胡 弢，周雪艷，趙國(guó)群

(河北科技大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，河北石家莊 050018)

固定化葡萄糖異構(gòu)酶活化條件對(duì)其酶活的影響

胡 弢，周雪艷，趙國(guó)群

(河北科技大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，河北石家莊 050018)

固定化葡萄糖異構(gòu)酶在使用前需先進(jìn)行活化，從而使酶發(fā)揮其最佳催化功效。本文從糖液濃度、溫度、pH、活化時(shí)間和金屬離子五個(gè)方面研究了活化條件對(duì)GENSWEETTMIGI－SA固定化葡萄糖異構(gòu)酶酶活的影響。該酶的最適活化條件為:葡萄糖液濃度60%、溫度55℃、pH 7.5、時(shí)間4h。經(jīng)此條件活化之后，其酶活達(dá)815U/g，與常規(guī)活化條件相比，酶活提高了40%以上。固定化葡萄糖異構(gòu)酶活化時(shí)不宜加入Mg2+、Co2+、Mn2+和Zn2+。

活化，果葡糖漿，固定化葡萄糖異構(gòu)酶

果葡糖漿是一種新發(fā)展起來的淀粉糖品，廣泛應(yīng)用于食品工業(yè)，尤其是軟飲料工業(yè)［1－2］。工業(yè)上一般采用玉米淀粉為原料，先經(jīng)過雙酶液化和糖化，轉(zhuǎn)化為葡萄糖溶液，然后采用固定化葡萄糖異構(gòu)酶進(jìn)行異構(gòu)化反應(yīng)，得到果糖和葡萄糖的混合液即果葡糖漿［3］。因此，葡萄糖異構(gòu)酶是果葡糖漿生產(chǎn)中的一個(gè)關(guān)鍵酶，其酶活的高低直接影響著生產(chǎn)效率和生產(chǎn)成本。為了方便儲(chǔ)運(yùn)及較高的穩(wěn)定性，固定化葡萄糖異構(gòu)酶的商品形態(tài)多為干燥的顆粒，其中只含極少量的水，因此酶顆粒使用前需進(jìn)行活化(水化)。活化過程就是用底物(葡萄糖漿)來使酶顆粒吸收水分，從而使酶發(fā)揮其催化功效［4］。如果活化條件不適當(dāng)，固定化葡萄糖異構(gòu)酶就不能獲得理想的酶活，從而影響其催化效率。關(guān)于葡萄糖異構(gòu)酶的固定化方法、穩(wěn)定性和反應(yīng)條件對(duì)其催化性能影響的研究很多，但是關(guān)于固定化葡萄糖異構(gòu)酶使用前的活化研究卻少有報(bào)道［5－7］。本文對(duì)以果葡糖漿生產(chǎn)上普遍使用的GENSWEETTMIGI－SA固定化葡萄糖異構(gòu)酶的最佳活化條件進(jìn)行了研究，以期提高活化后的酶活，進(jìn)而提高葡萄糖異構(gòu)為果糖的生產(chǎn)效率。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

GENSWEETTMIGI－SA固定化葡萄糖異構(gòu)酶(簡(jiǎn)稱異構(gòu)酶) 無錫杰能科生物制品有限公司，粒徑300～1200，淺棕黃色;葡萄糖 分析純，石家莊華營(yíng)葡萄糖有限公司;果糖 分析純，天津市永大化學(xué)試劑開發(fā)中心;MgSO4分析純，天津市大茂化學(xué)試劑廠;ZnSO4分析純，天津市化學(xué)試劑三廠;CoSO4、MnSO4分析純，天津市博迪化工有限公司。

Ajilent 1100高效液相色譜儀 配示差折光檢測(cè)器和Rev.A.10.02色譜工作站，美國(guó)安捷倫。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 活化時(shí)間對(duì)異構(gòu)酶酶活的影響 配制濃度為30%的葡萄糖溶液100mL，用0.2mol/L的NaOH溶液調(diào)pH到7.5。取5支試管，每支試管中加入0.2g異構(gòu)酶和5mL所配制的葡萄糖溶液，然后將試管置于40℃水浴鍋中分別浸泡(活化)0、1、2、3、4、5h。傾倒、瀝干糖液，測(cè)定酶活。

1.2.2 糖液濃度對(duì)異構(gòu)酶酶活的影響 分別配制濃度為30%、40%、50%、60%、70%(W/V)的葡萄糖溶液100mL，用0.2mol/L NaOH溶液調(diào)pH到7.5。取5支試管，每支試管中加入0.2g異構(gòu)酶和5mL所配制的葡萄糖溶液。將試管置于40℃水浴鍋中活化4h。傾倒、瀝干糖液。

1.2.3 溫度對(duì)異構(gòu)酶酶活的影響 配制濃度為60% (W/V)的葡萄糖溶液100mL，用0.2mol/L NaOH溶液調(diào)pH到7.5。取4支試管，每支試管中加入0.2g異構(gòu)酶和5mL所配制的葡萄糖溶液，分別在25、35、45、55、70℃水浴鍋中活化4h。

1.2.4 糖液pH對(duì)異構(gòu)酶酶活的影響 分別將60%葡萄糖溶液的pH調(diào)整為6.5、7.0、7.5、8.0、8.5。取5支試管，每支試管中加入0.2g異構(gòu)酶和5mL所配制的葡萄糖溶液，然后將試管置于55℃水浴鍋中活化4h。

1.2.5 金屬離子對(duì)異構(gòu)酶酶活的影響 配制濃度為60%的糖液400mL，用NaOH溶液調(diào)pH到7.5，并均分到 4個(gè)燒杯中，然后分別添加 MgSO4、CoSO4、ZnSO4、MnSO4配制成1.0mmol/L的葡萄糖液。取4支試管，每支試管中加入0.2g異構(gòu)酶和5mL配制好的含金屬離子葡萄糖溶液，然后將試管置于55℃水浴鍋中活化4h。

1.3 分析方法

1.3.1 固定化葡萄糖異構(gòu)酶酶活的測(cè)定 本實(shí)驗(yàn)按照GB8274－87(固定化葡萄糖異構(gòu)酶制劑)中所示的方法測(cè)定葡萄糖異構(gòu)酶的酶活。0.2g固定化葡萄糖異構(gòu)酶在葡萄糖溶液活化之后，傾倒、瀝干糖液，加磷酸緩沖液1.5mL，硫酸鎂溶液0.5mL，葡萄糖溶液1.5mL，再加去離子水調(diào)整至總體積5mL，70℃反應(yīng)1h，加高氯酸溶液5mL終止反應(yīng)，用高效液相法測(cè)定其中果糖含量。異構(gòu)酶的酶活力定義為:在pH為7.5，溫度為70℃的條件下，每小時(shí)生成1mg果糖所需的最小酶量為1個(gè)酶活力單位。

異構(gòu)酶酶活(U/g)=果糖濃度(mg/mL)×稀釋倍數(shù)×10/酶質(zhì)量

1.3.2 果糖含量的測(cè)定 本實(shí)驗(yàn)采用高效液相色譜法來測(cè)定果葡糖漿中果糖的含量。其檢測(cè)條件為: Waters Sugar－Park色譜柱，示差折光檢測(cè)器，流速0.5mL/min，溫度70℃，流動(dòng)相純水，流速0.5mL/min，進(jìn)樣量20.0μL。

2 結(jié)果與討論

2.1 活化時(shí)間的影響

將固定化葡萄糖異構(gòu)酶浸泡在30%葡萄糖溶液(40℃)中進(jìn)行活化，控制不同的活化時(shí)間，然后測(cè)定其酶活，結(jié)果見圖1。從圖1中發(fā)現(xiàn)，活化1h的異構(gòu)酶酶活明顯低于未經(jīng)活化的異構(gòu)酶。隨著活化時(shí)間的延長(zhǎng)，異構(gòu)酶酶活逐漸提高。當(dāng)活化時(shí)間為4h時(shí)，其酶活達(dá)到最高為720.3U/g。然而，當(dāng)活化時(shí)間延長(zhǎng)到5h時(shí)，酶活又顯著下降，低于未經(jīng)活化的異構(gòu)酶。為了方便儲(chǔ)存和運(yùn)輸，異構(gòu)酶固定化后生產(chǎn)為干態(tài)。在干燥過程中，異構(gòu)酶因失水而發(fā)生空間構(gòu)象的變化，進(jìn)而影響其酶活。在葡萄糖溶液中進(jìn)行活化時(shí)，異構(gòu)酶的空間構(gòu)象趨于恢復(fù)原態(tài)，其恢復(fù)的程度可能與活化時(shí)間、活化溫度、糖液濃度等有關(guān)，也可能與固定化時(shí)使用的固定載體有關(guān)?？赡苷沁@些影響因素不恰當(dāng)組合，使得活化后的異構(gòu)酶空間構(gòu)象恢復(fù)的不理想或最佳空間構(gòu)象未能長(zhǎng)時(shí)間保持，從而活化時(shí)間過短或過長(zhǎng)均造成異構(gòu)酶酶活降低。

圖1 活化時(shí)間對(duì)異構(gòu)酶酶活的影響Fig.1 Effect of activation time on the enzyme activity of immobilized glucose isomerase

2.2 糖液濃度的影響

在果葡糖漿的生產(chǎn)上，通常使用40%～50%的葡萄糖漿(純度93%)進(jìn)行活化［4］?？紤]到果葡糖漿的實(shí)際生產(chǎn)，本實(shí)驗(yàn)采用的活化介質(zhì)為葡萄糖溶液。將固定化葡萄糖異構(gòu)酶分別在30%、40%、50%、60%、70%(W/V)的葡萄糖溶液中40℃下活化4h，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖2。如圖2所示，糖液濃度對(duì)異構(gòu)酶酶活有顯著的影響。當(dāng)糖液濃度為60%時(shí)，異構(gòu)酶酶活最高，達(dá)到了811U/g，同40%葡萄糖溶液相比，異構(gòu)酶酶活提高了233U/g。糖液濃度的高低影響著其中的水分活度。糖液濃度越低，糖液中的水分活度越大，異構(gòu)酶顆粒越容易吸收水分，復(fù)水速度越快。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析，過快或過慢的復(fù)水速度都不利于活化后獲得最高酶活。

圖2 糖液濃度對(duì)異構(gòu)酶酶活的影響Fig.2 Effect of syrup concentration on the enzyme activityof immobilized glucose isomerase

2.3 活化溫度的影響

異構(gòu)酶固定化后，耐溫性增強(qiáng)，但當(dāng)溫度超過70℃時(shí)仍容易變性失活，從而導(dǎo)致酶活降低。因此，生產(chǎn)商建議的活化溫度為25～55℃。如圖3所示，在25～55℃范圍內(nèi)，隨著糖液活化溫度的升高，異構(gòu)酶酶活逐漸增加。當(dāng)活化溫度為55℃時(shí)，活化后的酶活最高，達(dá)815U/g，同25℃相比，異構(gòu)酶酶活增加了251.8U/g。當(dāng)活化溫度超過55℃時(shí)，異構(gòu)酶酶活明顯下降。由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，在實(shí)際生產(chǎn)中選擇適宜的活化溫度對(duì)提高異構(gòu)酶酶活很重要。

圖3 活化溫度對(duì)異構(gòu)酶酶活的影響Fig.3 Effect of temperature on the enzyme activityof immobilized glucose isomerase

2.4 糖液pH對(duì)異構(gòu)酶酶活的影響

根據(jù)來源不同，異構(gòu)酶的最適pH有所差異，一般糖異構(gòu)酶的最適pH在6.5～8.5。由圖4可見，當(dāng)糖液pH從6.5升高到7.5時(shí)，異構(gòu)酶酶活逐漸升高。pH 7.5與pH 8.0的酶活基本相同。但在堿性條件下高溫(60℃)會(huì)使葡萄糖糖漿的顏色加深，所以糖液pH選定7.5為宜。實(shí)驗(yàn)結(jié)果還表明，異構(gòu)酶活化的最適pH與進(jìn)行酶催化的最適pH基本一致。

圖4 pH對(duì)異構(gòu)酶酶活的影響Fig.4 Effect of pH on the enzyme activity of immobilized glucose isomerase

2.5 金屬離子對(duì)酶活的影響

葡萄糖異構(gòu)酶是金屬酶。在葡萄糖異構(gòu)化為果糖時(shí)，Mg2+、Co2+、Mn2+等對(duì)該酶有激活作用，而Ca2+、Hg2+、Cu2+等則起抑制作用［8－9］。為了考察金屬離子在異構(gòu)酶活化時(shí)的影響，在60%葡萄糖溶液中分別添加 1.0mmol/L的 MgSO4、CoSO4、ZnSO4、MnSO4，55℃下活化4h，結(jié)果見圖5。由圖5可見，同未加任何金屬離子的對(duì)照相比，異構(gòu)酶活化時(shí)添加Mg2+、Co2+、Mn2+、Zn2+不但沒有使酶活升高，反而明顯降低了酶活。這說明Mg2+、Co2+、Mn2+、Zn2+在活化時(shí)均起抑制作用。造成這種現(xiàn)象的原因可能是活化時(shí)添加的金屬離子干擾了異構(gòu)酶水化過程中最佳空間構(gòu)象的恢復(fù)，從而造成酶活的降低。

圖5 金屬離子對(duì)異構(gòu)酶酶活的影響Fig.5 Effect of metal ions on the enzyme activity of immobilized glucose isomerase

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)以果葡糖漿生產(chǎn)上普遍使用的GENSWEETTMIGI－SA固定化葡萄糖異構(gòu)酶為研究對(duì)象，研究了活化條件對(duì)其酶活的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明活化條件對(duì)固定化葡萄糖異構(gòu)酶酶活有非常顯著的影響。GENSWEETTMIGI－SA固定化葡萄糖異構(gòu)酶的適宜活化條件為:葡萄糖液濃度60%、溫度55℃、pH7.5、時(shí)間 4h。經(jīng)此條件活化之后，其酶活達(dá)815U/g，同酶生產(chǎn)商推薦活化條件(葡萄糖液濃度40%、溫度40℃、pH7.5、時(shí)間7h)相比，異構(gòu)酶酶活提高了40%以上。此外，在固定化葡萄糖異構(gòu)酶活化時(shí)不適宜加入Mg2+、Co2+、Mn2+和Zn2+等金屬離子。

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Influence of activation conditions on the enzyme activity of immobilized glucose isomerase

HU Tao，ZHOU Xue－yan，ZHAO Guo－qun
(College of Bioscience and Bioengineering，Hebei University of Science and Technology，Shijiazhuang 050018，China)

Activation was need before immobilized glucose isomerase was used in order to make it have the best catalytic ability.The influences of activation conditions on the enzyme activity of GENSWEETTMIGI－SA immobilized glucose isomerase were studied including concentration of glucose syrup，temperature，pH，activation time and metal ions.The optimal activation condition was as follows:Glucose syrup 60%，temperature 55℃，pH 7.5 and activation time 4h.Under this condition，the enzyme activity of immobilized glucose isomerase was 815U/g，which was 40%higher than one under normal activation condition.Mg2+，Co2+，Mn2+and Zn2+were not necessary to be added into glucose syrup when immobilized glucose isomerase was activated.

activation;high fructose syrup;immobilized glucose isomerase

TS201.3

A

1002－0306(2012)10－0223－03

2011－11－07

胡弢(1977－)，男，講師，博士，研究方向:生物催化技術(shù)。