趙志軍，陳晟，吳丹，吳敬，陳堅(jiān)

1 江南大學(xué) 食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，無(wú)錫 214122

2 江南大學(xué)生物工程學(xué)院 工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，無(wú)錫 214122

L-色氨酸作為人體內(nèi)的一種必需氨基酸，廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、食品和飼料等行業(yè)[1]。工業(yè)上一般采用微生物發(fā)酵法生產(chǎn)色氨酸,其生產(chǎn)菌株的篩選主要是通過(guò)誘變或者基因工程的手段，去除色氨酸合成代謝中的各種反饋調(diào)控作用[2]。然而由于微生物合成色氨酸的代謝調(diào)控機(jī)制非常復(fù)雜，通過(guò)現(xiàn)有手段很難完全去除，此時(shí)其殘余的調(diào)控作用往往會(huì)阻礙色氨酸的進(jìn)一步合成[3]。此類現(xiàn)象在其他氨基酸的菌種選育中也廣泛存在[4]。

針對(duì)以上情況，轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)工程為氨基酸生產(chǎn)菌株的選育提供了一種新的育種思路。轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)工程通過(guò)提高胞內(nèi)氨基酸的分泌速率或者降低胞外氨基酸的吸收速率，使細(xì)胞內(nèi)氨基酸濃度一直保持在較低水平，從而使氨基酸的反饋調(diào)控作用減弱或不起作用，最終達(dá)到高效生產(chǎn)某種氨基酸的目的[5]。近年來(lái)，關(guān)于賴氨酸、蘇氨酸和半胱氨酸等氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)的研究表明，轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)工程可能會(huì)成為氨基酸生產(chǎn)菌株選育過(guò)程中規(guī)避殘余調(diào)控作用，高效積累目的氨基酸的一種重要的方法[6-9]。

大腸桿菌的色氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)分為分泌系統(tǒng)和吸收系統(tǒng)，其中關(guān)于色氨酸分泌系統(tǒng)的相關(guān)基因仍未得到完全鑒定[10-11]，而色氨酸的吸收系統(tǒng)則相對(duì)受到了更多的關(guān)注[12-14]。大腸桿菌中主要由mtr、tnaB和aroP 3個(gè)基因編碼的通透酶參與調(diào)控色氨酸的吸收。其中AroP通透酶是芳香族氨基酸共用通透酶，還負(fù)責(zé)細(xì)胞對(duì)苯丙氨酸和酪氨酸的吸收；Mtr通透酶是高親和性的色氨酸專用通透酶；TnaB通透酶是低親和性的色氨酸專用通透酶[13]。本實(shí)驗(yàn)室前期的研究發(fā)現(xiàn)色氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)mtr、tnaB和aroP 3個(gè)基因的單基因敲除均有利于大腸桿菌合成更多的色氨酸，其中mtr單基因的敲除對(duì)菌株生產(chǎn)色氨酸的促進(jìn)作用最大，與對(duì)照菌相比色氨酸產(chǎn)量提高了約40% (數(shù)據(jù)另文發(fā)表)。本研究在mtr單基因敲除菌的基礎(chǔ)上，運(yùn)用 Red重組技術(shù)分別構(gòu)建了 mtr.tnaB和mtr.aroP雙基因敲除菌和mtr.tnaB.aroP三基因敲除菌，并通過(guò)發(fā)酵實(shí)驗(yàn)著重考察了色氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)多基因敲除對(duì)大腸桿菌菌體生長(zhǎng)及色氨酸生產(chǎn)的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和質(zhì)粒

出發(fā)菌株為色氨酸生產(chǎn)菌株大腸桿菌FB-T1/pSV03，其宿主菌FB-T1是大腸桿菌FB-02[15]的 mtr單基因敲除的衍生菌株，基因型為 W3110 (?trpR、?tnaA和?mtr)。質(zhì)粒pSV03是帶有抗反饋調(diào)控作用的大腸桿菌色氨酸合成途徑關(guān)鍵酶基因aroF和trpED的低拷貝，且具有PR和PL雙啟動(dòng)子的原核表達(dá)質(zhì)粒[15]。菌株FB-T1/pSV03由實(shí)驗(yàn)室前期通過(guò)基因工程手段構(gòu)建。本研究以 FB-T1/pSV03為出發(fā)菌株，分別構(gòu)建了mtr.tnaB和mtr.aroP雙基因敲除菌以及mtr.tnaB.aroP三基因敲除菌。敲除所需的工具質(zhì)粒pKD13、pKD46和pCP20購(gòu)自美國(guó)耶魯大學(xué)大腸桿菌菌株庫(kù) (E. coli Genetic Stock Center，New Haven，USA)[16]。本研究中使用的菌株和質(zhì)粒的具體特性見表1。

1.1.2 試劑和溶液

各種限制性內(nèi)切酶、Taq DNA聚合酶、PrimeSTAR HS DNA聚合酶和T4 DNA連接酶購(gòu)自寶生物工程 (大連) 有限公司；細(xì)菌質(zhì)粒DNA抽提試劑盒、細(xì)菌基因組DNA抽提試劑盒、DNA凝膠回收試劑盒以及試劑氨芐青霉素 (Amp)、卡那霉素(Kan) 和 L-阿拉伯糖購(gòu)自生工生物工程 (上海) 有限公司。

1.1.3 培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件

種子培養(yǎng)基為L(zhǎng)B培養(yǎng)基：10 g/L蛋白胨，10 g/L NaCl，5 g/L酵母膏。搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基的成分包括：3 g/L MgSO4·7H2O，0.015 g/L CaCl2·H2O，3 g/L KH2PO4，1 g/L NaCl，5 g/L (NH4)2SO4，0.07 g/L FeSO4·7H2O，0.1 g/L Na-Citrate，0.2 g/L酵母膏，20 g/L葡萄糖和 1.5 mL/L微量元素液 (2 g/L Al2(SO4)3·18H2O, 0.75 g/L CoSO4·7H2O，2.5 g/L CuSO4·5H2O，0.5 g/L H3BO3，2.4 g/L MnSO4·H2O，3 g/L Na2MoO4·2H2O，2.5 g/L NiSO4·6H2O，15 g/L ZnSO4·7H2O)。當(dāng)在3 L發(fā)酵罐中進(jìn)行分批發(fā)酵時(shí)，發(fā)酵培養(yǎng)基中的初始葡萄糖濃度降低至8 g/L，其余成分同搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基。

搖瓶發(fā)酵時(shí)，菌株在50 mL LB培養(yǎng)基中37 ℃培養(yǎng)8~10 h，按10% (V/V) 比例轉(zhuǎn)接至100 mL搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基中37 ℃振蕩培養(yǎng)，每隔4 h添加適量的濃氨水調(diào)節(jié)培養(yǎng)基pH值至pH 7.0~7.2。發(fā)酵罐發(fā)酵時(shí)，菌株在50 mL LB培養(yǎng)基中37 ℃培養(yǎng)8~10 h，按10% (V/V) 比例轉(zhuǎn)接至1.2 L發(fā)酵罐培養(yǎng)基中發(fā)酵。發(fā)酵初始溫度為33 ℃，當(dāng)菌體生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期前期時(shí)，升溫至38 ℃培養(yǎng)，誘導(dǎo)產(chǎn)色氨酸。當(dāng)發(fā)酵液中初始葡萄糖基本耗盡時(shí)，開始流加500 g/L的葡萄糖溶液，并調(diào)控流速使發(fā)酵液中的葡萄糖濃度小于5 g/L。發(fā)酵過(guò)程中，通過(guò)流加濃氨水使培養(yǎng)基pH保持在6.8。

1.1.4 引物

根據(jù)大腸桿菌W3110的基因組序列，設(shè)計(jì)引物gene_p1和gene_p2，其中下劃線部分為目標(biāo)基因上下游各50 bp的同源臂序列，以pKD13 DNA為模板，擴(kuò)增 1 403 bp的目標(biāo)基因打靶 DNA片段geneD50-Kan-geneD50。三對(duì)引物 gene_v1和 k1，k2和gene_v2，gene_v1和gene_v2分別用于鑒定目標(biāo)基因的敲除，其中引物gene_v1和gene_v2分別是大腸桿菌W3110基因組中目標(biāo)基因上游和下游的某段DNA序列，引物k1和k2分別為質(zhì)粒pKD13中Kan基因內(nèi)部序列[16]。本研究所用引物的DNA序列見表 2，引物的合成及相應(yīng)的測(cè)序工作由生工生物工程 (上海) 有限公司完成。

1.2 方法

1.2.1 大腸桿菌基因的敲除

大腸桿菌基因的敲除參照文獻(xiàn)[16]。

1.2.2 胞外發(fā)酵代謝物的測(cè)定

發(fā)酵液中色氨酸濃度的測(cè)定參照文獻(xiàn)[15]。發(fā)酵液中的葡萄糖濃度由 SBA-40C生物傳感分析儀測(cè)定 (山東省科學(xué)院生物研究所)。發(fā)酵液中的菌體密度以在600 nm波長(zhǎng)下分光光度計(jì)檢測(cè)的吸光值OD600表示，細(xì)胞干重根據(jù)前期構(gòu)建的經(jīng)驗(yàn)公式獲得 (1 OD=0.492 g/L CDW)。

表1 菌株和質(zhì)粒Table 1 Strains and plasmids

表2 本研究使用的引物Table 2 Primers used in this study

2 結(jié)果

2.1 mtr.tnaB雙基因敲除菌的構(gòu)建

由于色氨酸合成關(guān)鍵酶的表達(dá)質(zhì)粒pSV03和敲除用工具質(zhì)粒pKD13都是Kan抗性標(biāo)記，為避免質(zhì)粒pSV03在基因敲除過(guò)程中產(chǎn)生不利影響，本研究首先在出發(fā)菌株FB-T1/pSV03的宿主菌FB-T1的基礎(chǔ)上進(jìn)行色氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)多基因敲除菌的構(gòu)建，進(jìn)而通過(guò)質(zhì)粒 pSV03轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)獲得出發(fā)菌株FB-T1/pSV03的多基因敲除菌。以質(zhì)粒pKD13 DNA為模板，利用引物tnaB_p1和tnaB_p2擴(kuò)增得到的打靶PCR片段tnaBD50-Kan-tnaBD50，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌 FB-T1/pKD46的感受態(tài)細(xì)胞中，同源重組后在Kan平板上初步篩選tnaB基因的敲除突變株。分別利用兩對(duì)引物tnaB_v1和k1，k2和tnaB_v2對(duì)tnaB敲除菌進(jìn)行菌落PCR鑒定。根據(jù)序列分析，出發(fā)菌株不會(huì)獲得任何PCR片段，而 tnaB敲除菌經(jīng)擴(kuò)增后應(yīng)分別獲得784 bp和991 bp的PCR片段。DNA凝膠電泳的結(jié)果與理論值相符，表明tnaB基因敲除成功 (圖1，泳道1~2)。將質(zhì)粒pCP20轉(zhuǎn)化至tnaB基因敲除菌中，消除其Kan抗性基因，并利用引物tnaB_v1和tnaB_v2進(jìn)行菌落PCR鑒定。根據(jù)序列分析，Kan基因消除后，PCR擴(kuò)增應(yīng)獲得643 bp的DNA片段。DNA凝膠電泳的結(jié)果與理論值相符 (圖1，泳道3)。將PCR片段連接至pMD18-T載體后送測(cè)序，測(cè)序結(jié)果驗(yàn)證 tnaB基因敲除正確。命名mtr.tnaB敲除菌為FB-T2。

2.2 mtr. aroP雙基因和mtr. tnaB. aroP三基因敲除菌的構(gòu)建

圖1 tnaB基因敲除菌的PCR鑒定Fig. 1 Identification of the tnaB knockout strain by PCR. M: DL 2 000 marker; 1: tnaB_v1→k1; 2: k2→tnaB_v2; 3: tnaB_v1→tnaB_v2.

圖2 aroP基因敲除菌的PCR鑒定Fig. 2 Identification of the aroP knockout strains by PCR. M: DL 2 000 marker; 1, 5: aroP_v1→k1; 2, 6: k2→aroP_v2; 3, 7: aroP_v1→aroP _v2.

在mtr單基因和mtr.tnaB雙基因敲除的基礎(chǔ)上，通過(guò)引物aroP_p1和aroP_p2擴(kuò)增得到PCR片段aroPD50-Kan-aroPD50，用于菌株FB-T1和FB-T2基因組上aroP基因的敲除。利用兩對(duì)鑒定引物aroP_v1和k1，k2和aroP_v2分別進(jìn)行兩種aroP基因敲除菌的PCR鑒定。DNA凝膠電泳的結(jié)果顯示兩種aroP基因敲除菌經(jīng)PCR擴(kuò)增后獲得的DNA片段大小均與理論值742 bp和961 bp相符 (圖2，泳道1~2為mtr.aroP 雙基因敲除菌的鑒定；泳道 5~6為mtr.tnaB.aroP三基因敲除菌的鑒定)。Kan基因消除后，利用引物aroP_v1和aroP_v2再次對(duì)兩種aroP基因敲除菌進(jìn)行 PCR鑒定，電泳結(jié)果均與理論值571 bp相符 (圖2，泳道3為mtr.aroP雙基因敲除菌的鑒定；泳道7為mtr.tnaB.aroP三基因敲除菌的鑒定)。經(jīng)測(cè)序證明兩種 aroP基因敲除均正確，從而分別獲得 mtr.aroP 雙基因敲除菌 FB-T3和mtr.tnaB.aroP三基因敲除菌FB-T4。

2.3 色氨酸基因工程菌的構(gòu)建

將含有色氨酸合成關(guān)鍵酶基因的質(zhì)粒 pSV03分別轉(zhuǎn)化至大腸桿菌色氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)多基因敲除菌 FB-T2、FB-T3和 FB-T4中，構(gòu)建色氨酸基因工程菌 FB-T2/pSV03、FB-T3/pSV03和 FB-T4/ pSV03。

2.4 色氨酸基因工程菌的搖瓶發(fā)酵

為了初步考察大腸桿菌色氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)多基因敲除對(duì)菌株生產(chǎn)色氨酸的影響，本研究對(duì)出發(fā)菌株FB-T1/pSV03及構(gòu)建的色氨酸工程菌FB-T2/pSV03、FB-T3/pSV03和 FB-T4/pSV03進(jìn)行了搖瓶發(fā)酵實(shí)驗(yàn)。由于菌體在利用發(fā)酵培養(yǎng)基中的葡萄糖之后，培養(yǎng)液中pH值將下降至pH 6以下，進(jìn)而嚴(yán)重抑制菌體的生長(zhǎng)及色氨酸合成，因此本實(shí)驗(yàn)每隔4 h，利用濃氨水調(diào)節(jié)培養(yǎng)液中 pH值至 pH 7.0~7.2。如圖3A所示，與對(duì)照菌株相比，mtr.tnaB或者 mtr.aroP雙基因敲除對(duì)菌體的生長(zhǎng)影響較??；但當(dāng)3個(gè)色氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)基因mtr、tnaB和aroP均被敲除時(shí)，菌體的生長(zhǎng)受到了明顯抑制。在色氨酸生產(chǎn)方面，mtr.tnaB雙基因敲除菌 FB-T2/pSV03的色氨酸產(chǎn)量為1.38 g/L，與對(duì)照菌株FB-T1/pSV03 (1.17 g/L) 相比提高了17%；mtr.aroP雙基因敲除菌FB-T3/pSV03的色氨酸產(chǎn)量為1.27 g/L，與對(duì)照菌株FB-T1/pSV03相比提高了 9%；而 mtr.tnaB.aroP三基因敲除菌FB-T4/pSV03生長(zhǎng)緩慢，發(fā)酵過(guò)程中僅積累了0.63 g/L的色氨酸 (圖3B)。

2.5 色氨酸基因工程菌的補(bǔ)料分批發(fā)酵

由搖瓶發(fā)酵試驗(yàn)得知，在構(gòu)建的色氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)工程菌中，mtr.tnaB的雙基因敲除菌FB-T2/pSV03的產(chǎn)色氨酸能力最高，為了進(jìn)一步考察其發(fā)酵生產(chǎn)色氨酸的潛力，本研究在3 L發(fā)酵罐中對(duì)出發(fā)菌株FB-T1/pSV03及 mtr.tnaB雙基因敲除菌 FB-T2/ pSV03進(jìn)行了補(bǔ)料分批發(fā)酵實(shí)驗(yàn)。如圖4所示，雖然在發(fā)酵罐中菌株FB-T2/pSV03的菌體生長(zhǎng)滯后于對(duì)照菌FB-T1/pSV03，但在發(fā)酵過(guò)程中2個(gè)菌株最高可積累的生物量相近，分別為39.4 g/L和41.8 g/L (表3)。在色氨酸生產(chǎn)方面，菌株FB-T2/pSV03的發(fā)酵液中最高可以積累12.2 g/L色氨酸，與出發(fā)菌株FB-T1/pSV03 (9.6 g/L) 相比提高了 27%；菌株FB-T2/pSV03的葡萄糖轉(zhuǎn)化率為 9%，與對(duì)照菌FB-T1/pSV03 (6%) 相比提高 50% (表 3)。研究結(jié)果表明色氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng) mtr.tnaB雙基因敲除對(duì)菌體發(fā)酵生產(chǎn)色氨酸最為有利。

圖3 大腸桿菌FB-T1/pSV03色氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)多基因敲除菌的搖瓶發(fā)酵Fig. 3 Shake-flask fermentations of multi-gene knockout mutants of L-Trp transport system of E. coli FB-T1/pSV03. The data represent the ±s from three measurements.

圖4 菌株FB-T1/pSV03和FB-T2/pSV03的分批發(fā)酵Fig. 4 Fed-batch fermentations of E. coli FB-T1/pSV03 and FB-T2/pSV03. The data represent the ±s from three measurements.

表3 大腸桿菌FB-T1/pSV03和FB-T2/pSV03分批補(bǔ)料發(fā)酵的參數(shù)比較Table 3 Comparison of fermentation parameters of E. coli FB-T1/pSV03 and FB-T2/pSV03

3 討論

在氨基酸合成途徑本身得到廣泛研究之后，轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)的改進(jìn)被認(rèn)為是今后氨基酸育種研究中的重要內(nèi)容。但由于仍有許多氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)的基因尚未得到鑒定，因此目前僅有少數(shù)文獻(xiàn)考察了轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)工程對(duì)相應(yīng)氨基酸生物合成的影響[5]。就色氨酸而言，相關(guān)研究主要集中在谷氨酸棒桿菌上[12,14]。在谷氨酸棒桿菌中，色氨酸向胞內(nèi)的轉(zhuǎn)運(yùn)僅受到AroP通透酶的調(diào)控。Ikeda等以谷氨酸棒桿菌KY9225為出發(fā)菌株，通過(guò)誘變獲得了色氨酸吸收活性降低的 3株突變菌，其色氨酸產(chǎn)量與對(duì)照菌相比分別提高了 10%~20%，因此推測(cè)色氨酸吸收系統(tǒng)的受損有利于菌體的色氨酸合成[12]。但其不足之處是 Ikeda等[12]在色氨酸吸收系統(tǒng)突變菌的構(gòu)建過(guò)程中多次采用了誘變的手段。由于誘變過(guò)程中往往會(huì)發(fā)生各種次級(jí)突變，無(wú)法確認(rèn)這些次級(jí)突變是否也影響了菌體的色氨酸合成，進(jìn)而也不能準(zhǔn)確確定色氨酸吸收系統(tǒng)受損對(duì)色氨酸產(chǎn)量提高的貢獻(xiàn)量。在大腸桿菌方面，本實(shí)驗(yàn)室在前期的研究中發(fā)現(xiàn)色氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)的單基因敲除均對(duì)菌體生產(chǎn)色氨酸有促進(jìn)作用，其中 mtr單基因敲除的作用最大 (數(shù)據(jù)未顯示)，但關(guān)于大腸桿菌轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)多基因缺失對(duì)菌株發(fā)酵生產(chǎn)色氨酸的影響仍未見報(bào)道。因此，本研究在mtr單基因敲除菌的基礎(chǔ)上，分別構(gòu)建了mtr.tnaB和mtr.aroP雙基因敲除菌以及mtr.tnaB.aroP三基因敲除菌，著重考察了色氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)多基因敲除對(duì)菌株生產(chǎn)色氨酸的影響。結(jié)果表明，mtr.tnaB和mtr.aroP雙基因敲除均對(duì)菌體的生長(zhǎng)影響較小，且mtr.tnaB和 mtr.aroP雙基因敲除菌的色氨酸產(chǎn)量與對(duì)照菌相比分別提高了17%和9%。在進(jìn)一步的分批補(bǔ)料發(fā)酵實(shí)驗(yàn)中 mtr.tnaB雙基因敲除菌最高可積累12.2 g/L的色氨酸，與對(duì)照菌相比提高了27%；此外，在獲得的相近菌體生物量的情況下，發(fā)酵過(guò)程中 mtr.tnaB雙基因敲除菌消耗了較少的葡糖糖，因此其葡萄糖轉(zhuǎn)化率達(dá)到 9%，與對(duì)照菌相比提高了50% (表3)。此外，由于本研究涉及的出發(fā)菌株及基因敲除菌均是通過(guò)基因工程手段構(gòu)建而成，具有確定的基因組信息 (表 1)，因此有助于準(zhǔn)確反映色氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)受損對(duì)菌體生產(chǎn)色氨酸的影響，從而為色氨酸菌種的進(jìn)一步改良提供依據(jù)。

值得注意的是，目前氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)工程的研究仍然存在一些問(wèn)題。例如，前期的研究發(fā)現(xiàn)過(guò)量表達(dá)某種氨基酸吸收基因會(huì)導(dǎo)致相應(yīng)氨基酸的產(chǎn)量急劇下降[8,14]，但當(dāng)通過(guò)各種手段致使氨基酸吸收系統(tǒng)受損時(shí)，相應(yīng)氨基酸的產(chǎn)量并沒(méi)有得到數(shù)倍的增長(zhǎng)[12]。此外，在氨基酸分泌系統(tǒng)的研究中，盡管存在氨基酸分泌基因的過(guò)量表達(dá)促進(jìn)相應(yīng)氨基酸生產(chǎn)的實(shí)例[17-18]，但研究中也發(fā)現(xiàn)個(gè)別氨基酸分泌基因的缺失對(duì)相應(yīng)氨基酸的產(chǎn)量基本沒(méi)有影響[5,19]。這些問(wèn)題一方面需要通過(guò)對(duì)氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制的探索來(lái)尋找原因，但另一個(gè)不可忽視的方面是，受制于許多氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)基因尤其是分泌基因尚未得到鑒定，目前大多數(shù)的相關(guān)研究都單獨(dú)對(duì)氨基酸吸收系統(tǒng)或者分泌系統(tǒng)進(jìn)行考察，而氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)作為一個(gè)有機(jī)整體，是其吸收系統(tǒng)和分泌系統(tǒng)的共同作用決定了微生物細(xì)胞內(nèi)的氨基酸濃度，并最終影響了相應(yīng)氨基酸的生物合成。因此，隨著越來(lái)越多的氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)基因尤其是氨基酸分泌基因被鑒定和研究[10]，氨基酸吸收系統(tǒng)和分泌系統(tǒng)必將作為一個(gè)整體同時(shí)進(jìn)行考察和研究，從而使色氨酸以及其他氨基酸的轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)工程在氨基酸生產(chǎn)菌株的理性改造過(guò)程中發(fā)揮更加重要的作用。

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