－72.

［11］Kirwin SJ，Kanaly ST，Hansen CR，et al.Retinal gene expression and visually evoked behavior in diabetic long evans rats［J］.Invest Ophthalmol Vis Sci.2011Sep 29；52（10）：7654－63.

［12］梅妍，周鴻鷹，項(xiàng)濤，等.糖尿病大鼠視網(wǎng)膜基因表達(dá)譜差異的初步分析［J］.中華醫(yī)學(xué)遺傳雜志，2005，22（05）：563－565.

［13］Studholme S.Diabetic retinopathy ［J］.J Perioper Pract，2008，18：205－210.

［14］Emerson MV，Lauer AK.Emerging therapies for the treatment of neovascular age－related macular degeneration and diabeticmacular edema［J］.BioDrugs，2007：21：245－255.