吳娟利，王兆品，包愛民 綜述

生物樣品中組胺含量測定方法的研究進展

吳娟利，王兆品，包愛民 綜述

(浙江大學醫(yī)學院神經(jīng)生物學系、衛(wèi)生部醫(yī)學神經(jīng)生物學重點實驗室、浙江省神經(jīng)生物學重點實驗室，浙江杭州310058)

神經(jīng)元性組胺參與了多種生理功能以及神經(jīng)精神疾病發(fā)病機制。測定生物樣品中組胺含量具有重要的臨床意義。文中將就測定組胺方法的相關(guān)研究進展作一綜述，并重點討論最常用和較為成熟的組胺測定方法，即高效液相色譜法研究方面進展。

組胺;色譜法，高壓液相;高效液相色譜法;腦脊髓液

［JZhejiang Univ(Medical Sci)，2012，41(6):681-688.］

神經(jīng)元性組胺僅僅由位于下丘腦后部的結(jié)節(jié)乳頭核產(chǎn)生，并向幾乎所有腦區(qū)投射。組胺主要介導覺醒—睡眠節(jié)律、認知和記憶、自主運動、應(yīng)激反應(yīng)等功能調(diào)節(jié)［1-3］。在多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病，例如多發(fā)性硬化癥［4］、阿爾茨海默?。?］、熱驚厥［6］、發(fā)作性睡?。?-8］、睡眠過度［9］等，都發(fā)現(xiàn)有腦內(nèi)組胺含量改變。因此，測定腦內(nèi)組胺含量對于研究上述生理機制和神經(jīng)精神疾病發(fā)病機制具有重要意義。腦脊液內(nèi)組胺濃度是公認的中樞組胺活性的重要指標［5］，而高效液相色譜法(high-performance liquid chromatography，HPLC)是近年來最常采用的測定組胺水平的方法。腦脊液中組胺含量很低，腦脊液采樣過程中存在著許多干擾因素影響HPLC測定，因此，目前尚未建立起穩(wěn)定可靠而簡單易行的腦脊液組胺測定方法。作者將就相關(guān)研究進展作一綜述，對可能采取的改進措施進行介紹和討論，旨在為改進腦脊液內(nèi)組胺測定方法提供參考依據(jù)。

1 組胺測定方法回顧

測定生物樣品例如血液、尿液、腦組織中組胺含量的方法主要包括放射性酶法(radioenzymatic assay，REA)、放射性免疫法(radioimmunoassay，RIA)、 酶 免 疫 法(enzymeimmunoassay，EIA)、氣相色譜法 (gas chromatography，GC)、毛細管電泳法(capillary electrophoresis，CE)、毛 細 管 電 泳 色 譜 法(capillary electrochromatography，CEC)和 HPLC法等［10-11］。其中REA、RIA和EIA基于抗原—抗體特異性反應(yīng)，關(guān)鍵技術(shù)是建立組胺的單克隆或者多克隆抗體。因為組胺是小分子半抗原，只具備抗原性而不具備免疫原性，因此將組胺修飾為免疫原［10］而生產(chǎn)高特異性的組胺抗體比較困難。應(yīng)用這些方法測定組胺含量存在著操作步驟繁瑣、交叉反應(yīng)等難題［11-14］。GC法測定組胺時容易遭受樣品中其它基質(zhì)成分的干擾、樣品殘留的影響［15］，以及 GC偶聯(lián)質(zhì)譜儀儀器昂貴，對操作人員專業(yè)技能要求高等不利因素［14］。CEC法綜合了HPLC的高選擇性和CE法的高效性，但是檢測靈敏度較低、遷移時間不夠精確，鮮有應(yīng)用該方法分析生物樣品中組胺含量的報道［10-11］。

2 HPLC法測定生物樣品中組胺含量

HPLC采用高壓輸出的液體為流動相，以小粒徑填料為固定相，同時在柱后連有高靈敏度的檢測器，從而實現(xiàn)對試樣的連續(xù)分析。該方法和高靈敏度檢測器耦合時具有良好的測定特異性和靈敏性［16］。1985 年，Yamatodani等人［17］建立了測定小鼠腦組織和人血漿中組胺含量的HPLC方法。該方法主要包括陽離子交換柱、鄰苯二甲醛(o-phthalaldehyde，OPA)柱后衍生、熒光檢測等系統(tǒng)，最低檢測限為 0.5 pmol/ml，日內(nèi)和日間差均小于3%。同時，該方法顯示了和REA方法測定結(jié)果的良好相關(guān)性(相關(guān)系數(shù)0.951)。隨后，不同研究組對這種HPLC方法從不同方面加以改進，包括檢測器、分離柱、衍生劑、流動相等，以期建立穩(wěn)定可靠、快速經(jīng)濟的組胺測定方法，介紹如下(并見表1)。

2.1 檢測器 HPLC的三大關(guān)鍵部件是輸液泵、色譜柱和檢測器。檢測器將從色譜柱流出的物質(zhì)組分轉(zhuǎn)化為可供檢測的信號，它決定著系統(tǒng)的靈敏度和精密度。HPLC檢測器有很多種類，例如紫外—可見光檢測器(ultravioletvisible detector，UV)、熒光檢測器(fluorescence detection，F(xiàn)LD)、電化學檢測器(electrochemical detector，ECD)、 化 學 發(fā) 光 檢 測 器(chemiluminescence detection，CLD)、質(zhì)譜儀(mass spectrometry，MS)等［11］。這些檢測器相互之間并不通用，不同的檢測器對測試系統(tǒng)的試劑體系也有不同要求，在建立HPLC方法時要優(yōu)先選擇合適的檢測器。

因為組胺在紫外—可見光范圍內(nèi)缺乏強烈的吸收帶，因此HPLC-UV法測定組胺時的靈敏度較低［10-11］。HPLC-CLD也同樣由于靈敏度的局限性而難以被應(yīng)用于測定生物樣品中的組胺含量［14］。Jensen 等人［18］曾用 HPLC-ECD 檢測大鼠腹膜內(nèi)肥大細胞中的組胺，結(jié)果顯示該法有較好的靈敏度，檢測限低于2 pmol/ml。然而，HPLC-ECD法要求在檢測前進行復雜的樣品處理，例如提取、洗脫和純化，而檢測過程又容易受到樣品內(nèi)雜質(zhì)、流動相中溶解的氧氣以及溫度變化等因素影響［11］，因此在一定程度上限制了該方法的應(yīng)用。HPLC-FLD法是目前最常用的檢測組胺的方法，對于痕量分析和復雜樣品基質(zhì)的檢測都較為理想。但是，組胺是弱熒光物質(zhì)，因此采用FLD檢測時，要對組胺進行衍生化處理而提高檢測靈敏度。HPLC-MS法則在近年逐漸被應(yīng)用于檢測生物樣品例如人腦脊液、小鼠毛發(fā)中的組胺含量［5，19-23］。該檢測器在鑒定分析物成分方面具有較高特異性，因為它除了記錄分析物保留時間，還對分析物的結(jié)構(gòu)信息進行描述，因此解決了區(qū)分具有相似理化性質(zhì)的胺類物質(zhì)的難題［21］。但是，目前HPLC-MS設(shè)備還非常昂貴，沒有被廣泛應(yīng)用。

表1 檢測生物樣品中組胺的高效液相色譜法條件Table 1 The conditions of HPLC methods for the determination of histamine levels in biological samples

2.2 分離柱、保護柱以及柱子的特性 通過HPLC從生物樣品中分離出組胺或者組胺衍生物是組胺檢測中的重要步驟。分離的質(zhì)量與色譜柱的填料類型、顆粒大小、pH范圍、分離柱內(nèi)徑和長度、柱子承受壓力等特性有著很大關(guān)聯(lián)。此外，在樣品分離前進行適當?shù)臉悠穬艋幚恚绻滔噍腿?Solid-phase extraction，SPE)對組胺的分離也很關(guān)鍵。

Miyamoto等人［24］用 SPE法對鼠腦組織進行凈化處理。他們采用一種陽離子交換色譜柱除去酸化的腦組織提取物中其它胺類物質(zhì)。但是，該方法對于組胺的回收率僅為(82.8±3.4)%，操作步驟也較繁瑣。Koyama等人［19］采用固相微萃取法對人嗜堿性細胞系進行凈化處理，操作時間短，所需樣品量少，有機溶劑消耗少，重現(xiàn)性也較好。該方法對于組胺的回收率達到(89.5～102.8)%，適合處理含有復雜基質(zhì)的樣品以及痕量組胺的測定。

Yamatodani等人［17］介紹了在 HPLC-FLC系統(tǒng)采用柱后OPA衍生陽離子交換劑法檢測生物樣品，例如人血漿和雄鼠腦組織中組胺含量。他們所采用的分步洗脫和最佳的柱后衍生條件能夠避免繁瑣的柱前樣品處理和/或衍生程序。該方法與REA法之間有著良好的相關(guān)性［17］，隨后被廣泛應(yīng)用于例如人腦脊液［6，8-9］、人腦組織［25］、鼠腦組織［26］等樣品中組胺含量測定。Itoh等人［12］則對該方法進一步加以改進，采用離子對—HPLC來代替陽離子交換—HPLC，使得組胺測定靈敏度提高了2～3倍，并同時能夠測定樣品中包含(R)α-甲基組胺時的組胺含量(陽離子交換劑—色譜法則無法將組胺和(R)α-甲基組胺分離)。

在HPLC離子交換柱反應(yīng)系統(tǒng)，當洗脫液中鹽離子濃度較高時柱子會很快失活。為了解決該問題，Kuruma等人［13］采用一種反向細徑柱(2.0 mm)代替離子交換柱，使得血漿中組胺檢測靈敏度提高將近4倍。2003年，Yoshitake等人［2］采用一種更細柱徑的微徑柱(1.0 mm)，對鼠腦微透析液中組胺進行檢測也獲得較理想結(jié)果。

近年來，超高效液相色譜儀(ultra performance liquid chromatography，UPLC)被逐漸應(yīng)用于生物樣品中組胺含量的測定［5，20-23］。UPLC借助了HPLC原理，通過使用小粒徑填料、超高壓輸液泵和高速檢測器而全面提高分離效能。

2.3 衍生方法 組胺分子含有兩個氨基基團，即-NH2和-NH。組胺作為原始態(tài)的胺是弱熒光物質(zhì)，因此采用熒光檢測器檢測組胺時需要對組胺進行熒光衍生。根據(jù)分離和衍生時間順序，衍生包括柱前、柱上及柱后衍生法。柱上和柱后衍生法更容易實現(xiàn)測試自動化，但是會導致衍生產(chǎn)物峰型變寬［10，15］而造成柱效降低。柱前衍生法需要在分析前對組胺或其衍生產(chǎn)物進行提取純化［12，24］，因而較為耗時。常用的熒光衍生試劑有OPA、丹酰氯、熒光胺、4-(1-芘)丁酸-N-羥基琥珀酰亞胺酯(4-(1-pyrene)butyric acid N-hydroxysuccinimide ester，PSE)等。丹酰氯所形成的衍生產(chǎn)物較為穩(wěn)定，但是衍生反應(yīng)較慢，即使在加熱條件下，這種衍生反應(yīng)也需要15 min以上。熒光胺介導的衍生反應(yīng)則只需要幾分鐘，但是熒光胺的衍生產(chǎn)物不穩(wěn)定。OPA與組胺的衍生反應(yīng)在2-巰基乙醇(2-mercaptoethanol，ME)存在的反應(yīng)體系里，室溫下30 s內(nèi)即可完成［15］，因此是目前最常用的熒光衍生試劑。

OPA對一級氨基基團(-NH2)具有選擇性，但是對組胺沒有特異性。用OPA進行衍生時容易受到內(nèi)源性單胺類物質(zhì)的干擾，因此測試前的樣品處理過程比較繁瑣、耗時［14］。此外，組胺與OPA的衍生物的穩(wěn)定性取決于OPA的濃度、pH值、反應(yīng)溫度以及反應(yīng)時間等［27］。高濃度的OPA可以導致HPLC測定色譜基線不穩(wěn)，柱效迅速降低［16］，因此需要將OPA濃度控制在一定范圍內(nèi)。堿性條件有利于組胺與OPA衍生反應(yīng)的進行，但是衍生產(chǎn)物卻不穩(wěn)定，反應(yīng)結(jié)束后應(yīng)及時采用磷酸［2，7，12］、硫酸［8］或鹽酸［27］進行酸化以終止反應(yīng)。研究發(fā)現(xiàn)，組胺在25℃、堿性條件下衍生化4 min后用酸終止反應(yīng)可以產(chǎn)生較多的衍生物，超過4 min后衍生產(chǎn)物持續(xù)減少，37℃時則衍生物的形成和分解速率都增加。因此，在分析大量樣品時，選擇25℃條件下衍生反應(yīng)4 min后用酸終止反應(yīng)的策略較為理想［27］。

PSE是芘類試劑，和通常的單體芘類衍生物在370～420 nm波長激發(fā)下產(chǎn)生熒光不同，PSE可以和一級和二級氨基基團反應(yīng)，形成具有激發(fā)態(tài)的聚合分子，在450～540 nm波長激發(fā)下產(chǎn)生熒光［2，14，28］。相對于 OPA，該衍生劑對組胺具有較好的特異性，且衍生產(chǎn)物較為穩(wěn)定。但是，該衍生劑所介導的衍生反應(yīng)比較緩慢，在100℃條件下加熱90 min進行。該方法已經(jīng)被用于測定人尿液［14］、大鼠腦［2］等生物樣品中組胺含量。迄今為止尚缺乏用于測定腦脊液組胺水平的研究。

值得注意的是，4-溴苯基磺酰氯(4-bromobenzenesulfonyl chloride，4-BBS)作為不同于上述熒光衍生劑的一種新型衍生劑，在組胺衍生化時僅能與一級氨基基團反應(yīng)，而不與咪唑核上的二級氨基基團反應(yīng)，從而避免形成穩(wěn)定性低、重現(xiàn)性差的多重衍生產(chǎn)物。該化學衍生反應(yīng)簡單、快速、特異性好。Bassetti等人［23］和Croyal等人［21］近年來分別以4-BBS為衍生劑，采用UPLC-MS/MS測定人腦脊液內(nèi)組胺含量，取得了較理想的結(jié)果。目前由于該套儀器設(shè)備較為昂貴，限制了它的廣泛應(yīng)用。

2.4 流動相的添加劑 在HPLC中，流動相中除了有機相外，還需要適量的添加劑，例如緩沖液、辛烷磺酸鈉(sodium octane sulfonate，SOS)、三乙胺(triethylamine，TEA)、醋酸、四氫呋喃(tetrahydrofuran，THF)、 三 氟 乙 酸(trifluoroacetic，TFA)等，以調(diào)節(jié)流動相的酸堿性，消除重疊峰、拖尾峰、肩峰等。磷酸鹽緩沖液具有較好的分離度，但是連續(xù)長期使用容易滋生微生物，造成色譜柱堵塞。醋酸鹽緩沖體系在分離度方面略遜于前者，但是對分離效果無顯著影響，并適于較長時間連續(xù)使用。SOS是一種離子對劑，所帶電荷與組胺和(R)α-甲基組胺相反，所以能相互結(jié)合形成疏水性離子對，在反向HPLC中非極性固定相中增加分配保留時間，增大容量因子，實現(xiàn)不同組分間的分離［7，12］。TEA 能夠防止組胺峰與試劑峰的重疊［14，21］。THF 作為一種質(zhì)子惰性溶劑或者非極性溶劑，加入到OPA/ME中可以穩(wěn)定組胺衍生產(chǎn)物［13，18］。

3 腦脊液中組胺含量的測定

有關(guān)HPLC測定腦脊液中組胺含量的研究目前還比較少，這和腦脊液內(nèi)組胺含量很低，樣本收集中存在多種干擾因素有關(guān)。研究者面臨著建立通用、可靠、便捷而經(jīng)濟的測定方案的挑戰(zhàn)。

Kiviranta 等人［6］采用了 Yamatodani等人［17］的較為經(jīng)典的組胺測定法，測定熱驚厥兒童腦脊液中組胺含量，發(fā)現(xiàn)不伴有驚厥發(fā)作的發(fā)熱兒童的腦脊液組胺濃度(0.69±0.16)pmol/ml明顯高于熱驚厥兒童(0.36 ± 0.07)pmol/ml。Nishino等人［8］測得正常對照人群的腦脊液組胺水平為(2.71 ±0.45)pmol/ml。該方法檢測限為 0.09 pmol/ml。Kanbayashi等［7］在該方案的基礎(chǔ)上采用反向分離柱代替陽離子交換柱，并在流動相中添加SOS和甲醇，檢測到正常人腦脊液中組胺濃度為(3.01±0.20)pmol/ml，研究檢測限為 0.09 pmol/ml。

Croyal等人［21］于 2011 年采用 UPLC-MS/MS法，測定發(fā)作性嗜睡病患者腦脊液中組胺含量。該方法以4-BBS為衍生劑進行柱前衍生，之后進行反向液相色譜分離，并采用質(zhì)譜儀檢測。他們測得實驗組和對照組人群的腦脊液組胺濃度分別為(0.39 ± 0.06)pmol/ml和(0.40±0.07)pmol/ml，檢測限為 0.0125 pmol/ml，因此是一種簡單、快速、高靈敏度和高選擇性的人腦脊液中組胺定量方法。Bassetti等人［23］也采用該方法對人腦脊液中組胺水平進行測定，有發(fā)作性睡病癥狀和無發(fā)作性睡病癥狀的白天過度嗜睡(excessive daytime sleepiness)患者組胺水平分別為(0.31 ±0.24)pmol/ml和(0.22 ±0.09)pmol/ml。

腦脊液收集過程中的各項條件也顯著影響腦脊液中組胺含量的測定。腦脊液的采集方式有腰椎穿刺法、腦池穿刺法等，前者相對簡單、安全，普遍應(yīng)用于臨床。Prell等人［29］報道腰椎穿刺法的腦脊液組胺含量能夠反映腦內(nèi)組胺的代謝變化，可能更具有臨床意義。腰椎穿刺前一晚到穿刺手術(shù)期間個體需要有良好的休息并禁食［30-31］。

Nishino等人［8］的研究結(jié)果表明，腦脊液的收集時間對組胺含量沒有顯著影響。9:00-13:00收集的腦脊液中組胺含量為(2.59±0.44)pmol/ml，13:00-15:00 收集的腦脊液中組胺含量為(2.97 ± 0.66)pmol/ml，兩者之間沒有統(tǒng)計學差異。臨床收集腦脊液大多都選擇在上午進行［30-32］。腦脊液樣品的反復凍融會嚴重影響組胺含量。Nishino等人［8］發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過一次凍融的腦脊液樣品中組胺含量減少大約6.9%，而兩次凍融后減少44.4%。因此，在腦脊液收集過程中應(yīng)立即進行分裝低溫保存，低溫包括 -80℃［5，7-9，21，23］和 -70℃［6，30，30］，直到測試前才取出解凍。目前尚缺乏關(guān)于樣品保存溫度對于腦脊液內(nèi)組胺含量影響的文獻報道。腦脊液中某些蛋白成分或者血液污染也會影響組胺含量。實踐中一般應(yīng)用60%高氯酸除蛋白［8，17］。被血液污染的腦脊液中組胺含量明顯升高［7-9］。因此，對于所收集的腦脊液樣品除了需要在視覺上排除被血液污染，還需要進行白細胞和紅細胞計數(shù)。只有白細胞數(shù)量少于5×106/L［6，31］和紅細胞數(shù)量少于 5 × 108/L［31］的腦脊液樣品方可用于組胺含量測定。

4 結(jié)語

測定腦脊液中組胺含量，對于研究組胺參與神經(jīng)精神系統(tǒng)的生理和病理過程具有重要臨床意義。由于腦脊液中組胺含量很低以及腦脊液樣本收集過程存在諸多影響組胺測定的因素等原因，目前尚未建立起可靠、便捷、經(jīng)濟適用的腦脊液組胺測定方法。常用的HPLC測定方法在分離柱的特點、衍生劑、檢測器等方面都存在很大的改進空間，而建立標準的腦脊液樣本采集方法也是提高腦脊液組胺測定效果的關(guān)鍵因素。UPLC-MS/MS測定組胺方法由于價格昂貴目前還未能得到廣泛應(yīng)用，但是我們相信，該方法可能會成為測定腦脊液中組胺含量的標準方法之一。

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Progress in determination of histamine levels in biological samples

WU Juan-li，WANG Zhao-pin，BAO Ai-min
(Department of Neurobiology，Key Laboratory of Medical Neurobiology of Ministry of Health of China，Zhejiang Province Key Laboratory of Neurobiology，Zhejiang University School of Medicine，Hangzhou 310058，China)

Neuronal histamine is crucially involved in a number of physiological functions as well as in neuropsychiatric diseases.Determination of histamine in biological samples is thus of importance in the clinical studies.The aim of this review is to summarize the progress or effort made in this field，with focus on the high-performance liquid chromatography.

Histamine; Chromatography，high pressure liquid; High-performance liquid chromatography;Cerebrospinal fluid

R 446.14

A

1008-9292(2012)06-0681-08

http:∥www.journals.zju.edu.cn/med

10.3785/j.issn.1008-9292.2012.06.013

2011-12-09

2012-02-07

浙江省科技廳計劃項目(2009C34020);國家自然科學基金項目(30970928).

吳娟利(1976-)，女，博士研究生，專業(yè):神經(jīng)生物學.

包愛民(1965-)，女，理學博士，教授，博士生導師，從事神經(jīng)精神疾病的神經(jīng)生物學發(fā)病機制的研究;E-mail:baoaimin@zju.edu.cn

［責任編輯 張榮連］