朱秋媚，王宇，劉涵，富瑞麗，劉瑩，劉景會(huì)，顧建陽(yáng)

長(zhǎng)春生物制品研究所有限責(zé)任公司，吉林長(zhǎng)春130062

二硫鍵（S-S 鍵）是通過(guò)蛋白質(zhì)中兩個(gè)半胱氨酸上的巰基（-SH）氧化而形成的，在穩(wěn)定蛋白質(zhì)構(gòu)象和保持其活性方面起著重要作用［1］。重組人生長(zhǎng)激素（recombinant human growth hormone，rhGH）-Fc 是由兩個(gè)相對(duì)分子質(zhì)量為22 125 的GH 與相對(duì)分子質(zhì)量為50 280 的重鏈通過(guò)Linker 連接而成，重鏈之間通過(guò)兩對(duì)鏈間二硫鍵形成同源二聚體［2］?？贵w藥物中二硫鍵的排布是對(duì)其結(jié)構(gòu)特征的一種反映［3］，因此，二硫鍵連接的確認(rèn)成為rhGH-Fc 結(jié)構(gòu)確認(rèn)過(guò)程中非常重要的一環(huán)。

液相色譜質(zhì)譜（liquid chromatography-mass spectrometry，LC-MS）作為一種分析工具，在蛋白質(zhì)藥物研發(fā)前期的結(jié)構(gòu)表征、工藝優(yōu)化、關(guān)鍵質(zhì)量屬性分析以及質(zhì)量控制中有普遍應(yīng)用［4］，LC-MS 能夠精確測(cè)定多肽及蛋白質(zhì)的相對(duì)分子質(zhì)量，且通過(guò)二級(jí)碎片信息可解析肽段的氨基酸序列［5］，特別是蛋白質(zhì)藥物的二硫鍵確認(rèn)和翻譯后修飾分析，質(zhì)譜的作用不可或缺［6］?；谫|(zhì)譜技術(shù)的分析方法能應(yīng)用于蛋白質(zhì)藥物生產(chǎn)的各個(gè)階段，提供蛋白質(zhì)藥物的一級(jí)序列信息（包括翻譯后修飾）、高級(jí)結(jié)構(gòu)分析以及構(gòu)象研究等［7-8］。因此，本研究采用LC-MS 建立特異的方法，對(duì)rhGH-Fc 的二硫鍵進(jìn)行解析。

1 材料與方法

1.1 樣品 rhGH-Fc 為本公司制備。

1.2 主要試劑及儀器 鹽酸胍購(gòu)自美國(guó)Gibco 公司；碘乙酰胺（iodoacetamide，IAM）購(gòu)自美國(guó) Sigma公司；胰酶購(gòu)自美國(guó)Promega 公司；乙腈（LC-MS 級(jí)）購(gòu)自美國(guó)Honeywell 公司；甲酸（LC-MS 級(jí)）購(gòu)自美國(guó)Fisher 公司；碳酸氫銨（分析純）購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；超濾管購(gòu)自美國(guó)Millipore 公司；AcQuity 液相色譜系統(tǒng)、色譜柱CSHC1（82.1 mm ×100 mm，130 ?，1.7 μm）、G2-XS 精確質(zhì)量四級(jí)桿飛行時(shí)間（Q-TOF）液質(zhì)聯(lián)用系統(tǒng)和UNIFI 軟件購(gòu)自美國(guó)Waters 公司。

1.3 樣品的制備 取 200 μL 樣品，加入 600 μL 鹽酸胍（8 mol ／ L），50 ℃水浴 0.5 h；取出放至室溫，加入8 μL 碘乙酰胺（1 mol ／ L），避光 30 min；取上述樣品加入超濾管中，13 201 × g 離心5 min，棄去濾過(guò)液，加入50 mmol ／ L NH4CO（3pH 8.0）緩沖液置換，離心操作10 次，最后用50 mmol ／ L NH4CO（3pH 8.0）緩沖液將蛋白濃度調(diào)節(jié)至0.3 mg ／ mL。分別按胰酶 ∶蛋白 1 ∶15 的比例加入胰酶，37 ℃酶解4 h。

1.4 液相色譜條件 色譜柱：CSHC1（82.1 mm×100 mm，130 ?，1.7 μm）；流動(dòng)相 A：100%水（含 0.1%甲酸）；流動(dòng)相B：100%乙腈（含0.1%甲酸）；流速：0.3 mL／min；柱溫：65 ℃；上樣量：5 μL；梯度洗脫表見(jiàn)表 1。

表1 液相梯度洗脫表Tab.1 Gradient elution in LC

1.5 質(zhì)譜條件 MSE采集模式；毛細(xì)管電壓：2 500 V；Cone 電壓：40 V；去溶劑氣體溫度：350 ℃；源溫：120 ℃；去溶劑氣體流速：600 L ／ h；一級(jí)質(zhì)譜掃描范圍：100 ~ 2 000 m ／ z。

2 結(jié) 果

確認(rèn)到rhGH-Fc 中Fc 和rhGH 的正確二硫鍵連接。其中 1 ∶T6-1 ∶T16、1 ∶T20-1 ∶T21 為 rhGH 的鏈內(nèi)二硫鍵，二硫鍵連接為：Cys53-Cys165，Cys182-Cys189，見(jiàn)圖 1~ 圖 6 和表 2。1 ∶T22-2 ∶T22 為 Fc 的鏈間二硫鍵，此肽段上有4 個(gè)半胱氨酸，形成2 組二硫鍵，二硫鍵連接為：1 ∶Cys210-2 ∶Cys210，1 ∶Cys213-2 ∶Cys213，見(jiàn)圖 7~ 圖 9 和表 2；1 ∶T24-1 ∶T29、1 ∶T36-1 ∶T41 為Fc 的鏈內(nèi)二硫鍵，二硫鍵連接為：Cys245-Cys305，Cys351-Cys409，見(jiàn)圖 10 ~ 圖 15 和表 2。

圖1 T6-T16 二硫鍵總離子流色譜圖Fig.1 Chromatogram of total ion flow of T6-T16 disulfide bond

圖6 T20-T21 二硫鍵的二級(jí)圖譜Fig.6 Secondary profile of T20-T21 disulfide bond

圖7 1 ∶T22-2 ∶T22 二硫鍵總離子流色譜圖Fig.7 Chromatogram of total ion flow of 1 ∶T22-2 ∶T22 disulfide bond

圖9 1 ∶T22-2 ∶T22 二硫鍵的二級(jí)圖譜Fig.9 Secondary profile of 1 ∶T22-2 ∶T22 disulfide bond

圖10 T24-T29 二硫鍵總離子流色譜圖Fig.10 Chromatogram of total ion flow of T24-T29 disulfide bond

圖15 T36-T41 二硫鍵的二級(jí)圖譜Fig.15 Secondary profile of T36-T41 disulfide bond

表2 通過(guò)軟件確認(rèn)的各組合物二硫鍵Tab.2 Disulfide bonds in various compositions confirmed by software

圖2 T6-T16 二硫鍵的一級(jí)圖譜Fig.2 Primary profile of T6-T16 disulfide bond

圖3 T6-T16 二硫鍵的二級(jí)圖譜Fig.3 Secondary profile of T6-T16 disulfide bond

圖4 T20-T21 二硫鍵總離子流色譜圖Fig.4 Chromatogram of total ion flow of T20-T21 disulfide bond

圖5 T20-T21 二硫鍵的一級(jí)圖譜Fig.5 Primary profile of T20-T21 disulfide bond

圖8 1 ∶T22-2 ∶T22 二硫鍵的一級(jí)圖譜Fig.8 Primary profile of 1 ∶T22-2 ∶T22 disulfide bond

圖11 T24-T29 二硫鍵的一級(jí)圖譜Fig.11 Primary profile of T24-T29 disulfide bond

圖12 T24-T29 二硫鍵的二級(jí)圖譜Fig.12 Secondary profile of T24-T29 disulfide bond

圖13 T36-T41 二硫鍵總離子流色譜圖Fig.13 Chromatogram of total ion flow of T36-T41 disulfide bond

圖14 T36-T41 二硫鍵的一級(jí)圖譜Fig.14 Primary profile of T36-T41 disulfide bond

3 討 論

本研究采用Waters QTof 液質(zhì)聯(lián)用儀對(duì)rhGHFc 的二硫鍵進(jìn)行解析，確認(rèn)rhGH-Fc 中rhGH 的二硫鍵連接為 Cys53-Cys165，Cys182-Cys189；rhGH-Fc中 Fc 的二硫鍵連接為 1 ∶Cys210-2 ∶Cys210，1 ∶Cys213-2 ∶Cys213，Cys245-Cys305，Cys351-Cys409，其中 1 ∶Cys210-2 ∶Cys210 和 1 ∶Cys213-2 ∶Cys213 為 Fc 的鏈間二硫鍵，其他為鏈內(nèi)二硫鍵，與理論信息一致。表明具有高分辨率和高準(zhǔn)確度的LC-MS 技術(shù)可有效對(duì)蛋白一級(jí)結(jié)構(gòu)表征進(jìn)行分析［9-12］。

hGH 由人腦垂體前葉的嗜酸性細(xì)胞分泌，含有191 個(gè)氨基酸分子，相對(duì)分子質(zhì)量為22 125，具有種屬特異性，是人類出生后促生長(zhǎng)最重要的一種蛋白質(zhì)類激素［13］，正確的二硫鍵連接可影響其活性［14］。

Fc 片段是保持rhGH-Fc 在體內(nèi)半衰期較長(zhǎng)的主要因素，同時(shí)可影響蛋白穩(wěn)定性［15］。由于rhGHFc 的鏈間二硫鍵易水解［16］，易形成單體，影響其結(jié)構(gòu)和穩(wěn)定性，對(duì)Fc 片段的二硫鍵進(jìn)行鑒定顯得尤為重要。

rhGH-Fc 被胰酶酶切成不同分子量大小的肽段，有半胱氨酸的肽段通過(guò)-S-S-連接成兩個(gè)肽段，經(jīng)質(zhì)譜檢測(cè)后能夠獲得含有-S-S-肽段的總離子流色譜圖（total ion chromatograms）、肽段一級(jí)圖譜和二級(jí)圖譜，通過(guò)軟件對(duì)這些肽段的圖譜進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，鑒定到二硫鍵連接的位點(diǎn)。本研究無(wú)需對(duì)樣品進(jìn)行額外的標(biāo)記，裸露出來(lái)的巰基可通過(guò)IAM 封閉，避免樣品處理過(guò)程中產(chǎn)生錯(cuò)配的二硫鍵，且二硫鍵連接肽段無(wú)N 糖位點(diǎn)，僅通過(guò)對(duì)樣品的酶解肽段進(jìn)行分析，即可實(shí)現(xiàn)對(duì)樣品二硫鍵連接的確認(rèn)。

綜上所述，本方法簡(jiǎn)單易用，能夠快速、準(zhǔn)確、有效地的確認(rèn)rhGH-Fc 二硫鍵連接，也為其他融合蛋白的二硫鍵分析提供了思路。