李 濤，李玉華，李潤生，桂亞平，卞崔冬，黃盛松，吳登龍

1上海市同濟醫(yī)院泌尿外科 200065;2上海市計劃生育科學研究所

介紹前列腺癌是威脅男性健康主要疾病之一，美國2011年前列腺癌在男性新發(fā)腫瘤中排名第一位;死亡率，但近年來由于經(jīng)濟水平的提高和生活方式的改變以及男性平均壽命的延長，前列腺癌的發(fā)病率呈現(xiàn)不斷上升的趨勢，嚴重影響了男性的健康［2］，目前正在探討有效的藥物治療的方法。5α-還原酶抑制劑-非那雄胺(finasteride)已有報道對前列腺癌細胞有較好的抑制作用，另一種新型的5α-還原酶抑制劑-依立雄胺(epristeride)已在我國應用在前列腺增生的治療，經(jīng)過臨床和基礎研究發(fā)現(xiàn)其療效快于非那雄胺，但其對前列腺癌是否有治療和預防作用目前還缺乏實驗和臨床的資料，本研究主要探討依立雄胺是否可以在體外影響雄激素非依賴型前列腺癌細胞株DU-145的增殖和凋亡，為依立雄胺應用在前列腺癌的預防和治療中打下實驗基礎。

1 材料與方法

1.1 依立雄胺溶液的制備和保存

依立雄胺由中科院藥物研究所提供，純度為99.9%的白色粉末狀物質，將依立雄胺粉末溶解在無水乙醇中，配成20 mmol·L-1儲備液后方在-20℃的冰箱中保存?zhèn)溆?，實驗是用細胞培養(yǎng)液稀釋成所需要的濃度。

1.2 細胞培養(yǎng)

激素非依賴型前列腺癌細胞株DU-145購于中科院細胞所。將細胞培養(yǎng)在含有10%進口胎牛血清，青、鏈霉素的 DMEM(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)細胞培養(yǎng)液中，37℃，5%CO2條件下培養(yǎng)，細胞呈現(xiàn)貼壁生長，用0.25%的胰酶進行消化和傳代。

1.3 細胞形態(tài)學觀察

DU-145 細胞經(jīng)過 2.5，5，10，20 和 40μM 依立雄胺作用3天后，用普通倒置顯微鏡進行細胞形態(tài)學的觀察。

1.4 黃酰羅丹明B法(SRB法)測定DU-145細胞生長曲線

DU-145細胞以每孔5X104接種于24孔板中，于CO2培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)，待細胞貼壁后，分別加入含有2.5，5，10，20 和 40μM 依立雄胺的 DMEM培養(yǎng)液，對照組用含0.5% 的無水乙醇 DMEM 培養(yǎng)液，從換液次日起，每天每個劑量組取3個平行孔進行實驗，細胞計數(shù)求均值，連續(xù)7 d。參照SKehan的方法，細胞培養(yǎng)結束后，取出培養(yǎng)板，不除去培養(yǎng)液，每孔加入50%(質量/體積)的三氯乙酸(ACT)50 μL固定細胞。ACT的終濃度為10%，輕輕地加在每孔液面上，靜置5 min后4℃冰箱中放置1h，培養(yǎng)板各孔用去離子水沖洗沉淀5遍，以去除ACT。甩干，空氣干燥至無濕跡。每孔加0.4%(質量/體積)的SRB100 μL，室溫放置10 min，棄去各孔內(nèi)液體后用1%乙酸沖洗5遍，去除未結合的染料，空氣中干燥后用pH為10.5，10 mmol/L unbuffered Tris base(三羥甲基胺基甲烷)150 μL溶解萃取，在平板振蕩器上振蕩10 min，在LP400酶標儀測定吸光度A 值，檢測波長490 nm，540 nm，564 nm，630 nm，每波長測一A值，再加用參考波長630 nm再測其A值。A值=細胞孔A值-無細胞對照孔A值。取3復孔讀數(shù)均值。

1.5 流式細胞儀測定依立雄胺對DU-145細胞的周期阻滯

將DU-145細胞接種于50 mL培養(yǎng)瓶中常規(guī)培養(yǎng)，待細胞貼壁后，分別加入含有不同濃度依立雄胺的DMEM培養(yǎng)液，對照組用含0.5% 的無水乙醇DMEM培養(yǎng)液，培養(yǎng)72 h后，用胰酶消化，PBS漂洗，調整細胞密度為1×109L-1，用70% 預冷乙醇吹打均勻，4℃固定12 h以上。PBS洗滌去乙醇，1 000 rpm，離心5 min，洗兩遍。0.5 ml PBS重懸細胞，加入PI(碘化丙啶)和 RNaseA至終濃度50 μg/ml，37℃ 溫浴30 min。用流式細胞儀測定周期

1.6 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 15統(tǒng)計軟件包進行統(tǒng)計分析，P＜0.05為有統(tǒng)計學差異。

2 結果

2.1 細胞形態(tài)學觀察

DU-145 細胞在 2.5，5，10 μM 依立雄胺作用 3 d后，沒有觀察到有明顯的細胞形態(tài)學的變化，但在20 μM 和40 μM 的依立雄胺作用DU-145細胞3 d后，DU-145細胞由梭形變?yōu)閳A形，繼而皺縮，部分細胞懸浮于培養(yǎng)液中，少數(shù)細胞的細胞膜出現(xiàn)破裂。另外，發(fā)現(xiàn)依立雄胺對細胞增殖呈現(xiàn)濃度依賴性的抑制作用(見圖1)。

2.2 依立雄胺對DU-145細胞生長的影響

實驗結果如圖2所示，經(jīng)過依立雄胺處理過的細胞都受到不同程度的抑制作用，隨著依立雄胺濃度的不斷增加，這種抑制作用越來越明顯，在20 μM和40 μM的依立雄胺作用DU-145細胞7 d后其細胞抑制率都達到了90%以上。

2.3 依立雄胺對DU-145細胞周期阻滯分析結果

用依立雄胺作用DU-145細胞72 h后，碘化丙啶染色后發(fā)現(xiàn)，依立雄胺對DU-145呈現(xiàn)明顯的濃度依賴地周期阻滯作用，見圖3。

3 討論

5α-還原酶可以使得睪酮轉化成活性更強的二氫睪酮［3］。5α-還原酶有兩種亞型，每一種亞型都有單獨基因編碼［4］。Ⅰ型酶主要分布在人肝臟、皮膚、皮脂腺、睪丸和大多數(shù)毛囊中;Ⅱ型酶在包皮、胡須、頭發(fā)毛囊和前列腺中［5］。Ⅱ型 5α-還原酶主要在前列腺組織的基質細胞、基底上皮細胞中表達［6］。非那雄胺可以競爭性抑制Ⅱ型5α-還原酶，對Ⅰ型5α-還原酶作用微弱。依立雄胺是一種新型的5α-還原酶抑制劑，在體外有較強的抑制Ⅱ型5α-還原酶活性的作用(Ki=25.1 nmol·L-1)，從而有可能抑制前列腺癌的生長［7，8］。在本研究中已初步驗證，依立雄胺能在較高濃度下體外抑制前列腺癌細胞的生長，其機制可能為依立雄胺抑制雙氫睪酮(DHT)的生成［8］以及依立雄胺對DU-145細胞周期阻滯作用。Schafhauser等［9］在裸鼠的前列腺癌模型中給予裸小鼠口服25 mg/kg-1依立雄胺21天后，前列腺癌體積和PSA濃度均顯著下降，但不如去勢組的下降明顯。在老年Beagle犬中，孫祖越等［10］亦報道依立雄胺能降低Beagle犬前列腺中PSA和DHT的表達水平。此外，依立雄胺能改變前列腺局部的一些生長因子水平，如胰島素樣生長因子、轉化生長因子和表皮生長因子［11，12］，因而也可能抑制細胞的生長。

圖1 不同濃度依立雄胺對前列腺癌細胞株DU-145的抑制作用Fig 1 Inhibiting effect of different concentration of epristeride on human prostate carcinoma cell line DU-145

圖2 不同濃度依立雄胺對前列腺癌細胞株DU-145增值的抑制率Fig 2 Inhibiting effect ratio of different concentration of epristeride on human prostate carcinoma cell line DU-145

圖3 不同濃度依立雄胺對前列腺癌細胞株DU-145的周期阻滯作用Fig 3 Cycle retardation of different concentration of epristeride on human prostate carcinoma cell line DU-145

Lamb 等［13］認為，依立雄胺對于 5α-還原酶活性較低的前列腺癌的抑制作用會更好，它能將DHT降低到與去勢一樣的水平。本實驗的研究結果提示，依立雄胺對于已分化、未轉移的前列腺癌，可能具有一定的的控制治療作用。本研究對利用5α-還原酶在前列腺癌的預防和治療等方面進行了一些初步探討打下了實驗基礎，對依立雄胺等5α-還原酶抑制劑在預防以及治療前列腺癌的機理方面將進行進一步深入地研究。

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