朱田田 ，杜 弢 ，陳紅剛 ，晉 玲 ，林 麗 ，侯 嘉

（1.甘肅中醫(yī)學(xué)院藥學(xué)系，甘肅蘭州730000；2.甘肅省高校中（藏）藥化學(xué)質(zhì)量研究省級重點(diǎn)實驗室，甘肅蘭州730000）

鐵棒錘為毛茛科烏頭屬植物鐵棒錘（Aconitum pendulum Busch）的干燥塊根[1]。其性熱，味辛苦，有大毒，具有祛風(fēng)除濕、消腫止痛、活血祛瘀之功效[2]。其長期以來一直以野生資源入藥，隨著市場需求的增加，人工馴化栽培已顯得日益迫切。經(jīng)調(diào)查，目前甘肅省僅永登縣有少量的人工種植，其種子來源于野生，在栽培群體中有黃花和紫花2種類型，從表型上看，二者有區(qū)別，但僅從形態(tài)學(xué)方面不能說明二者的真正差異性[3]。因此，對其進(jìn)行遺傳差異分析十分必要，可為進(jìn)一步選育產(chǎn)量高、品質(zhì)好的新品種提供遺傳基礎(chǔ)。

RAPD（Random Amplified Polymorphic DNA，隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA）技術(shù)自1990年由Williams等發(fā)展起來后，因其快速、靈敏、程序簡便等優(yōu)點(diǎn)，短時間內(nèi)被廣泛應(yīng)用于基因定位、連鎖圖的建立、品系（種）鑒別等方面[4-7]。其基本原理是采用隨機(jī)序列較短的單個引物，以提取的基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，擴(kuò)增產(chǎn)物可在瓊脂糖凝膠電泳中分離成不同大小的DNA片段，遺傳差異越大的品種其擴(kuò)增產(chǎn)物的區(qū)別越明顯。本研究擬利用RAPD技術(shù)對2種不同花色鐵棒錘進(jìn)行遺傳分析，從分子水平闡明二者的差異。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料 2008年8月，在甘肅省永登縣采集不同花色鐵棒錘的新鮮葉片，置于冰盒中帶回實驗室，儲存于低溫冰箱（-40℃）中；9月采集種子，自然干燥后放入紙袋保存于實驗室陰涼干燥處。植物樣品均由甘肅中醫(yī)學(xué)院生藥實驗室林麗高級實驗師鑒定。

1.1.2 儀器設(shè)備 數(shù)顯恒溫水浴鍋（HH-S24），臺式高速冷凍離心機(jī)（TGL16M），電泳儀（DYY-7），PCR 擴(kuò)增儀（PE-2400），渦旋混合儀（WH-3），紫外分光光度計（UV-759），凝膠成像系統(tǒng)（Bio-Rad），等。

1.1.3 主要試劑 CTAB，EDTA，Tris，PVP，β- 巰基乙醇，均購于北京鼎國生物技術(shù)有限責(zé)任公司；RNA 酶，瓊脂糖（Agarose），EB，PCR 相關(guān)試劑，均為上海生工生物工程有限公司產(chǎn)品；隨機(jī)引物，購于北京博邁德科技發(fā)展有限公司；其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 基因組DNA的提取及濃度檢測 基因組DNA提取采用CTAB法[8-12]，具體步驟為：稱取黃花和紫花鐵棒錘新鮮葉片各150 mg和干燥種子各30 mg置于潔凈干燥研缽中，加入適量PVP，與液氮共研成細(xì)粉后迅速轉(zhuǎn)入2 mL離心管中；加入800 μL經(jīng)65℃預(yù)熱的CTAB提取緩沖液（2%CTAB，20 mmol/L EDTA（pH 值為 8.0），100 mmol/L Tris-HCl（pH 值為 8.0），1.4 mol/L NaCl，2%β-巰基乙醇），充分混勻，65℃水浴40 min，期間每隔10 min顛倒混勻1次；冷卻至室溫后加入等體積的氯仿/異戊醇（24∶1），輕輕顛倒混勻后靜置5 min，12 000 r/min離心10 min；仔細(xì)吸取上層水相至新離心管中，重復(fù)此步驟2～3次，直到分界層無白色沉淀為止。取上清液于新的離心管中，加入0.7倍體積的異丙醇，10 000 r/min離心2 min；將離心管中上清液倒掉后倒置于紙巾上10 min，充分吸出水分后，加300 μL去離子水，渦旋混勻，使沉淀物溶于其中，65℃水浴5 min，充分溶解DNA后加入4 μLRNA酶（10 mg/mL），37 ℃水浴 10 min，除去RNA；再加入2/3體積的異丙醇，1/10體積的5 mol/L乙酸鈉輕輕混勻，于-20℃放置30 min沉淀DNA；12 000 r/min離心10 min，小心倒掉上清液，保留DNA沉淀于管底，加70%乙醇700 μL洗滌沉淀2～3次；室溫干燥后加入130 μL TE緩沖液溶解DNA沉淀，并保存于4℃冰箱中備用（-20℃長期保存）。

基因組DNA電泳檢測：取5 μLDNA樣品與1 μL TE緩沖液混勻后點(diǎn)樣于0.8%瓊脂糖凝膠孔，電泳緩沖液為1×TBE溶液，175 V電壓下電泳25 min左右，EB（溴化乙錠）染色，用凝膠成像系統(tǒng)照相，保存。

DNA濃度和純度檢測：用無菌去離子水（57 μL）將基因組 DNA母液（3 μL）稀釋 20倍后，使用紫外分光光度計測定在260，280 nm處的紫外吸收值。根據(jù)A260/A280的值判斷總DNA純度，并計算其濃度。

1.2.2 RAPD-PCR擴(kuò)增及電泳檢測 采用20條隨機(jī)引物對提取的基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系為25 μL，含20 mmol/L Mg2+的Buffer 2.5 μL，10 mmol/L dNTP 0.62 μL，10 μmol/L 引物 1.25 μL，2 U/μL Taq 酶 0.3 μL，DNA 模板60 ng。擴(kuò)增程序：94℃預(yù)變性4 min；94℃變性50 s，37 ℃退火 30 s，72 ℃延伸 60 s，40 個循環(huán)；72℃延伸10 min，4℃保存。擴(kuò)增產(chǎn)物在1.2%瓊脂糖凝膠上電泳，在凝膠成像系統(tǒng)下觀察、拍照。

2 結(jié)果與分析

2.1 基因組DNA電泳檢測結(jié)果

鐵棒錘2種不同組織提取的基因組DNA 瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果如圖1所示。

圖1表明，從亮度看，采用CTAB法從鐵棒錘的新鮮葉片和干燥種子中均可提取出基因組DNA，但從種子中得到的電泳譜帶明亮程度較新鮮葉片暗很多，說明從種子中提取的總DNA量低，而葉片提取的量高；從2種材料中提取的基因組DNA的電泳條帶均比較整齊無拖尾，點(diǎn)樣孔附近無雜質(zhì)污染，說明CTAB法提取的DNA純度高、質(zhì)量好，比較適用鐵棒錘基因組DNA的提取。

2.2 基因組DNA紫外分光光度計檢測結(jié)果

對2種不同鐵棒錘組織中提取的基因組DNA進(jìn)行紫外檢測分析（表1）表明，2種材料中提取的基因組DNA的A260/A280值均未達(dá)到1.8，說明所得到的DNA在不同程度上都含有一些雜質(zhì)，如蛋白質(zhì)、多酚及其他小分子物質(zhì)等，但從總體看，其A260/A280值均在1.69以上，這已能滿足對DNA模板質(zhì)量要求相對比較低的RAPD-PCR擴(kuò)增；2種材料提取的基因組DNA質(zhì)量濃度為56～109μg/mL，按每次PCR的DNA用量為50ng計算，從數(shù)量上可以滿足大量PCR擴(kuò)增的需要。

表1 不同植物材料基因組DNA的純度和質(zhì)量濃度

2.3 RAPD-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物檢測結(jié)果

20條隨機(jī)引物中共有3條能擴(kuò)增出條帶，即 E68629，E68631，E68636，其中，引物 E68629的擴(kuò)增產(chǎn)物清晰穩(wěn)定，可用于鐵棒錘遺傳差異分析。從圖2可以看出，2種花色的鐵棒錘RAPD擴(kuò)增產(chǎn)物具有一定的差異性，二者在1 500 bp處有共同條帶出現(xiàn)，紫花鐵棒錘在1 250，750 bp處有2條特異帶，而黃花鐵棒錘在1 000 bp處有1條特異帶出現(xiàn)。說明二者存在遺傳學(xué)差異。

3 討論

CTAB法是植物基因組DNA提取的有效方法之一，對于藥用植物鐵棒錘也不例外。目前，從新鮮葉片中提取基因組DNA是大多數(shù)研究者的首選，但前提條件是樣本必須足夠新鮮，否則得到的DNA會產(chǎn)生不同程度的降解，而如何保持葉片新鮮成為樣品采集過程中的難題。因此，在采樣地點(diǎn)較遠(yuǎn)、葉片不易保存的情況下，改變樣品采集部位可解決此問題。除葉片外，植物體其他組織都能提取出DNA，如種子、花粉等，尤其種子中常貯藏較多的蛋白和淀粉，一般不影響基因組DNA的提取效果[13]，這與本研究結(jié)果一致。

2種不同花色的鐵棒錘除了在形態(tài)學(xué)上有差異外，經(jīng)過RAPD分析得知，其擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分離的DNA片段有區(qū)別，除了有1條共同帶外，紫花和黃花鐵棒錘還分別出現(xiàn)了2條和1條特異帶，說明二者的基因型不同，其在遺傳學(xué)上也具有一定的差異性。但由于供試材料單一，能夠擴(kuò)增出條帶的隨機(jī)引物數(shù)量較少，不能滿足遺傳多態(tài)性和遺傳距離的分析，這也是今后研究中需要解決的問題。

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