薛云，趙戰(zhàn)勤，裴潔，王臣，丁軻，程相朝

1 河南科技大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，洛陽 471003

2 河南科技大學(xué)醫(yī)學(xué)技術(shù)與工程學(xué)院，洛陽 471003

3 湖北省動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，武漢 430064

支 氣 管 敗 血 波 氏 桿 菌 (Bordetella bronchiseptica，Bb) 是一種革蘭氏陰性需氧小桿菌，可廣泛感染多種哺乳動(dòng)物，表現(xiàn)為呼吸道的急慢性炎癥[1]。在豬群中，Bb可引起豬發(fā)生萎縮性鼻炎(Atrophic rhinitis，AR) 和支氣管肺炎，世界豬群有25%~50%受感染，已成為豬的重要傳染病之一[2]。2003~2008年，筆者從全國(guó)各地3 506份有呼吸道癥狀的豬肺臟病料中分離到 652株 Bb，分離率高達(dá)18.6%，各省份之間沒有明顯差異，表明Bb在我國(guó)豬場(chǎng)廣泛流行和致病[3]。近年來發(fā)現(xiàn)，Bb可從家畜等動(dòng)物傳染給人類，并在免疫功能缺陷或低下的人群 (如AIDS患者) 體內(nèi)形成嚴(yán)重感染，因此引起高度關(guān)注[4]。

目前，用于預(yù)防和控制該病的疫苗主要有滅活菌苗和類毒素苗，其中類毒素苗免疫效果優(yōu)于滅活菌苗，不同型菌株的類毒素具有交叉保護(hù)[4]。皮膚壞死毒素 (Dermonecrotic toxin，DNT) 是 Bb定居于宿主上呼吸道所必需的致病因子，缺失 dnt基因的 Bb突變株無法導(dǎo)致豬發(fā)生支氣管肺炎和鼻甲骨損傷[5]。此外，DNT還通過損壞呼吸道上皮細(xì)胞而間接地促進(jìn)Bb的附著作用[5-6]。DNT存在于胞漿內(nèi)，不耐熱，對(duì)福爾馬林敏感，滅活后仍具有抗原性，可刺激機(jī)體產(chǎn)生抗毒素中和抗體[7]。然而，天然DNT的分泌量非常有限，不到菌體蛋白的0.8%[8]，且純化工藝復(fù)雜，因此通過提純天然DNT來制備類毒素苗成本太高，不適合規(guī)?；a(chǎn)。本研究旨在通過分子生物學(xué)方法對(duì)毒素基因進(jìn)行克隆、表達(dá)和生物學(xué)活性研究，為DNT的分子致病機(jī)理和新型亞單位疫苗的研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 菌株、質(zhì)粒、試劑和試驗(yàn)動(dòng)物

豬源 Bb強(qiáng)毒菌株 HH0809 (FHA+，PRN+，DNT+)[9]、大腸桿菌 DH5α和 BL21、載體質(zhì)粒pET-28a、HH0809株豬陽性血清由河南科技大學(xué)動(dòng)物病原微生物實(shí)驗(yàn)室保存；LB培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)BD公司；LA Taq DNA聚合酶、T4 DNA連接酶、限制性內(nèi)切酶等購(gòu)自大連 TaKaRa公司；基因組提取試劑盒和UNIT-10柱式DNA膠回收試劑盒購(gòu)自上海Sangon公司；His-band purification kit購(gòu)自德國(guó)Novagen公司。天然DNT抗血清、辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗豬 IgG 和弗氏佐劑購(gòu)自美國(guó)Sigma-Aldrich公司；新西蘭大白兔、5~6日齡BALB/c乳鼠由河南科技大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.2 dnt基因的克隆、序列分析及表達(dá)載體的構(gòu)建

利 用 HMMTOP 軟 件[10](http://www.cn. expasy.org/tools/) 對(duì) GenBank上公布的 dnt基因(Accesion No. U59687) 編碼的氨基酸序列進(jìn)行跨膜性預(yù)測(cè)，為 dnt的引物設(shè)計(jì)和高效表達(dá)提供理論依據(jù)。設(shè)計(jì)3對(duì)引物 (由北京AuGCT公司合成)，分別引入BamHⅠ和Hind Ⅲ酶切位點(diǎn) (下劃線部分)，并在P2和P4中引入終止密碼子 (表1)。3對(duì)引物分別擴(kuò)增其N端 (dntN)、中間部分 (dntM) 和C端(dntC) 的編碼區(qū)域 (圖1)。按試劑盒說明書提取Bb HH0809株基因組為模板，使用引物P1/P2進(jìn)行PCR，擴(kuò)增dntN片段并回收產(chǎn)物。使用BamHⅠ與Hind Ⅲ分別對(duì)PCR產(chǎn)物和pET-28a載體質(zhì)粒進(jìn)行酶切、回收、連接構(gòu)建重組質(zhì)粒，命名為pET-dntN。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，篩選陽性克隆，提取質(zhì)粒，進(jìn)行酶切鑒定和序列測(cè)定 (由大連 TaKaRa公司完成)。按同樣的方法使用引物P3/P4和P5/P6進(jìn)行PCR并構(gòu)建重組質(zhì)粒 pET-dntM和 pET-dntC。最后利用dnt基因含有的酶切位點(diǎn)SmaⅠ和ScaⅠ將dntM 和dntC片段克隆到pET-dntN上構(gòu)建含有dnt整個(gè)編碼區(qū)的重組質(zhì)粒pET-dnt (圖1)。

1.3 基因的表達(dá)、純化和Western blotting分析

將重組質(zhì)粒pET-dnt轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21，挑取單菌落于含有卡那霉素 (終濃度為50 mg/L) 的LB培養(yǎng)基中，37 ℃、225 r/min搖床培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí) (OD600=0.6~1.0)，加入0.8 mmol/L IPTG (Isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside) 誘導(dǎo)表達(dá)4 h。通過 12% SDS-PAGE分析蛋白的表達(dá)特性。應(yīng)用His-band purification kit試劑盒對(duì)表達(dá)產(chǎn)物 (命名為His6-PRN) 進(jìn)行純化。蛋白濃度通過分光光度計(jì)進(jìn)行測(cè)定，純度經(jīng)SDS-PAGE電泳和Bio-Rad Quantity One program (美國(guó)Bio-Rad公司) 進(jìn)行分析。對(duì)純化的各表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行Western blotting分析，一抗為天然DNT抗血清 (購(gòu)自美國(guó)Sigma-Aldrich公司)，二抗為辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗豬IgG。

1.4 乳鼠皮膚壞死試驗(yàn)

按文獻(xiàn)[6]所述方法，將Bb菌株HH0809在含有15%脫纖綿羊血的鮑-姜氏平板上培養(yǎng)，并對(duì)其培養(yǎng)物進(jìn)行天然DNT的提取，并按1.3所述方法進(jìn)行濃度和純度分析。將重組蛋白His6-DNT和天然DNT均調(diào)整至濃度為100 mg/L，通過頸部皮下途徑分別注射 5只乳鼠 (50 μL/只)。按相同的方法將兩者的滅活溶液 (經(jīng)56 ℃水浴30 min) 以及無菌 PBS各注射 5只乳鼠為對(duì)照 (表 2)。觀察乳鼠皮膚壞死情況至48 h。接種部位僅出現(xiàn)小紅點(diǎn)判為輕微病變，接種部位出現(xiàn)直徑大于或等于1 cm的壞死灶判為嚴(yán)重病變，介于兩者之間的判為中度病變。

表1 實(shí)驗(yàn)中所用引物Table 1 PCR primers used in this study

圖1 dnt基因的結(jié)構(gòu)及其分段克隆Fig. 1 Structure of the constructed dnt segments.

表2 重組蛋白His6-DNT的乳鼠皮膚壞死試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Dermonecrotic effects of His6-DNT in the infant mouse assay

1.5 乳鼠皮膚壞死阻斷試驗(yàn)

將表達(dá)產(chǎn)物His6-DNT的蛋白質(zhì)溶液加入0.4%甲醛溶液，滅活 48 h，取滅活后的 His6-DNT蛋白150 μg與等體積弗氏完全佐劑均勻混合，皮下注射新西蘭大白兔，分別在 3、5、7周后各加強(qiáng)免疫 1次 (使用弗氏不完全佐劑)。在最后一次免疫后10 d進(jìn)行心臟采血，分離血清，0.22 μm濾膜過濾除菌，?20 ℃保存?zhèn)溆?。將兔抗His6-DNT血清0.5 mL與1.4中提取的天然DNT蛋白50 μg均勻混合，37 ℃孵育30 min。然后，將孵育后的混合物按1.4所述方法分別接種5只乳鼠 (50 μL/只) 并進(jìn)行觀察。同時(shí)，設(shè)His6-DNT兔抗血清、天然DNT蛋白以及無菌PBS組為對(duì)照。

2 結(jié)果與分析

2.1 dnt基因的序列分析及其重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建

GenBank上公布的 dnt基因 (Accession No. U59687) 編碼區(qū)全長(zhǎng)為4 356 bp，編碼1 451個(gè)氨基酸，HMMTOP軟件的分析結(jié)果表明，DNT的氨基酸序列存在1個(gè)跨膜區(qū)，位于約第99~118氨基酸之間，對(duì)應(yīng)于 DNT信號(hào)肽序列位置[6]。ProtParam軟件的分析結(jié)果表明，DNT的分子結(jié)構(gòu)式為C7186H11258N2040O2092S31，理論 pI值為 6.20，脂肪系數(shù)為94.83，不穩(wěn)定系數(shù)為40.75，屬于不穩(wěn)定型蛋白質(zhì)。

本研究中，將PCR產(chǎn)物進(jìn)行0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，表明成功擴(kuò)增了 dnt基因的 3個(gè)片段dntN、dntM和dntC，擴(kuò)增的片段大小分別為876 bp、1 854 bp和1 832 bp (圖2A)。酶切鑒定結(jié)果表明，構(gòu)建的 3個(gè)重組質(zhì)粒 pET-dntN、pET-dntM 和pET-dntC均正確 (圖2B)。最后利用dnt基因含有的酶切位點(diǎn)SmaⅠ和ScaⅠ將dntM和dntC片段克隆到pET-dntN上構(gòu)建含有dnt整個(gè)編碼區(qū)4 356 bp的重組質(zhì)粒pET-dnt。將pET-dnt進(jìn)行BamHⅠ和Hind Ⅲ雙酶切，得到大小為5 000 bp和4 356 bp左右的2條帶，與預(yù)期DNA片段相符 (圖2C)。測(cè)序結(jié)果進(jìn)一步表明dnt基因片段在pET-28a表達(dá)載體中得到正確連接。本研究克隆的 dnt全基因序列與 GenBank公布的3個(gè)序列U59687、AB020025、E17214的核苷酸序列同源性均在99.6%以上；有6個(gè)核苷酸發(fā)生突變，最終導(dǎo)致4個(gè)氨基酸發(fā)生改變。

2.2 DNT的表達(dá)和Western blotting分析

SDS-PAGE結(jié)果表明 (圖3)，含pET-dnt重組質(zhì)粒的大腸桿菌BL21在約145 kDa處有明顯的表達(dá)帶，以包涵體形式存在，與以前報(bào)道的該蛋白的分子量大小相符合[6]。pET-28a空載體對(duì)照沒有對(duì)應(yīng)的表達(dá)帶。經(jīng)Bio-Rad Quantity One program進(jìn)行分析，重組蛋白 His6-DNT的表達(dá)量占菌體總蛋白的42.3%。提取的包涵體經(jīng)過復(fù)性，并使用組氨酸融合蛋白純化試劑盒 His-band purification kit進(jìn)行純化后，得到濃度為302.1 μg/mL、純度為93.2%的融合蛋白His6-DNT (圖3)。Western blotting分析表明，重組DNT蛋白His6-DNT能夠與天然DNT的抗血清發(fā)生特異性的免疫反應(yīng)，空載體對(duì)照誘導(dǎo)物則不能(圖3)。這證實(shí)克隆基因片段得到正確表達(dá)，并具有良好的反應(yīng)原性。

圖2 dnt基因的分段擴(kuò)增及其重組質(zhì)粒的酶切鑒定Fig. 2 The amplification of dnt gene fragements and identification of the recombinant plasmids by enzyme digestion. (A) M: marker DL 2 000; 1, 3 and 5: PCR products of dntN, dntM, and dntC fragements; 2, 4, 6: negative control. (B) M1 and M2: marker DL 15 000 and DL 2 000; 1?4: enzyme digestion analysis of pET-dntN, pET-dntM, pET-dntC and pET-28a by BamHⅠand Hind Ⅲ , respectively. (C) M: marker DL 15 000; 1: pET-dnt digested with both BamHⅠand Hind Ⅲ; 2: pET-dnt digested with BamHⅠ.

圖3 表達(dá)產(chǎn)物的SDS-PAGE和Western blotting結(jié)果Fig. 3 SDS-PAGE and Western blotting analysis of the recombinant His6-DNT proteins. M: protein marker; 1 and 2: cell pellets and supernatants of Escherichia coli BL21 harboring pET-DNT plasmid; 3 and 4: crude lysates of BL21 harboring pET-DNT or pET-28a plasmid; 5: purified His6-DNT; 6 and 7: Western blotting of the purified His6-DNT and the PBS control with anti-DNT. His6-DNT proteins are indicated by the arrow.

2.3 His6-DNT的乳鼠皮膚壞死試驗(yàn)

乳鼠皮膚壞死試驗(yàn)結(jié)果表明 (表 2)，表達(dá)蛋白His6-DNT在48 h內(nèi)可以使5~6日齡乳鼠發(fā)生中度的皮膚壞死病變，天然毒素DNT則可使乳鼠全部發(fā)生嚴(yán)重病變。天然DNT和表達(dá)蛋白His6-DNT經(jīng)56 ℃水浴30 min滅活后則完全喪失了使乳鼠皮膚發(fā)生壞死的能力 (圖4)。注射無菌PBS的1組乳鼠也未出現(xiàn)任何皮膚壞死病變。這些試驗(yàn)結(jié)果表明，雖然重組蛋白His6-DNT低于天然DNT的毒素活性，但仍具有導(dǎo)致乳鼠皮膚壞死的生物學(xué)毒性作用。

2.4 乳鼠皮膚壞死阻斷試驗(yàn)

結(jié)果表明，天然DNT能導(dǎo)致乳鼠發(fā)生嚴(yán)重的皮膚壞死病變 (圖 5B)。但是，天然 DNT蛋白與His6-DNT兔抗血清混合孵育后，完全喪失了導(dǎo)致乳鼠皮膚壞死的能力，注射的5只乳鼠均沒有出現(xiàn)明顯病變 (圖5A)。這表明天然DNT與His6-DNT的兔抗血清發(fā)生了中和反應(yīng)從而喪失了導(dǎo)致乳鼠皮膚壞死的生物學(xué)毒性作用。這也進(jìn)一步證明，重組蛋白不僅具有Western blotting試驗(yàn)中所顯現(xiàn)的良好反應(yīng)原性，也具有較強(qiáng)的免疫原性。

圖4 重組蛋白His6-DNT能導(dǎo)致乳鼠皮膚壞死Fig. 4 Dermonecrotic effect of His6-DNT in the infant mice. (A) Inactived His6-DNT could not cause lesions (arrow). (B) Natural DNT could cause severe lesions. (C and D) His6-DNT could cause lesions. Lesion was showed after being wetted with PBS.

圖5 DNT的乳鼠皮膚壞死阻斷試驗(yàn)結(jié)果Fig. 5 Inhibition of dermonecrotic effect of DNT in the infant mouse assay. (A) Natural DNT neutralized with rabbit anti-His6-DNT could not cause dermonecrotic effect (arrow). (B) Natural DNT could cause severe dermonecrotic effect (arrow).

3 討論

Bb的dnt基因全長(zhǎng)4 356 bp，國(guó)外學(xué)者均使用酶切基因組后雜交的方法獲取 dnt基因，尚未使用PCR方法?？紤]到本研究若選用普通的 DNA聚合酶進(jìn)行擴(kuò)增，很難保證片段的保真度，故改用LA Taq DNA聚合酶擴(kuò)增長(zhǎng)片段，但擴(kuò)增比較困難。最后采用分段擴(kuò)增的方法，分三段擴(kuò)增 dnt基因，再利用序列中的2個(gè)酶切位點(diǎn)SmaⅠ和ScaⅠ與載體的多克隆位點(diǎn)進(jìn)行拼接，最終獲得4 356 bp的dnt全基因片段。序列分析表明，該dnt基因與GenBank上所報(bào)道的 3個(gè)dnt基因序列具有高度的同源性，無插入和缺失突變。

本研究是國(guó)內(nèi)首次在大腸桿菌中成功地用原核表達(dá)系統(tǒng)融合表達(dá)了 Bb完整的 dnt基因。SDS-PAGE結(jié)果表明，重組質(zhì)粒pET-dnt在大腸桿菌 BL21中誘導(dǎo)表達(dá)的產(chǎn)物 His6-DNT約占整個(gè)蛋白的 42.3%，表達(dá)量大且易于純化。而天然 DNT毒素在 Bb的表達(dá)量?jī)H占 0.8%，且難于純化[8]。Western blotting檢測(cè)結(jié)果顯示，該重組蛋白具有良好的免疫學(xué)活性，這為研制開發(fā)基因工程疫苗提供了可靠的試驗(yàn)基礎(chǔ)。dnt基因的高效表達(dá)為進(jìn)一步研究 DNT毒素蛋白的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)、理化特性打下了基礎(chǔ)，而且對(duì)于毒素作用機(jī)制以及致病機(jī)理的研究提供了試驗(yàn)材料。

乳鼠皮膚壞死試驗(yàn)結(jié)果顯示，雖然重組His6-DNT低于天然DNT毒素的生物學(xué)毒性，但仍然能夠?qū)е氯槭蟀l(fā)生中等程度的皮膚壞死。重組蛋白以包涵體形式存在是其活性降低的一個(gè)主要原因，即使經(jīng)過變性、復(fù)性處理，活性只能部分恢復(fù)。這些因素都會(huì)影響表達(dá)產(chǎn)物 His6-DNT的生物學(xué)活性。在乳鼠皮膚壞死阻斷試驗(yàn)中，His6-DNT的兔抗血清能夠中和天然 DNT使其失去針對(duì)乳鼠的生物學(xué)毒性作用。這表明重組蛋白也具有良好的免疫原性。同時(shí)也預(yù)示著，重組 DNT抗原不僅可用于主動(dòng)免疫預(yù)防，也可通過制備抗血清用于波氏菌病的治療。

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