汪小鋒，孫永川，申旭光，柯鋒，徐莉，劉云，閆云君

華中科技大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院 教育部分子生物物理重點實驗室，武漢 430074

巴斯德畢赤酵母Pichia pastoris具有強啟動子、可對表達的蛋白進行翻譯后加工與修飾、易于高密度發(fā)酵和純化等優(yōu)點[1]，是近年來廣泛報道的能高效表達各種外源蛋白的表達系統(tǒng)，目前已有600多種蛋白在畢赤酵母中成功實現(xiàn)了表達[2]。為了提高重組蛋白的體積生產(chǎn)率，工業(yè)上通常進行高細胞密度發(fā)酵[3]。畢赤酵母高細胞密度發(fā)酵過程需要消耗大量的氧氣，通常會造成供氧限制。而氧氣在發(fā)酵液中的溶解度較低，且隨著發(fā)酵液中生物量和消泡劑的增加，其溶解度和傳質(zhì)效率還會逐步降低[4]，因此溶氧控制是畢赤酵母高密度發(fā)酵過程中影響重組蛋白表達的重要因素。在大規(guī)模發(fā)酵過程中由于大的發(fā)酵罐存在體積大、死角較多，罐內(nèi)各部位溶氧分布不均，導(dǎo)致低氧問題十分突出[5]，因此利用分子生物學(xué)方法改善重組畢赤酵母在低氧條件下的蛋白表達水平意義十分重大。

透明顫菌血紅蛋白 (Vitreoscilla hemoglobin，VHb) 是一種專性好氧的革蘭氏陰性絲狀菌在低氧環(huán)境中產(chǎn)生的一種分子量約為15.8 kDa的可溶性蛋白，具有較高的氧吸附和解離速率常數(shù)[6]，已在多種宿主中成功表達并促進細胞生長和提高代謝物產(chǎn)率[7]。在畢赤酵母中共表達目的蛋白和VHb是改善高密度發(fā)酵過程中溶氧限制的一種有效方式。在氧供應(yīng)正常的情況下，β-半乳糖苷酶與VHb在畢赤酵母中共表達對細胞生長沒有明顯促進作用，但重組菌中 β-半乳糖苷酶的表達量提高了 4倍[3]。此外，有研究表明，VHb在畢赤酵母中的表達不僅能提高氧的利用率和 S-腺苷甲硫氨酸的產(chǎn)率，還能促進ATP合成，增強甲醇代謝活性[4]。PsADH2啟動子是一種來源于樹干畢赤酵母的乙醇脫氫酶2 (PsADH2)基因的低氧誘導(dǎo)型啟動子，能在氧氣限制條件下被激活。該啟動子應(yīng)用于畢赤酵母中表達VHb能在低氧條件下改善重組細胞的生長[8]，提高重組植酸酶的表達量[5]。

YlLip2是一種重要的微生物脂肪酶，具有較高的水解、酯化和轉(zhuǎn)酯活力，在酯合成、生物柴油制備和對映體拆分等領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景[9-10]。YlLip2已在畢赤酵母中成功實現(xiàn)了高水平的表達[10-12]，但高密度發(fā)酵過程中VHb與脂肪酶共表達的研究尚未見有文獻報道。本研究中，首先將YlLip2基因 (lip2) 克隆到pPIC9K載體中，電轉(zhuǎn)化畢赤酵母菌株GS115，得到重組菌株GS115/9Klip2。利用重疊PCR的方法將PsADH2啟動子和終止子與VHb基因 (vgb) 融合后單獨或與lip2基因共同整合到誘導(dǎo)型的 pPICZαA 表達載體中，電轉(zhuǎn)化GS115/9Klip2菌株，實現(xiàn)VHb的胞內(nèi)表達與YlLip2的分泌表達。同時，在溶氧限制條件下對重組菌株的細胞生長和脂肪酶的表達水平進行了探討。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株與質(zhì)粒

pPIC9K-Lip2H和pMD-VHb質(zhì)粒均為本實驗室構(gòu)建并保存。P. pastoris GS115 (his4)、pPIC9K、 pPICZαA和E. coli Top10均購自Invitrogen公司。pMD18-T simple載體購自日本 TaKaRa公司。Pichia stipitis CBS 6054由杭州師范大學(xué)李海峰博士饋贈。

1.1.2 試劑及儀器

胰蛋白胨、酵母提取物購自O(shè)xoid公司；YNB (無氨基酸) 購自BD公司；限制性內(nèi)切酶、T4 DNA連接酶、高保真 PrimerSTAR HS DNA聚合酶、DNA凝膠回收試劑盒等購自TaKaRa公司；DNA凝膠回收試劑盒購自O(shè)MGE公司；BCA蛋白定量檢測試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司；所有化學(xué)試劑均購自上海國藥集團化學(xué)試劑有限公司；10 L攪拌式發(fā)酵罐 (BIOTECH-10JGZ) 購自上海保興生物設(shè)備工程有限公司；GenePulserⅡ電穿孔儀購自Bio-RAD公司；高速離心機和PCR儀均購自德國Eppendorf公司；高壓細胞破碎儀購自英國Constant Systems公司。

1.1.3 引物與培養(yǎng)基

根據(jù)NCBI公布的DNA序列設(shè)計引物 (表1)，所有普通 PCR引物均由上海生物工程公司合成?；驕y序由上海桑尼生物科技有限公司完成。YPD、YPDS、BMGY、BMMY、MD、MM等培養(yǎng)基參考Invitrogen公司的畢赤酵母表達手冊。酶活力檢測采用BMMY-羅丹明B-橄欖油平板 (100 mL的BMMY培養(yǎng)基中加入1 mL橄欖油乳化液和400 μL的0.1%的羅丹明B)；10 L發(fā)酵罐上采用修飾的FM22培養(yǎng)基[13](g/L)：KH2PO4，42.9；(NH4)2SO4，5；CaSO4，0.6；K2SO4，14.3；MgSO4·7H2O 11.7；檸檬酸，1.9；甘油，40 g和 2.0 mL/L的微量元素儲液PTM4[13]。發(fā)酵罐補料培養(yǎng)基：甘油 50% (W/V，含 4 mL/L PTM4)；甲醇 100% (含 4 mL/L PTM4)。

表1 本文中所用到的引物Table 1 The Primers used in this study

1.2 方法

1.2.1 重組質(zhì)粒的構(gòu)建與轉(zhuǎn)化

以 pPIC9K-Lip2H的質(zhì)粒 DNA為模板，利用lip2-F1和lip2-R1為引物擴增lip2基因，PCR產(chǎn)物加A后連接pMD18-T simple載體，形成的pMD-lip2質(zhì)粒用于轉(zhuǎn)化E. coli Top10，篩選陽性克隆子并通過測序確認插入基因的正確性。測序正確的pMD-lip2質(zhì)粒經(jīng)雙酶切、膠回收后的目的基因片段插入到pPIC9K的EcoR Ⅰ/Not Ⅰ位點之間形成pPIC9K-lip2質(zhì)粒；重組質(zhì)粒pPIC9K-lip2經(jīng)Sal Ⅰ線性化后，取10 μg與80 μL的GS115感受態(tài)細胞混合，在電轉(zhuǎn)參數(shù)為1 500 V、25 μF、200 ?的條件下轉(zhuǎn)化，得到GS115/9Klip2菌株。重組菌株的表型鑒定和高拷貝篩選參考Invitrogen公司的畢赤酵母表達手冊。將高 G418抗性的 Mut+型克隆子轉(zhuǎn)移到 BMMY-羅丹明B-橄欖油平板上，28 ℃培養(yǎng)3 d后，挑取水解圈較大的克隆子進行 PCR驗證和酶活力篩選。脂肪酶活力最高的重組菌株將進行下一步的有關(guān)研究。

以樹干畢赤酵母基因組 DNA為模板，分別以ADH2-P1/P2和 ADH2-T1/T2為引物擴增 PsADH2啟動子和終止子。以pMD-VHb質(zhì)粒DNA為模板，以VHb-M1和VHb-M2為引物擴增vgb基因片段，通過重疊PCR的方法將PsADH2啟動子和終止子與 vgb基因融合成一個完整的基因 PVT。PVT經(jīng)BamHⅠ酶切后膠回收的片段插入到 pPICZαA載體中得到pPICZPVT。以pPIC9K-lip2的質(zhì)粒DNA為模板，以lip2-F2和lip2-R2為引物擴增lip2基因，PCR產(chǎn)物經(jīng)EcoRⅠ/XbaⅠ雙酶切、膠回收后，整合到pPICZPVT載體中形成pPICZPVT-lip2質(zhì)粒。通過測序驗證重組質(zhì)粒 pPICZPVT和 pPICZPVT-lip2構(gòu)建成功。重組質(zhì)粒經(jīng) BstXⅠ線性化后電轉(zhuǎn)化GS115/9Klip2，得到重組菌株 GS115/9Klip2-pZPVT和GS115/9Klip2-pZPVTlip2。采用YPDS-Zeocin抗性平板篩選高拷貝克隆子。將高Zeocin抗性的克隆子轉(zhuǎn)移到BMMY-羅丹明B-橄欖油平板上，28 ℃培養(yǎng)3 d后，挑取水解圈較大的克隆子進行PCR驗證和酶活力篩選。

1.2.2 高產(chǎn)菌株的篩選與搖瓶發(fā)酵

隨機挑取 60個水解圈較大的克隆子接種于裝有50 mL BMGY培養(yǎng)基的500 mL搖瓶中，30 ℃、220 r/min下培養(yǎng)16~18 h，當吸光度OD600=4~6時，離心收集菌體后轉(zhuǎn)移到50 mL的BMMY培養(yǎng)基中，28 ℃、220 r/min下繼續(xù)誘導(dǎo)培養(yǎng)，每隔24 h添加1.5% (V/V) 的甲醇，并取樣檢測生物量和發(fā)酵液上清的酶活力。對篩選到的高脂肪酶活力的重組菌株進行發(fā)酵pH和甲醇添加量的優(yōu)化，為發(fā)酵罐中高密度發(fā)酵提供一定的參考。

1.2.3 分批補料培養(yǎng)

將?80 ℃保存的克隆子接種到30 mL的YPD培養(yǎng)基中，培養(yǎng)16 h后轉(zhuǎn)接到裝有400 mL BMGY培養(yǎng)基的2 L搖瓶中，培養(yǎng)18~20 h，當OD600=4~6時，以10%的接種量接入到起始裝液量為4 L FM22培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中，進行分批補料培養(yǎng)。菌體生長階段和誘導(dǎo)階段溫度分別設(shè)定為29 ℃和25 ℃，攪拌速度500~800 r/min，DO維持在10%~25%之間，通氣量維持在4~12 L/min，流加28%的氨水和 30%的磷酸自動控制pH，菌體生長階段和誘導(dǎo)階段分別為6.0和6.5。當甘油耗盡后，補加400 mL 50%的甘油；當DO再次上升后，流加100%甲醇至罐中的甲醇的濃度為 0.5%，0~6 h流加速度為1.5~3.5 mL/(L·h)，6~24 h，逐漸提高流加速度到6~8 mL/(L·h)，并一直維持該速度至發(fā)酵結(jié)束，發(fā)酵過程中根據(jù) DO的波動適當調(diào)節(jié)甲醇流速。每隔一段時間取樣測定菌體濕重、酶活力和蛋白質(zhì)含量。

1.2.4 生物量和重組菌株遺傳穩(wěn)定性的測定

取5 mL發(fā)酵液至預(yù)先已稱重的離心管中，4 ℃下8 000 r/min離心10 min，用無菌水洗滌細胞2次，4 ℃、8 000 r/min離心10 min，棄上清后稱重，計算細胞濕重 (WCW)。取發(fā)酵罐中培養(yǎng)160 h的發(fā)酵液1 mL用無菌水適當稀釋，取80 μL稀釋液涂布在YPD平板上，待平板上有菌落形成，用牙簽挑取100個單克隆到固體YPD-G418-Zeocin選擇培養(yǎng)基上，菌斑出現(xiàn)后統(tǒng)計雙抗平板上的菌斑數(shù)量，計算工程菌種質(zhì)粒的丟失率，重復(fù)操作3次。

1.2.5 VHb活力的檢測

VHb活性檢測采用 CO-差光譜法[8]。10 mL發(fā)酵液在5 000 r/min離心5 min后，細胞重懸于100 mmol/L的 Tris-HCl緩沖液 (pH 7.5，包含50 mmol/L NaCl)，高壓細胞破碎后，4 ℃、8 000 r/min離心10 min，取3 mL上清用緩沖液稀釋1倍并加入連二亞硫酸鈉至終濃度為 2.5 mg/mL，通入 CO氣體室溫避光孵育3 min，用美譜達1800PC紫外可見分光光度計在400~500 nm波段掃描得到CO-差示光譜圖。

1.2.6 脂肪酶活力測定與蛋白質(zhì)分析

脂肪酶活性測定采用堿式滴定法[12]。操作步驟如下：酶活力測定以橄欖油乳化液 (橄欖油∶PVA=1∶3，V/V) 為底物，底物4 mL、Tris-HCl (pH 8.0，50 mmol/L) 5 mL和適當稀釋的發(fā)酵上清液1 mL組成10 mL反應(yīng)體系，40 ℃水浴反應(yīng)10 min后加入15 mL終止液 (乙醇∶丙酮＝1∶1，V/V) 終止反應(yīng)。酶催化水解產(chǎn)生的脂肪酸通過0.05 mol/L NaOH滴定測得，加兩滴0.5%酚酞指示滴定終點。在40 ℃、pH 8.0的條件下，脂肪酶每分鐘水解橄欖油產(chǎn)生1 μmol游離脂肪酸所需的酶量定義為一個活力單位 (U)。蛋白濃度測定采用BCA蛋白濃度定量檢測試劑盒。SDS-PAGE檢測目的蛋白的分子量和表達水平，蛋白質(zhì)染色采用考馬斯亮藍R-250。

TaqMan實時熒光定量PCR法檢測畢赤酵母基因組中l(wèi)ip2基因的拷貝數(shù)由廣州吉坤生物技術(shù)有限公司完成。畢赤酵母GAP基因的標準品、lip2基因和GAP基因的引物、探針均由廣州達安基因公司提供。陽性重組質(zhì)粒 pPICZαA-lip2和 pPIC3.5K-vgb作為標準品質(zhì)粒，重組菌株的基因組 DNA作為模板，均由本實驗室提供。

2 結(jié)果與分析

2.1 表達載體的構(gòu)建

去自身信號肽的lip2基因的PCR擴增產(chǎn)物長度為906 bp，PsADH2啟動子和終止子與vgb基因通過重疊PCR的方法融合成全長為1 383 bp的完整基因PVT，經(jīng)過測序驗證正確后分別插入到 pPIC9K和pPICZαA 載體中，得到重組質(zhì)粒 pPIC9K-lip2和pPICZPVT。再將以lip2-F2和lip2-R2為引物擴增得到 lip2基因插入到 pPICZPVT中，獲得重組質(zhì)粒pPICZPVT-lip2。通過PCR和測序證實所有的重組質(zhì)粒構(gòu)建正確。

2.2 高產(chǎn)菌株的篩選與搖瓶發(fā)酵

重組質(zhì)粒pPIC9K-lip2電轉(zhuǎn)化畢赤酵母GS115后得到重組菌株GS115/9Klip2。從BMMY-羅丹明B-橄欖油平板上隨機挑選 60個水解圈較大的Mut+型克隆子進行搖瓶發(fā)酵。以 BMMY為誘導(dǎo)培養(yǎng)基培養(yǎng)96 h，篩選到一株最高脂肪酶水解活力為1 200 U/mL的克隆子GS115/9Klip2 58#。以該工程菌為基礎(chǔ)，考察了發(fā)酵pH和甲醇添加量對YlLip2表達量的影響 (圖1)。每24 h甲醇添加量為1.5% (V/V) 時，YlLip2的表達量最高 (圖1A)；脂肪酶的表達量隨初始誘導(dǎo)pH的增加而增加，當pH為 6.5時達到最高，過高和過低的 pH都不利于 YlLip2的表達 (圖 1B)。因此，后續(xù)的實驗中誘導(dǎo) pH采用 6.5，每 24 h甲醇添加量為 1.5% (V/V)。

pPICZPVT-lip2和 pPICZPVT經(jīng)BstXⅠ線性化后轉(zhuǎn)化 GS115/9Klip2 58#宿主，得到重組菌株GS115/9Klip2-pZPVT和GS115/9Klip2- pZPVTlip2?？蛰d質(zhì)粒pPICZαA轉(zhuǎn)化GS115/9Klip2 58#宿主得到一株陽性克隆子 GS115/9Klip2-ZαA 9#作為對照菌株。以BMMY為誘導(dǎo)培養(yǎng)基培養(yǎng)96 h，重組菌株GS115/9Klip2-pZPVT和GS115/9Klip2-pZPVTlip2中的最高脂肪酶活力的克隆子28#和49#的YlLip2水解活力分別達到1 500 U/mL和4 000 U/mL。

圖1 不同的甲醇濃度和誘導(dǎo)pH對YlLip2產(chǎn)酶的影響Fig. 1 Effects of different methanol concentration (A) and induction pH values (B) on YlLip2 production.

2.3 VHb和YlLip2在畢赤酵母中的表達

提高搖瓶裝液量和降低轉(zhuǎn)速，創(chuàng)造 DO限制性條件，從而使低氧壓力啟動子能啟動 vgb基因的表達。為了考察DO限制性條件下VHb和YlLip2在畢赤酵母中的表達情況，對 4個重組菌株(GS115/9Klip2 58#，GS115/9Klip2-ZαA 9#，GS115/ 9Klip2-pZPVT 28#，GS115/9Klip2-pZPVTlip2 49#)在搖瓶中的發(fā)酵條件進行了研究，發(fā)酵條件為：裝液量100 mL/500 mL，轉(zhuǎn)速150 r/min，誘導(dǎo)時間96 h。由于低氧壓力啟動子啟動vgb表達效率不高，VHb在胞內(nèi)的表達量不高，因此一般采用CO-差式光譜法檢測VHb是否實現(xiàn)功能表達。由圖2可知，VHb+細胞 (GS115/9Klip2-pZPVT 28#) 在420 nm附近有典型的特征吸收峰，而 VHb–細胞 (GS115/ 9Klip2 58#) 在420 nm處沒有特征吸收峰，說明胞內(nèi)表達出了具有生物活性的VHb蛋白。

對以上菌株在 DO限制性發(fā)酵條件下的發(fā)酵液上清和細胞破碎液進行SDS-PAGE分析 (圖3)。表達了VHb的重組菌株的發(fā)酵液上清中均有一條明顯的分子量大約為38 kDa的蛋白，與Y. lipolytica野生菌產(chǎn)生的YlLip2的分子量大小相當。

在低氧條件下，對照菌株 GS115/9Klip2 58#和GS115/9Klip2-ZαA 9#的表達量都很低，而 GS115/ 9Klip2-pZPVT 28#和GS115/9Klip2-pZPVTlip2 49#表達量較高。

記錄兩組產(chǎn)婦麻醉起效時間、至胎兒娩出時間,針刺法測定兩組產(chǎn)婦最高阻滯平面,用VAS法評價兩組患者鎮(zhèn)痛指數(shù),分數(shù)越高,鎮(zhèn)痛效果越好。

圖3 SDS-PAGE分析YlLip2在畢赤酵母中的表達Fig. 3 SDS-PAGE analysis of YlLip2 expressed in P. pastoris. M: protein marker; 1?4: 4 μL of culture supernatant of GS115/9Klip2 58#, GS115/9Klip2-ZαA 9#, GS115/9Klip2-pZPVT 28#, GS115/9Klip2-pZPVTlip2 49#; 5?8: 5 μL cell homogenates of GS115/9Klip2 58#, GS115/9Klip2-ZαA 9#, GS115/9Klip2-pZPVT 28#, GS115/9Klip2-pZPVTlip2 49#.

2.4 VHb對重組細胞的生長和 YlLip2表達的影響

考察了搖瓶中VHb的表達對VHb+轉(zhuǎn)化子和對照菌株生長和YlLip2表達的影響。由圖4可知，VHb的表達對重組菌的生長沒有明顯促進作用，但能提高YlLip2的表達量。VHb+細胞中YlLip2的表達量與VHb–細胞和對照菌株GS115/9Klip2-ZαA 9#相比分別提高了25%和36%。GS115/9Klip2-pZPVTlip2 49#轉(zhuǎn)化子中YlLip2的表達量與VHb+細胞相比得到了顯著提高。TaqMan實時熒光定量PCR檢測發(fā)現(xiàn)GS115/9Klip2-pZPVTlip2 49#轉(zhuǎn)化子基因組中l(wèi)ip2基因有8個拷貝，而VHb+細胞的基因組中只有4個拷貝，因此拷貝數(shù)的增加導(dǎo)致了YlLip2的表達量進一步提高。

2.5 VHb對高密度發(fā)酵生產(chǎn)YlLip2的影響

為了考察低氧條件下VHb的表達對高密度發(fā)酵生產(chǎn)YlLip2的影響，DO和轉(zhuǎn)速采取串級控制以維持DO在10%~25%之間。由圖5可知，在高密度發(fā)酵過程中，VHb的表達不僅促進了 VHb+細胞的生長，也顯著提高了YlLip2在VHb+細胞中的表達量。

經(jīng)過 153 h的培養(yǎng)，VHb+細胞分泌表達的YlLip2活力達到最大，為15 900 U/mL，是VHb–細胞的 1.83倍。同時對 VHb+轉(zhuǎn)化子 GS115/9Klip2-pZPVTlip2 49#在低氧條件下的高密度發(fā)酵過程進行了研究 (圖 6)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)YlLip2的表達量得到了進一步的提高，經(jīng)過143 h的培養(yǎng)，YlLip2最高活力達到33 900 U/mL，總蛋白質(zhì)含量最高達到6.79 g/L。另外，考察了GS115/9Klip2-pZPVTlip2 49#菌株在不同DO限制性條件下表達YlLip2的水平 (圖7)，發(fā)現(xiàn)在溶氧受限的情況下該工程菌也能獲得較高的表達量，但隨著溶氧濃度的降低，YlLip2的表達量也隨之降低。

圖4 甲醇誘導(dǎo)96 h后VHb+轉(zhuǎn)化子和對照菌株生物量和脂肪酶活力的對比Fig. 4 Comparison of biomass and lipase activity between VHb+ transformants and control strains after 96 h methanol induction. 1: GS115/9Klip2 58#; 2: GS115/9Klip2-ZαA 9#; 3: GS115/9Klip2-pZPVT 28#; 4: GS115/9Klip2-pZPVTlip2 49#. WCW: wet cell weight.

圖5 VHb+和VHb?細胞在DO受限的高密度發(fā)酵過程中細胞生長和脂肪酶活力的對比Fig. 5 Comparison of cell growth and lipase activity between VHb+ and VHb? cells under limiting DO condition during high cell density fermentation. WCW: wet cell weight.

3 討論

YlLip2是目前已報道的脂肪酶中蛋白表達量較高的脂肪酶之一，具有十分廣闊的應(yīng)用前景。為了降低該脂肪酶的生產(chǎn)和應(yīng)用成本，加快其產(chǎn)業(yè)化，許多研究致力于通過分子生物學(xué)的方法和發(fā)酵過程優(yōu)化策略提高其表達量[10-11,14-15]。傳統(tǒng)的誘變育種和同源表達已有效提高了YlLip2的表達量[14-15]，脂肪酶最高的活力達到10 000 U/mL[15]。由于Y. lipolytica基因組中有多個脂肪酶基因[11]，盡管分泌到胞外的脂肪酶主要是YlLip2，但用野生菌株生產(chǎn)很難保證得到的脂肪酶是單一脂肪酶。畢赤酵母表達系統(tǒng)是近年來應(yīng)用十分廣泛的表達系統(tǒng)，在畢赤酵母中異源表達YlLip2能獲得更高的表達量，并且能得到純度較高的單一脂肪酶，發(fā)酵工藝控制較為簡單，總的生產(chǎn)成本也相對較低。當采用橄欖油為底物的堿滴定法測定脂肪酶活力時，Yu等[12]報道畢赤酵母中表達重組的YlLip2的最高活力為11 000 U/mL。本研究中獲得的GS115/9Klip2-pZPVTlip2 49#轉(zhuǎn)化子的最高酶活力達到33 900 U/mL，明顯高于Yu等[11-12]和 Turki等[15]的報道，并且該工程菌的遺傳穩(wěn)定性較好，經(jīng)過 196 h的培養(yǎng)，重組質(zhì)粒保存率為99.7%。

畢赤酵母高密度發(fā)酵大量表達外源蛋白時通常會引起溶氧的限制，若發(fā)酵罐的供氧不足就會直接導(dǎo)致細胞生長緩慢，甲醇及其代謝副產(chǎn)物的積累，最終導(dǎo)致蛋白表達量的下降。改善溶氧限制的方法很多，主要包括提高攪拌轉(zhuǎn)速、通氣量、罐壓、調(diào)節(jié)甲醇補料速率、降低溫度、降低發(fā)酵液粘度、通空氣與純氧的混合氣、培養(yǎng)基中添加氧載體等[16]。但以上方法都不能從根本上解決溶氧限制的問題，也無法解決大規(guī)模發(fā)酵罐中由于溶氧分布不均而導(dǎo)致的低氧問題，并且會間接增加發(fā)酵過程的成本。因此，在工程菌中引入透明顫菌血紅蛋白共表達的方法，能有效提高重組細胞對氧的利用率、促進細胞生長、改善細胞的表達量、降低發(fā)酵過程的動力成本。應(yīng)用AOX1強啟動子表達VHb有效促進了外源蛋白的表達[3-4]，但應(yīng)用低氧壓力啟動子 PsADH2表達VHb也能改善重組細胞的生長[8]，提高外源蛋白的表達量[5]，并且對改善重組細胞的呼吸代謝具有其獨特性。細胞在溶氧正常的情況下VHb不表達，不影響重組細胞的正常代謝，在低氧的情況下啟動VHb的表達，可提高細胞對氧的利用、改善細胞的生長，進而提高外源蛋白的表達。但 DO限制性條件下VHb對重組細胞攝氧的改善作用也是有限的，一定的范圍內(nèi) (5%~20%) 對重組細胞表達外源蛋白不會產(chǎn)生較大的影響，但過低的溶氧濃度依然會對VHb+細胞產(chǎn)生不利的影響 (圖7)。

圖6 GS115/9Klip2-pZPVTlip2 49#菌株在10 L發(fā)酵罐中生產(chǎn)YlLip2的脂肪酶活力、生物量和總蛋白濃度的過程變化曲線Fig. 6 Time course of lipase activity, biomass and total protein concentration during the production of YlLip2 using GS115/ 9Klip2-pZPVTlip2 49# strain in a 10-L fermentor. WCW: wet cell weight.

圖7 不同 DO限制性條件對 GS115/9Klip2-pZPVTlip2 49#菌株表達YlLip2的影響Fig. 7 Effect of different limiting DO levels on YlLip2 production by GS115/9Klip2-pZPVTlip2 49# strain.

本研究中成功構(gòu)建了VHb的胞內(nèi)表達和YlLip2胞外分泌表達的重組工程菌株，vgb和 lip2基因的表達分別通過PsADH2和AOX1啟動子調(diào)控。在搖瓶發(fā)酵中，VHb在低氧條件下的表達對重組菌的生長沒有明顯的促進作用，但使YlLip2的表達量提高了大約25%。這與VHb同植酸酶在P. pastoris中的共表達對細胞生長無明顯影響，而植酸酶的表達量得到提高的結(jié)果相類似[5]。搖瓶中溶氧測定困難，無法獲知搖瓶中溶氧的限制程度，可能是由于搖瓶中氧的濃度過低導(dǎo)致 VHb+細胞的生長也受到一定抑制。10 L發(fā)酵罐中的實驗證實了低氧條件下VHb的表達改善了VHb+細胞的生長，提高了YlLip2的表達量，因此有效改善了發(fā)酵罐中溶氧的限制，也間接降低了發(fā)酵過程的動力成本。本研究中獲得的一株含有 8個 lip2基因拷貝的 VHb+轉(zhuǎn)化子GS115/9Klip2-pZPVTlip2 49#，在低氧的高密度發(fā)酵過程中YlLip2的最高活力達到33 900 U/mL，明顯高于Yu等[10-11]在溶氧正常條件下單獨表達lip2基因獲得的YlLip2的表達量，為該脂肪酶的大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)和應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。因此，基于以上結(jié)果，我們認為PsADH2啟動子調(diào)控下的vgb基因與其他工業(yè)酶基因在畢赤酵母中的共表達將能促進細胞生長、提高外源蛋白的表達量，這種策略具有重要的應(yīng)用前景。

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