柴 健，張 潔，張 立

(天津市海河醫(yī)院，天津 300350)

利福平(rifampicin，RFP)是肺結(jié)核患者首選藥物之一，屬肝藥酶誘導(dǎo)劑，其血藥濃度個(gè)體差異很大，長(zhǎng)期服用可引起t1/2縮短，血藥濃度降低［1］，有些患者臨床治療效果不顯著。利福噴丁(rifapentine，RFT)是一種新的長(zhǎng)效利福霉素類抗生素，與RFP相比，其抗菌譜相似，不良反應(yīng)更少，但其肝毒性仍較大，尤其在肝臟損傷的結(jié)核患者中存在明顯的個(gè)體差異，為使兩藥更合理地應(yīng)用于臨床，故對(duì)其臨床的血藥濃度進(jìn)行監(jiān)測(cè)。在實(shí)際工作中，RFP和RFT的治療藥物監(jiān)測(cè)在抗結(jié)核藥物中占了相當(dāng)大的比例。由于RFP和RFT屬同類藥，其結(jié)構(gòu)和理化性質(zhì)有許多相似之處，固可以考慮在相同的流動(dòng)相條件下用內(nèi)標(biāo)進(jìn)行測(cè)定。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 LC－10A高效液相色譜儀，包括LC－10A泵，SPD－10A紫外－可見(jiàn)檢測(cè)器(日本島津);N－2000色譜工作站(浙江大學(xué)智能工程研究所);KDC－16H高速離心機(jī)。

1.2 試藥 RFP對(duì)照品(中國(guó)生物制品鑒定所，批號(hào)130496－200001)、RFT對(duì)照品(無(wú)錫山禾集團(tuán)第一制藥有限公司提供，批號(hào)200507046);對(duì)硝基酚(天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所，批號(hào)20040706);甲醇(天津市康科德科技有限公司，色譜純);水為色譜水樣(天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所);冰乙酸(天津市運(yùn)盛化學(xué)試劑科技有限公司，分析純)。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 色譜柱:Shim－pack VP－ODS(150 mm ×4.6 mm，5 μm);流動(dòng)相:甲醇 － 水(70∶30)，用乙酸調(diào)pH=7;流速:1 ml/min;檢測(cè)波長(zhǎng):336 nm。

2.2 溶液制備

2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)液的配制 精密稱取RFP和RFT對(duì)照品各約25 mg，置于25 ml量瓶中，用甲醇溶解，定容，配成濃度為1 mg/ml的標(biāo)準(zhǔn)液。

2.2.2 內(nèi)標(biāo)液的制備 精密稱取對(duì)硝基酚1 mg，加甲醇溶解并稀釋至10 ml，充分混勻后再取500 μl，加甲醇定量至50 ml，得1 μg/ml對(duì)硝基酚甲醇溶液。

2.2.3 樣品溶液的制備 用加液器準(zhǔn)確吸取40 μl含藥血清(樣品取自不同患者)放入帶蓋塑料小試管內(nèi)，加入內(nèi)標(biāo)液200 μl，混勻，靜置5 min后，于高速離心機(jī)10 000 r/min離心5 min，取上清液于450 μm濾頭過(guò)濾后即得。

2.3 線性與范圍 取空白血清1 ml，加入適量的RFP和RFT標(biāo)準(zhǔn)品，制得含藥血清，使其濃度分別為:0.25、0.5、1.0、2.0、4.0、8.0、10.0、16.0 和 32.0 μg/ml。按上述“2.2.3”項(xiàng)下處理，記錄峰面積，用峰面積對(duì)內(nèi)標(biāo)峰面積的比值作縱坐標(biāo)，血清樣品的濃度作橫坐標(biāo)作直線回歸，得RFP回歸方程 Y=1.16 X－8.25(r=0.999 5)，最低檢測(cè)限為 0.25 μg/ml;利福噴丁回歸方程 Y=9.54 X+1.5(r=0.999 6)，最低檢測(cè)限為 0.25 μg/ml。

2.4 精密度與回收率的測(cè)定 測(cè)定配制的RFP和RFT濃度分別為 0.5、4 和 16 μg/m l的標(biāo)準(zhǔn)血樣，按“2.2.3”項(xiàng)下操作，測(cè)定其日內(nèi)變異和日間變異及回收率，結(jié)果分別見(jiàn)表1和表2。

表1 利福平的精密度與回收率(n=5)

表2 利福噴丁的精密度與回收率(n=5)

2.5 樣品測(cè)定 取“2.2.3”項(xiàng)下樣品溶液60 μl，進(jìn)樣分析。色譜圖見(jiàn)圖1，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 利福平和利福噴丁樣品測(cè)定結(jié)果

2.6 干擾試驗(yàn) 在空白血清中加入合并使用抗結(jié)核藥異煙肼和比嗪酰胺，照樣品相同方法處理測(cè)定，結(jié)果表明其對(duì)RFP和RFT的測(cè)定無(wú)干擾。

圖1 空白血漿(A)樣品血漿(B)HPLC測(cè)定譜圖3 討論

3.1 流動(dòng)相的選擇 在本試驗(yàn)中分別配制含不同比例甲醇的流動(dòng)相，經(jīng)多次實(shí)驗(yàn)，選用甲醇－水(67∶33)(用HAc調(diào)pH到7.0)作為流動(dòng)相，能使RFP與RFT及內(nèi)標(biāo)較好的分離，三者出峰時(shí)間分別為2.9、3.8和 4.7 min ，出峰快，而且峰形較好。

3.2 內(nèi)標(biāo)物的選擇 文獻(xiàn)報(bào)道［2］選用地西泮、硝西泮及氯氮平為內(nèi)標(biāo)，但由于前兩者和藥峰分離不好，氯氮平對(duì)日光較敏感不易貯存而未選用，本文選用對(duì)硝基酚為內(nèi)標(biāo)，該物質(zhì)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，易于獲得，出峰快，與藥峰分離較好，縮短了檢測(cè)時(shí)間。

3.3 樣品的處理 因RFP易被氧化為醌式RFP。因而選用直接沉淀法測(cè)定，沉淀劑后的上清液用0.45 μm微孔濾膜過(guò)濾后進(jìn)樣。RFP遇光易變質(zhì)，水溶液易氧化，中性時(shí)最穩(wěn)定。而在堿性條件下RFP很容易被氧化成醌式RFP，較強(qiáng)酸性條件下易被分解成3－甲酰利福霉素SV。因此本實(shí)驗(yàn)選用pH 7.0的流動(dòng)相。

3.4 線性范圍 RFP的治療濃度范圍為0.5～10 mg/L［3］、空腹一次服 RFT 400 mg，血藥峰濃度約為16.8 μg/ml;在 4 ～ 12 h 間可保持 15.35 ～ 16.89 μg/ml;48 h 尚有 5.4 μg/ml，t1/2平均為 18 h，濃度均在線性范圍之內(nèi)，適用于本法測(cè)定。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)采用反相高效液相色譜法建立了同時(shí)測(cè)定人血漿中RFP和RFT含量的方法，該分析方法，樣品處理簡(jiǎn)單、快速，方法回收率高，重現(xiàn)性好。在實(shí)際工作中，對(duì)RFP和RFT先后進(jìn)行治療藥物監(jiān)測(cè)，則可以節(jié)省許多時(shí)間和試劑。

1 陳新謙，金由豫.新編藥物學(xué).第17版.北京:人民衛(wèi)生出版社，2011:107－108

2 陳賽貞，袁國(guó)平，胡大平，等.反相高效液相色譜法測(cè)定人血中利福平濃度.藥學(xué)實(shí)踐雜志，2000，18(4):225

3 陳剛，談恒山，卓海通，等.治療藥物監(jiān)測(cè).北京:人民軍醫(yī)出版社，1998:482