吳丹，儲炬，王永紅，莊英萍，張嗣良

1 江南大學食品科學與技術國家重點實驗室，無錫 214122

2 華東理工大學生物反應器國家重點實驗室，上海 200237

重組人復合 α干擾素 (cIFN) 是一種氨基酸序列重組的非天然存在的Ⅰ型α干擾素。是由Amgen公司的研究者對當時已知的13種人α干擾素的序列進行比較研究，把出現(xiàn)頻率最高的氨基酸分配到各個相應的位置上，并對個別氨基酸進行了修改，得到了由166個氨基酸組成的復合α干擾素[1]。復合α干擾素集中了各種天然干擾素的優(yōu)點，具有更強、更廣譜的抗病毒作用，體外生物活性實驗證明，cIFN的生物活性是其他兩種常用干擾素 (IFN-α2a、IFN-α2b) 的5~10倍[2]。畢赤酵母表達系統(tǒng)是一種比較理想的真核微生物表達系統(tǒng)，兼有原核細胞的可操縱性和真核細胞的翻譯后加工的雙重優(yōu)點，用其表達的重組蛋白更接近天然蛋白的構象，是外源基因表達的理想宿主[3]。另外畢赤酵母自身分泌的蛋白 (背景蛋白) 非常少，能以很高的純度 (30%~80 %的胞外總蛋白) 表達分泌重組蛋白[4]，這樣能簡化分離純化工藝，對工業(yè)化生產(chǎn)十分有利。

甲醇既作為誘導劑誘導畢赤酵母表達外源蛋白，還同時作為碳源為酵母生長提供能量，因此甲醇的控制對外源蛋白的表達影響很大。目前有關甲醇影響酵母表達的研究主要集中在如何控制酵母生長和增加外源蛋白表達量上，如混合碳源流加[5]，控制比生長速率流加[6]，控制一定甲醇濃度流加[7]等。畢赤酵母表達蛋白時也會有信號肽加工不完全、形成聚合體、蛋白降解等特征導致目的蛋白表達的不均一性[8]，造成目的蛋白的減少及后期分離純化的困難。已有研究表明畢赤酵母表達重組人復合 α干擾素中pH[9]、誘導溫度[10]等環(huán)境因素影響畢赤酵母胞外表達外源蛋白時發(fā)酵液中重組蛋白質穩(wěn)定性，但是甲醇濃度影響酵母表達外源蛋白的穩(wěn)定性鮮見報道。本課題組采用畢赤酵母工程菌在復合培養(yǎng)基中表達重組人復合α干擾素cIFN時，遇到不同的甲醇濃度下 cIFN的分離純化得率差別非常大的現(xiàn)象。本文對這種現(xiàn)象進行了分析，發(fā)現(xiàn)在不同甲醇濃度下 cIFN的存在狀態(tài)有很大的變化，較高甲醇濃度時大量的cIFN聚合會造成cIFN單體減少。本文著重分析了不同甲醇濃度和 cIFN穩(wěn)定性之間的關系。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

畢赤酵母工程菌 Pichia pastoris GS115/ pPIC9-cIFN (R164S)。遺傳表型Mut+his+，啟動子為PAOX1，載體 pPIC9K，信號肽序列來自釀酒酵母Saccharomyces cerevisiae的α-MF，外源基因為編碼重組人復合α干擾素的基因，載體呈線型整合在染色體上，該菌種由北京軍事醫(yī)學科學院劉志敏教授提供。

1.1.2 主要試劑

復合干擾素標品干復津購自美國Amgen公司，鼠抗人α干擾素單抗購自Abcam公司，羊抗鼠過氧辣根化酶購自華美生物工程公司，酵母提取物購自Oxiod公司，胰蛋白胨購自日本制藥株式會社，酵母基本氮源 (YNB) 購自 Difco公司，疏水填料Phenyl-Sepharose FF、陰離子交換色譜填料 DEAE Sephadex A-25匍聚糖凝膠和離子交換色譜填料Sephacyal-HR200購自美國Amersham公司。其他化學試劑均為分析純，購自國藥集團化學試劑公司。

1.2 培養(yǎng)方法

1.2.1 種子培養(yǎng)方法

挑取YPG平板上的新鮮Pichia pastoris GS115/ pPIC9-cIFN (R164S) 單菌落，接入含有 50 mL BMGY種子培養(yǎng)基的500 mL三角瓶中，于30 ℃、220 r/min培養(yǎng)至OD為6~8時，將50 mL種子培養(yǎng)液全部接入5 L發(fā)酵罐中 (含1.8 L的復合培養(yǎng)基見1.2.3)。

1.2.2 5 L罐發(fā)酵培養(yǎng)

甘油生長期和過渡期溫度控制30 ℃，pH為5.4，通過調節(jié)攪拌轉速200~900 r/min之間來維持溶解氧(DO) 在 30%以上。當基礎料中的甘油耗盡后，此時DO急劇上升，開始流加濃度為50%甘油，并以維持DO在40%為依據(jù)控制甘油補料速率，當細胞干重 (DCW) 到達30后停止補甘油。進入甲醇誘導期后，以在線甲醇電極 (華東理工大學，中國上海)監(jiān)控發(fā)酵液中的甲醇殘留濃度來控制甲醇流加速率，分別以 0.25%、0.5%、0.75%三個甲醇濃度進行研究。誘導期間維持DO＞20%，當溶氧過低時通入富氧空氣。通過氨水和酵母生長自身產(chǎn)酸控制甲醇誘導期的pH，誘導溫度為25 ℃。

1.2.3 發(fā)酵培養(yǎng)基

復合培養(yǎng)基：酵母提取物 10 g/L，蛋白胨20 g/L，YNB 13.4 g/L，甘油28 g/L，消泡劑 289 0.2 g/L溶入0.1 mol/L (pH 6.0) 的磷酸緩沖液中。添加 1 mmol/L PMSF (Phenylmethanesulfonyl fluoride) 的絲氨酸蛋白酶抑制劑。

補料：50%的甘油，100%甲醇，分別加入PTM112 mL于每升補料溶液中。

1.3 分析方法

1.3.1 cIFN的分離純化

先用 30%飽和度硫酸銨沉淀發(fā)酵液上清中的cIFN，沉淀離心后重新溶于 0.8 mol/L的硫酸銨(pH 8.3) 上樣 Phenyl-Sepharose FF疏水柱，用0.5 mol/L 硫酸銨洗脫后透析，樣品濃縮后上樣DEAE Sephadex A-25陰離子交換柱，采用0.3 mol/L NaCl洗脫，收集含目的蛋白洗脫峰，濃縮后采用 Sephacyal-HR200分子篩柱層析進行最后脫鹽純化。

1.3.2 菌體濃度

取1 mL發(fā)酵液，12 000 r/min離心10 min，去上清液，用0.1 mol/L稀鹽酸洗滌2次，離心后吸干表面水分稱其濕重，80 ℃烘干至恒重稱其干重。

1.3.3 目的蛋白cIFN濃度測定

將蛋白還原電泳結果經(jīng)掃描輸入計算機，以干復津為標準品，采用TotalLab v1.11凝膠圖像處理軟件分析，根據(jù)還原電泳條帶染色強度進行定量分析。

1.3.4 蛋白電泳

凝膠配方和電泳操作過程參照《蛋白質電泳實驗技術》[11]方法進行。還原電泳濃縮膠濃度為5%，分離膠濃度為15%；天然電泳濃縮膠濃度為3%，分離膠濃度為6%，考馬斯亮藍染色。

1.3.5 cIFN免疫印跡 (Western blotting)

電泳后的凝膠不進行染色，直接將上面的蛋白轉到硝酸纖維膜上，先用50 mmol/L Tris-HCl (pH 7.6) 緩沖液洗滌，再用5%的脫脂奶粉 (PBST稀釋，PBST：0.01 mol/L PBS+0.05% Tween，pH 7.5) 作為封閉液封閉，再用含有1∶1 000的鼠抗人α干擾素單抗室溫反應2 h，洗滌后用含有1∶500羊抗鼠過氧辣根化酶室溫反應2 h，洗滌后最后用新鮮制備的底物二氨基聯(lián)苯胺溶液 (DAB溶液) 顯色5 min，用去離子水沖洗終止顯色反應。

1.3.6 生物活性測定

生物活性測定：采用細胞病變抑制法[12]，采用WISH細胞/VSV系統(tǒng)測定。

2 結果

2.1 不同濃度甲醇誘導下細胞生長和表達情況分析

采用補料分批發(fā)酵控制策略，當細胞干重(DCW) 到達 30左右開始進入甲醇誘導期。用甲醇電極維持發(fā)酵液中甲醇濃度在 0.25%、0.5%和0.75%三個值來控制甲醇的流加。由于甲醇用來誘導和同時提供碳源，因此甲醇濃度越高細胞生長越快 (圖1A)。酵母對cIFN的表達量也顯示出類似的趨勢，甲醇的濃度越高，表達水平越高，誘導66 h后0.25%、0.5%和0.75%甲醇濃度對應的cIFN表達水平分別為1.66、1.87和2.06 g/L。圖1可以看出利用畢赤酵母高效表達 cIFN時重組蛋白的分泌同細胞的生長緊密相連，細胞生長則cIFN含量增加，細胞停止生長時cIFN含量也保持不變，這在甲醇濃度為 0.75%時表現(xiàn)尤為明顯。當然甲醇濃度也并非越高越好，超過一定濃度反而對細胞造成毒害作用。在本研究中，如果單從表達量來看，0.75%甲醇濃度似乎是表達cIFN的最佳甲醇濃度。

2.2 不同濃度甲醇誘導下cIFN分離純化分析

畢赤酵母分泌性表達外源蛋白的優(yōu)勢之一就是其自身內源性蛋白很少分泌到發(fā)酵液中，這非常有利于后期重組蛋白的分離純化工作。然而在本研究中很奇怪的是，誘導66 h后在0.75%高甲醇濃度下雖然cIFN表達量最高，但是其分離純化的得率卻非常低，反之，雖然0.25%的低甲醇濃度下cIFN表達量有所下降，但是其得率很高，最終獲得的cIFN純品反而要大大高于0.75%的甲醇濃度所誘導 (表1)。分析表 1數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)在高甲醇濃度下，疏水層析這一步損失很大，得率只有 25.2%，相比之下低甲醇濃度的這一步得率則達到 87.5%。只有在高甲醇濃度誘導下發(fā)酵液中 cIFN的性質改變才可能導致這種較大的純化損失。為了進一步驗證這種可能性，我們又繼續(xù)分析了各自發(fā)酵液的cIFN生物活性，結果發(fā)現(xiàn)高甲醇濃度誘導下發(fā)酵液中 cIFN比活僅為低甲醇濃度下的七分之一 (表 2)。這些研究結果顯示，雖然在0.75%甲醇濃度下cIFN表達量最高，但是其發(fā)酵液比活最低，有可能在高甲醇濃度下cIFN不是以單體狀態(tài)存在，考慮到前人發(fā)現(xiàn)在較高溫度下誘導容易產(chǎn)生cIFN聚合體[10]，我們推測在高甲醇濃度條件下發(fā)酵液中 cIFN也可能大部分以聚合體形式存在。

2.3 不同濃度甲醇誘導下cIFN穩(wěn)定性分析

2.3.1 共價聚合情況分析

從圖2非還原和還原SDS-PAGE電泳免疫印跡比較，在非還原條件下泳道 1~3均可以看到 cIFN聚合體，只是各自的聚合程度有很大差別。代表0.75%高甲醇濃度誘導的泳道1有低聚體、三聚體、二聚體和單體，代表0.5%甲醇濃度誘導的泳道2可以看出明顯的二聚體和三聚體，而代表 0.25%低甲醇濃度誘導的泳道 3中只能看到微量的二聚體。由此可見，不同誘導甲醇濃度對cIFN的穩(wěn)定性有很大影響，高甲醇濃度下cIFN不穩(wěn)定，容易形成各種聚aAmmonium sulfate precipitation;bPhenyl-Sepharose FF chromatography;cDEAE Sephadex A-25 chromatography;dSephacyal-HR200 chromatography;ePurified cIFN per liter supernatant.合體，而低甲醇濃度下cIFN穩(wěn)定性明顯要好。將同樣的樣品進行還原SDS-PAGE電泳分析，從泳道4~6可以看出經(jīng)過還原電泳后所有在非還原狀態(tài)下存在的聚合體均消失。非還原電泳只能打開由疏水作用、氫鍵、靜電作用、范德華力等非共價鍵結合的作用力，而還原電泳還可以打開非還原電泳不能打開的二硫鍵，說明非還原電泳圖上顯示的各種聚合體是通過二硫鍵結合的。cIFN單體含有2對分子內二硫鍵，在還原電泳中由于二硫鍵破壞蛋白質結構處于松散狀態(tài)，影響其電泳泳動速率，所以其表觀分子量要大于非還原電泳，導致對應的Western blotting上的單體位置有微小差別。

圖1 不同誘導甲醇濃度下細胞生長 (A) 和cIFN表達量 (B) 分析Fig. 1 Effect of different methanol concentrations on cell growth (A) and cIFN expression level (B). Error bars stand for standard deviation (SD).

表1 不同誘導甲醇濃度下發(fā)酵液cIFN分離純化分析Table 1 Effect of different methanol concentrations on the purification yield rate of cIFN

表2 不同濃度甲醇誘導下發(fā)酵液cIFN活性分析Table 2 Effect of different methanol concentrations on cIFN bioactivity ± s)

表2 不同濃度甲醇誘導下發(fā)酵液cIFN活性分析Table 2 Effect of different methanol concentrations on cIFN bioactivity ± s)

Methanol concentration (W/V) cIFN bioactivity (108 IU/mL) cIFN specific bioactivity (108 IU/g protein) 0.75 0.52±0.07 0.24±0.03 0.50 1.57±0.13 0.84±0.081 0.25 2.85±0.25 1.72±0.15

圖2 不同濃度甲醇誘導下上清液非還原和還原SDS- PAGE免疫印跡Fig. 2 Western blotting of non-reducing and reducing SDS-PAGE under different methanol concentrations. 1, 4: 0.75%; 2, 5: 0.5%; 3, 6: 0.25%.

另外一個還值得引起注意的現(xiàn)象是，在圖2泳道1中發(fā)現(xiàn)明顯的cIFN雙帶，泳道2中較為明顯，泳道3中基本上不明顯，與此對應的，泳道1二硫鍵共價聚合最嚴重，泳道2次之，泳道3基本無聚合；經(jīng)過還原電泳后泳道1和2中的cIFN (分別對應泳道3和4) 雙帶完全成為一條帶，說明cIFN雙帶很可能是二硫鍵結構不完整的cIFN造成的，正是這種不完整 cIFN的存在導致了發(fā)酵液中共價鍵聚合體的產(chǎn)生。

另外，為了區(qū)別是否是甲醇濃度變化影響cIFN二硫鍵結構從而造成其共價聚合體，我們對含標準cIFN單體 (1 g/L) 的0.25%，0.5%和0.75%濃度甲醇溶液進行攪拌過夜，再用非還原SDS-PAGE分析其聚合體的產(chǎn)生情況。從圖3可以看出，加入cIFN到不同甲醇濃度溶液后攪拌均勻馬上取樣 (泳道1~3) 和攪拌過夜后再取樣 (泳道 4~6) 的非還原電泳圖上沒有看到任何聚合體條帶，同圖 2非還原SDS-PAGE圖中cIFN聚合體形成明顯對比。此結果清晰地顯示甲醇濃度變化不會引起 cIFN結構發(fā)生改變，從而也無法形成各種cIFN聚合體。

2.3.2 非共價聚合情況分析

在 Native-PAGE免疫印跡中，0.75%高甲醇濃度誘導下的發(fā)酵液樣品中的 cIFN單體呈現(xiàn)出微弱的條帶 (圖4，泳道1)，在0.5%甲醇濃度cIFN單體條帶加深 (圖4，泳道2)，而在0.25%甲醇情況下電泳顯示出較濃的cIFN單體條帶 (圖4，泳道3)。不同的是，cIFN單體上方的聚合體拖尾條帶呈現(xiàn)出相反的狀況，在高甲醇濃度誘導下出現(xiàn)明顯的聚合體 (圖4，泳道1)。Tween-80是一種非離子表面活性劑，可以打開蛋白質非共價聚合體而轉變?yōu)閱误w[13]。為了證明這些聚合體是非共價聚合體，在發(fā)酵液中加入Tween-80后再進行同樣電泳 (圖4，泳道4~6)，結果顯示所有樣品的拖尾程度均明顯變輕，而泳道中的cIFN單體的濃度則明顯增加，說明發(fā)酵液上清中存在有非共價聚合體。對圖4泳道1和4樣品的cIFN生物活性測定也顯示，加入 Tween-80后可以使發(fā)酵液活性提高了63%，進一步說明加入Tween后cIFN非共價聚被打開而使單體含量提高。

圖3 不同濃度甲醇溶液中cIFN穩(wěn)定性非還原SDS-PAGE分析.Fig. 3 Western blotting of non-reducing SDS-PAGE at different methanol concentration solutions. 1, 4: 0.75%; 2, 5: 0.5%; 3, 6: 0.25%. 1?3: samples taked at time of cIFN adding into methanol solution; 4?6: samples taked after 12 h at time of adding into methanol solution.

圖4 Tween-80處理前后 3種甲醇濃度誘導下發(fā)酵液上清Native-PAGE免疫印跡Fig. 4 Native-PAGE of supernatant treated without Tween-80 (?) and with Tween-80 (+) under three different methanol concentrations. 1, 4: 0.75%; 2, 5: 0.5%; 3, 6: 0.25%.

3 討論

雖然畢赤酵母現(xiàn)在越來越廣泛用于表達各種外源蛋白，但是重組蛋白質尤其是具有復雜二硫鍵結構的蛋白質在發(fā)酵液中不穩(wěn)定的現(xiàn)象一直是個難題[14-15]。甲醇濃度是畢赤酵母發(fā)酵調控中的一個很重要的參數(shù)，研究都集中在如何優(yōu)化甲醇濃度來提高重組蛋白的產(chǎn)量，卻忽視了它影響重組蛋白的穩(wěn)定性的可能。本研究首次發(fā)現(xiàn)高甲醇濃度誘導雖然可以提高重組蛋白質的表達量，但是卻容易導致重組蛋白質的聚合，雖然表達量很高，但是分離純化的得率卻很低，最終極大地降低了生產(chǎn)效率。本文提示今后在進行畢赤酵母發(fā)酵放大過程中，需要轉變優(yōu)化甲醇濃度僅僅為提高表達量的思路，還應該將甲醇濃度可能會影響重組蛋白質的穩(wěn)定性納入發(fā)酵優(yōu)化考慮的范圍。

二硫鍵對穩(wěn)定蛋白質空間結構起非常重要的作用。當?shù)鞍踪|分子內二硫鍵打開時，游離的-SH基團會在蛋白質分子間形成二硫鍵，這樣就形成了各種二硫鍵共價聚合體。由于蛋白質大部分疏水基團埋在分子內部，二硫鍵的破壞也會使分子內疏水基團暴露出來，這樣也容易導致蛋白質分子間形成疏水性的非共價聚合體[16]。本研究中cIFN形成共價聚合和疏水聚合也正是蛋白質分子內二硫鍵遭到破壞的結果。但關鍵的問題是，cIFN中二硫鍵是如何遭到破壞的？一般認為發(fā)酵過程中長時間的高速攪拌和氣液介面等物理條件作用會破壞蛋白質高級結構而導致聚合體產(chǎn)生[17]。本研究中，首先排除了由于甲醇濃度變化引起的cIFN二硫鍵結構變化。進一步分析在 0.25%低甲醇濃度誘導發(fā)酵過程中的轉速及通氣量和 0.75%的高誘導甲醇濃度相似，但是在低甲醇濃度下卻可以有效避免聚合體的產(chǎn)生，說明cINF的聚合同攪拌等外界因素沒有直接關系，這為今后研究畢赤酵母發(fā)酵過程中重組蛋白質聚合體的來源提供了一個全新的視角。由于甲醇既是細胞利用的碳源又是誘導劑，所以甲醇濃度的變化很容易使細胞的生理發(fā)生改變。Mayson等發(fā)現(xiàn)在1%甲醇濃度下細胞生長迅速，但是最佳的表達量卻是在0.7%甲醇時獲得的[18]。我們推測，高甲醇濃度下細胞生長明顯要快于低甲醇濃度，這樣必然會占用大量的細胞伴侶蛋白如Bip和PDI等以優(yōu)先合成高速生長下自身需要的各種內源性蛋白[19]，如果此時外源蛋白再大量表達，很有可能折疊不完全或者只生成部分二硫鍵，而這種錯誤折疊的蛋白質分泌到胞外后會對重組蛋白的穩(wěn)定性造成影響，該推論還需要進一步實驗來證實。

本文通過還原和非還原SDS-PAGE已經(jīng)發(fā)現(xiàn)發(fā)酵液中有含不完整二硫鍵的cIFN存在，接下來要做的工作是需要確定這些不完整的 cIFN中遭到破壞的是一對二硫鍵還是兩對全部都被破壞，因為二硫鍵的破壞程度不同對其穩(wěn)定性的影響也不同。另外又是何種因素導致了這些二硫鍵不完整的 cIFN的產(chǎn)生？這些研究將能進一步揭示畢赤酵母發(fā)酵過程中重組蛋白不穩(wěn)定的根源，為畢赤酵母發(fā)酵調控提供新的理論依據(jù)。

REFERENCES

[1] Alton K, Stabinsky Y, Richards R, et al. Production, characterization and biological effects of recombinant DNA derived human IFN-α and IFN-β analogs//De Maeyer E, Schellekens H, eds. The Biology of the Interferon System. Amsterdam: Elsevier, 1983: 119?128.

[2] Blatt LM, Davis JM, Klein SB, et al. The biologic activity and molecular characterization of a novel synthetic interferon-alpha species, consensus interferon. J Interferon Cytokine Res, 1996, 16(7): 489?499.

[3] Cregg JM, Tolstorukov I, Kusari A, et al. Expression in the yeast Pichia pastoris. Methods Enzymol, 2009, 463: 169?189.

[4] Wan N, Hoppe HI, Goodrick JC, et al. Expression system for recombinant proteins: EP 1409695A2. 2004-04-21.

[5] Jungo C, Schenk J, Pasquier M, et al. A quantitative analysis of the benefits of mixed feeds of sorbitol and methanol for the production of recombinant avidin with Pichia pastoris. J Biotechnol, 2007, 131(1): 57?66.

[6] Zhang WH, Bevins MA, et al, Plantz BA. Modeling Pichia pastoris growth on methanol and optimizing the production of a recombinant protein, the heavy-chain fragment C of botulinum neurotoxin, serotype A. Biotechnol Bioeng, 2000, 70(1): 1?8.

[7] Schenk J, Marison IW, von Stockar U. A simple method to monitor and control methanol feeding of Pichia pastoris fermentations using mid-IR spectroscopy. J Biotechnol, 2007, 128(2): 344?353.

[8] Wang HH, Gao BY, Chen PL, et al. The analysis and countermeasure of heterogeneity of cIFN expressed in yeast. Sci China: Seri B, 1994, 24(12): 1270?1274.王洪海, 高卜渝, 陳佩麗, 等. 酵母表達基因工程產(chǎn)物不均一性分析及其對策. 中國科學 B輯, 1994, 24(12): 1270?1274.

[9] Zhang S, Hao YY, Chu J, et al. Effect of pH on proteolytic degradation of consensus interferon-α expressed by Pichia pastoris. Chin J Biotech, 2008, 24(1): 164?168.張盛, 郝玉有, 儲炬, 等. pH對畢赤酵母表達重組人復合 α干擾素的降解影響. 生物工程學報, 2008, 24(1): 164?168.

[10] Shi QQ, Hao YY, Wu KH, et al. The effect of induction temperature on aggregation of consensus interferon-α expressed by Pichia pastoris. Chin J Biotech, 2006, 22(2): 311?315.史淇淇, 郝玉有, 吳康華, 等. 誘導相溫度對畢赤酵母表達重組人復合 α干擾素聚合的影響. 生物工程學報, 2006, 22(2): 311?315.

[11] Guo RJ. The Laboratory Technology of Protein Electro-Phoresis. Beijing: Science Press, 1999.郭堯君. 蛋白質電泳實驗技術. 北京: 科學出版社, 1999.

[12] Chinese Biologic Product Standardization Committee Compiled. Chinese Biological Product Regulations. Beijing: Chemical Industry Press, 2000.中國生物制品標準化委員會編. 中國生物制品規(guī)程. 北京: 化學工業(yè)出版社, 2000.

[13] Wang W, Wang YJ, Wang DQ. Dual effects of Tween 80 on protein stability. Int J Pharmaceut, 2008, 347(1/2): 31?38.

[14] Wu D, Hao YY, Chu J, et al. Inhibition of degradation and aggregation of recombinant human consensus interferon-amutant expressed in Pichia pastoris with complex medium in bioreactor. Appl Microbiol Biotechnol, 2008, 80: 1063?1071.

[15] Hao YY, Chu J, Wang YH, et al. Expressionand aggregation of recombinant human consensus interferon-α mutant by Pichia pastoris. Biotechnol Lett, 2006, 28(12): 905?909.

[16] Bhattacharyya R, Pal D, Chakrabarti P. Disulfide bonds, their stereospecific environment and conservation inprotein structures. Protein Eng Des Sel, 2004, 17(11): 795?808.

[17] Woo JH, Liu YY, Neville DM Jr. Minimization of aggregation of secreted bivalent anti-human T cell immunotoxin in Pichia pastoris bioreactor culture by optimizing culture conditions for protein secretion. J Biotechnol, 2006, 121: 75?85.

[18] Mayson BE, Kilburn DG, Zamost BL, et al. Effects of methanol concentration on expression levels of recombinant protein in fed-batch cultures of Pichia methanolica. Biotechnol Bioeng, 2003, 81(3): 291?298.

[19] Xu P, Raden D, Doyle FJ III, et al. Analysis of unfolded protein response during single-chain antibody expression in Saccaromyces cerevisiae reveals different roles for BiP and PDI in folding. Metab Eng, 2005, 7(4): 269?279.