許偉，嚴(yán)明，歐陽平凱

1 鹽城工學(xué)院 化學(xué)與生物工程學(xué)院，鹽城 224051

2 南京工業(yè)大學(xué) 生物與制藥工程學(xué)院，南京 210009

木糖異構(gòu)酶 (Xylose isomerase，Ⅺ) (EC 5.3.1.5)可以催化五碳糖D-木糖轉(zhuǎn)化為D-木酮糖，在微生物體內(nèi)的糖代謝過程中起著重要的作用；在體外亦能催化D-葡萄糖到D-果糖的異構(gòu)化反應(yīng)，所以又稱為葡萄糖異構(gòu)酶 (圖 1)。木糖異構(gòu)酶具有極其重要的工業(yè)應(yīng)用價(jià)值，和蛋白酶、淀粉酶等并稱為重要的工業(yè)用酶[1]，引起研究人員的關(guān)注并對(duì)其開展了較為廣泛的研究。在基礎(chǔ)研究方面，發(fā)現(xiàn)該酶的結(jié)構(gòu)非常穩(wěn)定，是研究蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系優(yōu)良模型之一[2]。近年來，隨著發(fā)展低碳經(jīng)濟(jì)的迫切需要，可再生資源利用研究方興未艾，其中，利用木糖異構(gòu)酶構(gòu)建發(fā)酵半纖維素水解產(chǎn)物木糖生產(chǎn)乙醇的重組菌成為研究熱點(diǎn)[3-4]。研究發(fā)現(xiàn)來自嗜熱細(xì)菌及真菌的木糖異構(gòu)酶能夠在釀酒酵母中表達(dá)出活性，參與了釀酒酵母木糖代謝途徑的構(gòu)建[5-7]。因此，深入了解木糖異構(gòu)酶獨(dú)特的結(jié)構(gòu)機(jī)理并通過酶分子改造提高其活性，對(duì)構(gòu)建新型高效利用木糖的重組釀酒酵母具有重要的理論及應(yīng)用意義[8-9]。

圖1 木糖異構(gòu)酶催化的反應(yīng)Fig. 1 Reactions catalyzed by xylose isomerase.

1 木糖異構(gòu)酶的酶學(xué)性質(zhì)及序列和結(jié)構(gòu)特點(diǎn)

1.1 木糖異構(gòu)酶的酶學(xué)性質(zhì)

1957年，美國研究人員先后在嗜水假單胞桿菌、短乳桿菌、戊糖乳酸菌中發(fā)現(xiàn)木糖異構(gòu)酶，從此拉開了木糖異構(gòu)酶研究的序幕。迄今為止，已經(jīng)在細(xì)菌、真菌和放線菌等多種微生物中以及植物中鑒定出木糖異構(gòu)酶[10-12]。

不同來源的木糖異構(gòu)酶最適反應(yīng)溫度一般為60 ℃~90 ℃。這取決于緩沖液、底物濃度、激活劑、穩(wěn)定劑及反應(yīng)時(shí)間等多種因素。其中乳酸桿菌和埃希桿菌木糖異構(gòu)酶的熱穩(wěn)定性較差。鏈霉菌、枯草芽胞桿菌以及某些嗜熱菌中的木糖異構(gòu)酶在高溫下相當(dāng)穩(wěn)定。

木糖異構(gòu)酶的最適pH偏堿性，通常在7.0~9.0之間。在偏酸性的條件下，大多數(shù)種屬的木糖異構(gòu)酶活性較低。表1中列出了文獻(xiàn)報(bào)道的一些重要木糖異構(gòu)酶的基本性質(zhì)。木糖異構(gòu)酶的活力及穩(wěn)定性跟二價(jià)金屬離子有著非常密切的關(guān)系。二價(jià)陽離子Mg2+、Co2+及 Mn2+可以穩(wěn)定和激活木糖異構(gòu)酶的活性[13]；而Ag+、Hg2+、Cu2+、Zn2+、Ni2+和Ca2+等離子通常抑制其催化活性。金屬離子還影響木糖異構(gòu)酶對(duì)不同底物的活性，如凝結(jié)芽胞桿菌木糖異構(gòu)酶和 Mn2+結(jié)合時(shí)對(duì)木糖的活性最高，和Co2+結(jié)合時(shí)對(duì)葡萄糖的活性最高。不同來源的木糖異構(gòu)酶可能需要不同的金屬離子使其保持較高的活性，如Mg2+對(duì)7號(hào)鏈霉菌M1033所產(chǎn)木糖異構(gòu)酶的激活作用最大。

木糖異構(gòu)酶以D-木糖作為天然最適底物，其對(duì)D-葡萄糖的Km值通常是D-木糖Km的幾十倍甚至上百倍。木糖異構(gòu)酶除催化D-葡萄糖和D-木糖的異構(gòu)化反應(yīng)外，據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道其還能以D-核糖、L-阿拉伯糖、L-鼠李糖、D-阿洛糖等單糖以及葡萄糖的C3、C5、C6的修飾衍生物為催化底物[24]。表2中列出了幾種重要的木糖異構(gòu)酶的反應(yīng)動(dòng)力學(xué)常數(shù)。

1.2 木糖異構(gòu)酶的序列及結(jié)構(gòu)特點(diǎn)

1.2.1 木糖異構(gòu)酶的序列特點(diǎn)

迄今為止，Swiss-Prot/TrEMBL數(shù)據(jù)庫中已經(jīng)公布了來源于近百種微生物木糖異構(gòu)酶的氨基酸序列[29-30]。其中大多數(shù)來自于細(xì)菌，少部分來自于真菌。

根據(jù)氨基酸序列同源性，Ⅺ可分為兩大類[31]，Class Ⅰ (約390個(gè)殘基) 主要來自于鏈霉菌屬 Streptomyces sp.、密蘇里游動(dòng)放線菌A. missouriensis、小瓶菌屬Ampullariella sp.、節(jié)桿菌屬 Arthrobacter sp.和棲熱菌屬 Thermus sp.等菌種，一般序列同源性超過 50%。Class Ⅱ (約 440殘基) 主要來自大腸桿菌Escherichia coli、枯草芽胞桿菌Bacillus subtilis 和棲熱袍菌屬Thermotoga sp.。與 Class Ⅰ相比，它們?cè)?N-末端明顯延長了約 50個(gè)氨基酸殘基。PROSITE 數(shù)據(jù)庫中[32]也根據(jù)Ⅺ序列的保守性給出了2個(gè)信號(hào)模式：[LI]-E-P-K-P-x (2)-P (PS00172) 其中Glu (E) 殘基穩(wěn)定輔因子，而Lys (K)殘基參與催化過程[33]；[FL]-H-D-{K}-D-[LIV]-x-[PD]-x-[GDE] (PS00173) 來自于 N-末端的保守區(qū)域，其中His殘基參與催化過程[34]。

1.2.2 木糖異構(gòu)酶三維結(jié)構(gòu)特點(diǎn)

迄今為止，PDB數(shù)據(jù)庫中已經(jīng)公布約100個(gè)木糖異構(gòu)酶的野生型或突變體的晶體結(jié)構(gòu)。通過對(duì)數(shù)據(jù)的分析發(fā)現(xiàn)，共來自 12種微生物 (表 3)。2000年，中國科技大學(xué)朱學(xué)勇等通過X-射線衍射方法測(cè)定了7號(hào)淀粉酶鏈霉菌M1033菌株木糖異構(gòu)酶的晶體結(jié)構(gòu)[35]，這是國內(nèi)研究人員對(duì)木糖異構(gòu)酶結(jié)構(gòu)研究的重大貢獻(xiàn)。

研究表明，木糖異構(gòu)酶絕大多數(shù)是同源四聚體或二聚體，亞基間不存在二硫鍵。從表 3中可知，木糖異構(gòu)酶 Class Ⅰ的結(jié)構(gòu)報(bào)道較多，也為其分子改造奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。相對(duì)來說，Class Ⅱ的木糖異構(gòu)酶研究較少。

圖2中給出了兩類木糖異構(gòu)酶的三維結(jié)構(gòu)。嗜熱棲熱菌木糖異構(gòu)酶 (圖 2A) 屬于 Class Ⅰ，是同源四聚體，每個(gè)亞基由 2個(gè)結(jié)構(gòu)域構(gòu)成：催化結(jié)構(gòu)域折疊成αβ桶；C-末端小結(jié)構(gòu)域無β-片層，由環(huán)鏈區(qū)和螺旋組成并且與相鄰亞基的催化結(jié)構(gòu)域廣泛接觸；Class Ⅱ木糖異構(gòu)酶 (圖2B) 具有明顯延伸的 N-末端。兩類木糖異構(gòu)酶折疊的核心結(jié)構(gòu)是折疊成桶狀的平行 β片層，其中的 β片層被位于桶外沿的 α螺旋連接?；钚灾行奶幱谶B接 β片層羧端與 α螺旋羧端 8段環(huán)鏈構(gòu)成的一個(gè)漏斗狀空腔的底部[42]。

1.2.3 木糖異構(gòu)酶的活性中心特點(diǎn)

木糖異構(gòu)酶的單亞基都有一個(gè)深陷的口袋狀的活性中心，每個(gè)活性中心包含兩個(gè)二價(jià)金屬離子結(jié)合位點(diǎn)，以及與底物結(jié)合和催化過程相關(guān)的保守殘基。通常位點(diǎn)Ⅰ (圖3 Mn1位置) 的金屬離子稱為結(jié)構(gòu)離子，位點(diǎn)Ⅱ (圖3 Mn2位置) 的金屬離子稱為催化離子。

表3 PDB數(shù)據(jù)庫中不同來源的木糖異構(gòu)酶晶體結(jié)構(gòu)Table 3 Xylose isomerase from different microorganisms in PDB database

圖2 木糖異構(gòu)酶的三維結(jié)構(gòu)Fig. 2 Three-dimension structure of xylose isomerase. (A) TthXI (PDB ID:1BXB) included in Class I. (B) B. stearothermophilus XI (PDB ID:1A0D) included in Class II. The N-terminus labelled in red.

圖3 S. rubiginosus木糖異構(gòu)酶的活性中心Fig. 3 Active site of xylose isomerase from S. rubiginosus.

研究人員通過對(duì) S. rubiginosus Ⅺ (PDB ID:1XIC) 進(jìn)行深入研究，探討了活性中心重要?dú)埢墓δ堋?XIC單亞基具有387個(gè)氨基酸殘基，晶體結(jié)構(gòu)活性中心給出了金屬離子及D-木糖的位置 (圖3)。殘基H54、D57和K183主要用于底物的結(jié)合，殘基E181、E217、D245和D287的羧基氧原子與結(jié)構(gòu)離子Mn1形成配位鍵。催化離子Mn2主要與殘基E217、H220、D255和D257形成配位鍵參與催化反應(yīng)。

1.3 嗜熱木糖異構(gòu)酶耐熱分子機(jī)理

1.3.1 嗜熱木糖異構(gòu)酶的殘基組成

T. thermophilus Ⅺ (TthXI) 單亞基含有 387個(gè)氨基酸殘基，分子量為43 907 Da，殘基組成如表4所示。其中，帶負(fù)電荷 (Asp和 Glu) 的氨基酸殘基數(shù)目占 16.3%；帶正電荷 (Arg和 Lys) 的氨基酸殘基占13.0%。TthXI的Arg、Glu和Val等殘基的比例高于常溫菌木糖異構(gòu)酶。這種在氨基酸組成上的差異可能是嗜熱木糖異構(gòu)酶具有高熱穩(wěn)定的原因之一[43]。

通過多序列比對(duì)及分析發(fā)現(xiàn)[2](殘基標(biāo)號(hào)以1BXB為例)，在所有已知序列木糖異構(gòu)酶中W15、D23、F25、G26、H53、D54、W136、G138、R139、E140、G141、E180、P181、K182、P183、E185、P186、N214、E216、H219、A234、D244、N246、F285和R291共25個(gè)殘基是嚴(yán)格保守的。這些殘基主要負(fù)責(zé)底物及輔因子的結(jié)合及催化。

1.3.2 嗜熱木糖異構(gòu)酶高熱穩(wěn)定性的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)

Chang等[23]對(duì)來自常溫菌和嗜熱菌的木糖異構(gòu)酶的結(jié)構(gòu)進(jìn)行了比較和分析，發(fā)現(xiàn)來自 T. thermophilus和T. caldophilus木糖異構(gòu)酶具有高熱穩(wěn)定性的主要因素為：1) 離子對(duì)和離子對(duì)網(wǎng)絡(luò)增加；2) 亞基之間的空隙減小；3) 酰氨基的脫氨作用減少；4) Loop區(qū)的長度縮短。

作為同源四聚體，TthXI亞基的緊密包裝及亞基間的相互作用對(duì)其熱穩(wěn)定性起著非常重要的作用[44]。作者運(yùn)用結(jié)構(gòu)分析軟件研究發(fā)現(xiàn)，TthXI亞基之間存在著廣泛接觸，亞基之間的三種作用形式如圖4所示[45]。

表5中統(tǒng)計(jì)了3個(gè)不同菌屬木糖異構(gòu)酶的亞基相互作用情況。其中TthXI、TcaXI和AmiXI分別代表來自 T. thermophilus、T. caldophilus和 A. missouriensis的木糖異構(gòu)酶，AB、AC和AD分別代表不同的亞基界面。TthXI、TcaXI和AmiXI單亞基分別具有387/387/393個(gè)氨基酸殘基，最適反應(yīng)溫度分別為85 ℃ /90 ℃ /75℃。表5中可以看出，與AmiXI相比，TthXI和TcaXI的AB和AD界面離子對(duì)數(shù)目顯著升高。研究表明，與常溫菌相比，TthXI亞基界面上增加了部分起到穩(wěn)定長loop區(qū)域的離子對(duì)。在TthXI亞基AB界面上，Arg249和Arg252與來自另外亞基的Asp189形成離子對(duì)，Asp27與另一亞基的Arg60形成離子對(duì)。在亞基AD界面上，Arg258與來自另一亞基的Glu372和Asp375形成離子對(duì)[23]。亞基界面上的這些特殊的離子對(duì)可能對(duì)增強(qiáng)木糖異構(gòu)酶的熱穩(wěn)定性非常重要。

表4 TthXI的氨基酸組成Table 4 The amino acids composition of TthXI

圖4 TthXI亞基之間的三種作用模式[45]Fig. 4 Three interaction patterns among subunits of TthXI (PDB ID:1BXB)[45]. Subunit A, B, C and D are shown in red, yellow, blue and green, respectively. The interaction patterns of subunit AB, AC and AD shown in (a), (b) and (c), respectively[45].

表5 木糖異構(gòu)酶亞基界面分析Table 5 Analysis of subunit interfaces in xylose isomerases

2 木糖異構(gòu)酶的分子改造

2.1 木糖異構(gòu)酶的底物特異性改造

酶的催化作用主要是通過酶活性中心殘基與底物相互作用完成。因此，酶活性中心殘基對(duì)酶的底物特異性起著決定性的作用[46]。Meng等[47]對(duì)T. thermosulfurigenes木糖異構(gòu)酶活性中心附近的殘基W138用Phe取代，發(fā)現(xiàn)突變酶對(duì)葡萄糖的親合力增加，并且催化效率比野生酶上升了 2.6倍。同時(shí)，突變酶在 85 ℃的半衰期延長了一倍。Sriprapundh等[48]對(duì) T. neapolitana木糖異構(gòu)酶進(jìn)行了V185T突變，突變酶對(duì)葡萄糖的催化效率提高了3.1倍，究其原因是由于突變?cè)黾拥臍滏I穩(wěn)定了葡萄糖C6上的羥基。Santa等[49]將AmiXI活性中心靠近底物C5羥基的殘基V135突變?yōu)锳sn，突變酶對(duì)L-核糖的催化效率提高 3倍。分子模擬結(jié)果表明，突變酶殘基N135與E181形成氫鍵，同時(shí)L-核糖O4與活性中心金屬Ⅰ形成配位鍵，從而穩(wěn)定了底物的構(gòu)象。為改善 AmiXI對(duì) L-阿拉伯糖的催化活性，Karimaki等[50]設(shè)計(jì)了F26W和Q256D突變，結(jié)果突變酶催化效率分別增加了2倍和3倍，分析表明前者是由于 Kcat的變化導(dǎo)致，而后者可能是突變導(dǎo)致酶活性中心靜電環(huán)境發(fā)生改變。

2.2 木糖異構(gòu)酶熱穩(wěn)定性的改造

工業(yè)上酶的催化過程通常在較高溫度下進(jìn)行，因?yàn)楦邷鼐哂性黾尤芙舛群头磻?yīng)速率以及降低溶液黏度、防止微生物污染等優(yōu)點(diǎn)。提高酶的熱穩(wěn)定性也是木糖異構(gòu)酶改造的熱點(diǎn)之一。

伍傳金等[51]對(duì)S. diastaticus木糖異構(gòu)酶進(jìn)行了K253R和N184V突變發(fā)現(xiàn)熱穩(wěn)定性都有所下降，其中K253R活性為野生酶的1.5倍，而突變酶N184V活性遠(yuǎn)低于野生酶。肖亞中等[18]對(duì)S. diastaticus木糖異構(gòu)酶進(jìn)行A198C突變，突變酶的最適溫度提高了8 ℃。一般來說，由于Pro的轉(zhuǎn)動(dòng)自由度較小，Pro的吡咯烷環(huán)使得 β-轉(zhuǎn)角或無規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)更加穩(wěn)定，從而提高蛋白質(zhì)的熱穩(wěn)定性。朱國萍等[52]在S. diastaticus木糖異構(gòu)酶中引入了G138P突變，突變酶的熱失活半衰期約是野生酶的2倍并且最適溫度提高了10 ℃~12 ℃。分析表明由于突變酶引入了一個(gè)吡咯烷環(huán)，該側(cè)鏈剛好充填由于G138無側(cè)鏈基團(tuán)而留下的空洞使蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)更具剛性，從而提高了熱穩(wěn)定性。Sriprapundh等[48]對(duì)T. thermosulfurigenes木糖異構(gòu)酶的熱穩(wěn)定性進(jìn)行了研究，分別引入A62P和Q58P/A62P突變都使得突變酶熱穩(wěn)定性明顯下降；而引入 Q58P后突變酶熱失活半衰期比野生酶增加了43%。

2.3 改善嗜熱木糖異構(gòu)酶低溫下活性的研究

由于嗜熱酶 TthXI在常溫下活性較低，這嚴(yán)重限制了利用該酶所構(gòu)建的重組釀酒酵母發(fā)酵木糖生產(chǎn)乙醇的能力。提高嗜熱木糖異構(gòu)酶在低溫下的活性，已成為開發(fā)新型重組乙醇產(chǎn)生菌的關(guān)鍵技術(shù)之一。

Lonn等[25]對(duì)TthXI進(jìn)行隨機(jī)突變，獲得突變酶E372G/V379A、E372G/F163L及E372G低溫下的活性均有提高，其中低溫下活力提高最多的是突變酶E372G/V379A。在60 ℃下，3個(gè)突變酶對(duì)D-木糖的Kcat比野生酶提高了 9倍，但催化效率 Kcat/Km沒有上升，并且較野生酶相比三者的熱穩(wěn)定性都顯著下降。研究人員對(duì)突變酶已經(jīng)申請(qǐng)了專利[53]，限制了對(duì)突變酶的進(jìn)一步應(yīng)用。郭亭等[54]利用重疊延伸法對(duì)TthXI進(jìn)行P137G突變，獲得了中溫下活性有所提高但熱穩(wěn)定性顯著下降的突變酶，結(jié)果表明該處的 Pro對(duì)維持其熱穩(wěn)定性起到重要的作用。Sriprapundh等[55]在T. neapolitana木糖異構(gòu)酶V185T突變體的基礎(chǔ)上，通過定向進(jìn)化的方法獲得了兩種低溫及低 pH 條件下活性增高的突變酶V185T/L282P和 V185T/L282P/F186S。結(jié)構(gòu)分析表明，F(xiàn)186S突變破壞了F186、Y184、F228和F262四個(gè)殘基芳香環(huán)間的相互作用，增加了結(jié)構(gòu)的柔性，導(dǎo)致其低溫下活性升高。

本文作者對(duì)木糖異構(gòu)酶也進(jìn)行了較深入的研究[56-58]，通過對(duì) TthXI與底物木糖的復(fù)合物在不同溫度下進(jìn)行納秒級(jí)的分子動(dòng)力學(xué)模擬，揭示了溫度對(duì)該酶結(jié)構(gòu)柔性的影響，指出高溫下該酶的柔性部位主要位于亞基界面以及由殘基 55~80組成的helix-loop-helix區(qū)域 (圖5)。

基于嗜熱木糖異構(gòu)酶與其相應(yīng)常溫酶保守殘基的差異，結(jié)合對(duì)亞基界面保守殘基相互作用模擬分析，我們首次提出定點(diǎn)突變嗜熱酶的保守殘基降低亞基間相互作用，來改善TthXI低溫下活性的策略。在大腸桿菌中高效表達(dá)了具有 N91D突變的 TthXI[59]，并獲得了 4種低溫下活性明顯增加的重組突變酶 D375G/V385A、D375G、K355A和V144A (圖6)[60]。結(jié)果證明通過對(duì)TthXI亞基界面保守殘基的定點(diǎn)突變，降低亞基間相互作用能有效地改善其冷適應(yīng)性。該策略對(duì)其他嗜熱菌中木糖異構(gòu)酶的冷適應(yīng)性改造具有積極的借鑒意義。

圖5 高溫86.85 ℃與26.85 ℃相比柔性增加的區(qū)域及重要?dú)埢赥thXI結(jié)構(gòu)上的定位[56]Fig. 5 The important regions and residues with higher flexibility at 86.85 °C compared with 26.85 °C[56]. C- terminal domain shown in blue and helix-loop-helix region (residues 55?80) shown in yellow.

3 展望

綜上所述，由于 TthXI在釀酒酵母中成功表達(dá)出活性，為重組釀酒酵母發(fā)酵木糖生產(chǎn)乙醇開辟了一條新的道路。該酶在發(fā)酵木糖生產(chǎn)乙醇方面的工業(yè)應(yīng)用潛力及其獨(dú)特的分子結(jié)構(gòu)特點(diǎn)引起了廣泛的關(guān)注。近年來，有關(guān)木糖異構(gòu)酶序列及結(jié)構(gòu)特點(diǎn)、底物特異性、熱穩(wěn)定性及冷適應(yīng)性方面的分子改造雖然取得了一定的進(jìn)展，但還存在著一些問題有待解決。如木糖異構(gòu)酶的催化過程的負(fù)氫離子轉(zhuǎn)移機(jī)制仍不明確；如何提高木糖異構(gòu)酶對(duì)木糖的催化活性的報(bào)道還較少。本文較全面地綜述了木糖異構(gòu)酶結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系的研究進(jìn)展，對(duì)于深入理解嗜熱木糖異構(gòu)酶具有高熱穩(wěn)定性的結(jié)構(gòu)機(jī)理，并且基于以上經(jīng)驗(yàn)進(jìn)行分子改造，提高木糖異構(gòu)酶的催化活性具有非常重要的意義。

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