楊蓉生，陳煉紅，唐俊妮，陳 娟，唐艷瓊

(西南民族大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，四川成都 610041)

復(fù)合酶法提取紅雪茶粗多糖工藝優(yōu)化研究

楊蓉生，陳煉紅*，唐俊妮，陳 娟，唐艷瓊

(西南民族大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，四川成都 610041)

為了獲得復(fù)合酶法提取紅雪茶粗多糖的最佳工藝，采用單因素實(shí)驗(yàn)和正交實(shí)驗(yàn)，研究了不同料液比、pH、酶解溫度、提取時(shí)間和不同復(fù)合酶配比對(duì)紅雪茶粗多糖提取率的影響;在此基礎(chǔ)上采用L9(34)正交實(shí)驗(yàn)研究了各影響因素對(duì)紅雪茶粗多糖提取率的影響，結(jié)果表明復(fù)合酶最佳配比為纖維素酶2.0%，果膠酶2.0%，木瓜蛋白酶0.5%;影響紅雪茶粗多糖提取率的四個(gè)因素的主次順序?yàn)?料液比＞酶解溫度＞pH＞酶解時(shí)間;最佳提取工藝條件是料液比1∶40，pH4.5，酶解溫度40℃，酶解時(shí)間80min，在此條件下紅雪茶多糖提取率達(dá)8.91%。本研究確定了復(fù)合酶法提取紅雪茶多糖的最佳工藝。

復(fù)合酶法，紅雪茶，多糖，提取

紅雪茶是生長(zhǎng)于雪域高原海拔4000m以上的苔蘚植物，屬地衣類地茶科植物，學(xué)名地茶。雪茶中的紅雪茶又名金絲茶［1］。紅雪茶性涼、味甘，富含雪茶酸、鱗片酸、羊角衣酸、甘露醇、氨基酸、維生素和微量元素，經(jīng)藥檢安全無毒副作用［2］。經(jīng)現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明，紅雪茶富含大量人體必須的微量元素，具有降血脂、降膽固醇、清心開竅、補(bǔ)血養(yǎng)心等功效，對(duì)高血壓、冠心病、肥胖癥、神衰體弱等有明顯作用［3］。目前對(duì)紅雪茶化學(xué)成分的研究比較多［4］，但對(duì)其活性成分的提取報(bào)道很少。對(duì)紅雪茶多糖的浸提，僅采用了水提、醇提法［2］，目前還沒有關(guān)于酶法提取工藝的相關(guān)研究文獻(xiàn)。本實(shí)驗(yàn)采用復(fù)合酶(纖維素酶、果膠酶、木瓜蛋白酶)提取多糖法［5－8］，主要研究料液比、酶解溫度、酶解時(shí)間、pH以及各種酶的配比對(duì)紅雪茶多糖提取率的影響，通過單因素、正交實(shí)驗(yàn)確定最佳的工藝條件，該方法具有條件溫和、易除雜質(zhì)、效率高、對(duì)多糖結(jié)構(gòu)和活性影響小等優(yōu)點(diǎn)，為紅雪茶綜合開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

紅雪茶 四川西部甘孜高原，經(jīng)烘干磨碎成粉;無水乙醇、蒽酮、濃硫酸、磷酸氫二鉀、檸檬酸、葡萄糖、蒸餾水均為分析純;纖維素酶 BR，15U/mg，上海伯奧生物科技有限公司;木瓜蛋白酶 BR，650U/mg，北京奧博星生物技術(shù)有限公司;果膠酶 500U/mg，成都市科龍化工試劑廠。

delta320型pH計(jì)、AL204型電子天平 梅特勒－托利多儀器(上海)有限公司;WFZ UV－2102PSC型紫外可見分光光度計(jì) 尤尼柯上海儀器有限公司; HZS－H型恒溫水浴鍋 哈爾濱市東明醫(yī)療器械廠制造;F－W－100型高速萬能粉碎機(jī) 北京中興偉業(yè)儀器有限公司;DHG－9203A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱 上海一恒科技有限公司;TUS－S2A型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 上海鷹迪儀器設(shè)備有限公司;AKHL－Ⅲ－24型臺(tái)灣艾柯超純水機(jī) 成都康寧實(shí)驗(yàn)專用純水設(shè)備廠;XW－80A型旋渦混合器 上海青浦滬西儀器廠;5804R型冷凍離心機(jī) 德國Eppendorf公司;TD4A型臺(tái)式低速離心機(jī) 長(zhǎng)沙英泰儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 紅雪茶的提取工藝 雪茶粉→溶解→復(fù)合酶水解→升溫→滅酶→離心→蒸發(fā)濃縮→乙醇沉淀→洗滌→低溫干燥→粗多糖

1.2.2 操作要點(diǎn) 選擇質(zhì)好的雪茶，洗凈后瀝干，放入80℃的烘箱中干燥2～3h，粉碎機(jī)粉碎，過80目篩，收集雪茶粉，密封備用。

取適量的蒸餾水溶解，40℃水浴30m in，調(diào)pH，加入按一定比例混合的纖維素酶、果膠酶、木瓜蛋白酶的酶溶液，一定溫度條件下，在恒溫振蕩器上提取一定的時(shí)間后，沸水滅酶，冷卻，4000 r/m in離心15m in，取上清液，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器濃縮至原體積1/3，加入約5倍體積95%的乙醇沉淀，靜置過夜，離心，無水乙醇洗滌，干燥得粗多糖，稱重。

1.2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作 精密量取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品200mg，置于100m L容量瓶中，加水定容。精密吸取10m L，加水定容到100m L容量瓶中，獲萄糖標(biāo)準(zhǔn)液。

稱取蒽酮0.2g，加入100m L濃硫酸溶解，當(dāng)日配制使用。

精密量取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0m L，分別置于10m L具塞試管中，加蒸餾水至2.0m L，空白管吸取蒸餾水2.0m L，與供試品管做以下同步處理。各管分別加入蒽酮試液8m L，搖勻，浸于冷水浴中冷卻，移至沸水浴中加熱10min，用水冷卻，室溫放置10m in，取出在620nm的波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，以吸光度為縱坐標(biāo)，葡萄糖濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.4 多糖含量的測(cè)定 分別稱取雪茶粗多糖20mg，置于250m L的容量瓶中，加少量蒸餾水，在沸水浴中快速溶解充分，后于100m L容量瓶中定容至刻度。精密量取2.0m L，按照標(biāo)準(zhǔn)曲線的處理，測(cè)定吸光度，代入回歸方程，計(jì)算出多糖含量。

根據(jù)多糖提取率公式計(jì)算出紅雪茶多糖的提取率。

式中:W1:紅雪茶粉重量(mg);W2:粗多糖重量(mg);W3:依據(jù)回歸方程計(jì)算出的多糖重量(mg); 20:紅雪茶粗多糖重量(mg)。

1.2.4 紅雪茶粗多糖提取單因素實(shí)驗(yàn)

1.2.4.1 不同料液比對(duì)紅雪茶粗多糖提取率的影響

在紅雪茶粉水浴30min，pH4.5，復(fù)合酶比例1∶1∶1，提取溫度40℃、提取時(shí)間80m in條件下，分別研究不同的料液比(1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50)(g∶m L)，對(duì)紅雪茶多糖的提取的影響，計(jì)算提取率。

1.2.4.2 不同pH對(duì)紅雪茶粗多糖提取率的影響 在料液比為(1.2.4.1的結(jié)果)，水浴30m in，復(fù)合酶比例1∶1∶1，提取溫度40℃、提取時(shí)間80m in條件下，分別研究不同料液的pH(3.5、4、4.5、5、5.5、6)對(duì)紅雪茶多糖的提取的影響，計(jì)算提取率。

1.2.4.3 不同酶解時(shí)間對(duì)紅雪茶粗多糖提取率的影響 在料液比為(1.2.4.1的結(jié)果)，水浴30m in，pH (1.2.4.2的結(jié)果)、復(fù)合酶比例1∶1∶1，提取溫度40℃條件下，分別研究不同酶解時(shí)間(40、60、80、120m in)對(duì)紅雪茶多糖的提取的影響，計(jì)算提取率。

1.2.4.4 不同酶解溫度對(duì)紅雪茶粗多糖提取率的影響 在料液比為(1.2.4.1的結(jié)果)，水浴30min，pH (1.2.4.2的結(jié)果)、復(fù)合酶比例1∶1∶1，酶解時(shí)間為(1.2.4.3的結(jié)果)的條件下，分別研究不同酶解溫度(30、35、40、45、50℃)對(duì)紅雪茶多糖的提取的影響，計(jì)算提取率。

1.2.5 紅雪茶粗多糖提取正交實(shí)驗(yàn)

1.2.5.1 復(fù)合酶配比正交實(shí)驗(yàn) 在料液比、pH、酶解時(shí)間、酶解溫度為單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果的條件下，研究復(fù)合酶的不同用量對(duì)紅雪茶多糖的提取的影響，設(shè)計(jì)L9(33)正交實(shí)驗(yàn)，確定復(fù)合酶的最佳配比。見表1。

表1 復(fù)合酶配比因素水平表Table 1 Factors and ratio levels of the complex enzyme

1.2.5.2 提取條件的正交實(shí)驗(yàn) 為優(yōu)化提取工藝，根據(jù)單因素及復(fù)合酶配比正交實(shí)驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，以料液比、pH、酶解溫度、酶解時(shí)間為實(shí)驗(yàn)因素，設(shè)計(jì)L9(34)正交實(shí)驗(yàn)，確定最佳的提取工藝條件。見表2。

表2 提取條件因素水平表Table 2 Factors and levels of the extraction condition

2 結(jié)果與分析

2.1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線

利用蒽酮－硫酸法，測(cè)定620nm下的吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖1)。

圖1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 The standard curve of Glucose

標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程為y=7.0857x+0.0352，R2=0.9924，線性關(guān)系好。

2.2 單因素實(shí)驗(yàn)

2.2.1 料液比對(duì)紅雪茶粗多糖提取率的影響 由圖2可知，多糖的提取率隨著料液比(g∶m L)的增加而增加，當(dāng)料液比大于1∶30時(shí)，提取率逐漸降低，故采用1∶30的料液比為宜。

圖2 料液比對(duì)粗多糖提取率的影響Fig.2 Influence of the solid－liquid ratio on the yield rate of crude polysaccharide

2.2.2 pH對(duì)紅雪茶粗多糖提取率的影響 由圖3可知，多糖的提取率隨著pH的增加而增加，但當(dāng)pH大于5時(shí)，粗多糖提取率呈減少的趨勢(shì)，pH為5時(shí)紅雪茶粗多糖的提取率最大，當(dāng)pH大于5.5后，粗多糖提取率會(huì)大大的降低。說明pH超出酶的最適pH范圍，活力減小。

圖3 pH對(duì)粗多糖提取率的影響Fig.3 Influence of the pH value on the yield rate of crude polysaccharide

2.2.3 酶解時(shí)間對(duì)紅雪茶粗多糖提取率的影響 由圖4可知，當(dāng)提取時(shí)間為60m in時(shí)，多糖的提取率最大。酶解時(shí)間少于60m in時(shí)，隨時(shí)間的增加，提取率快速增大，而時(shí)間超過60m in后，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，提取率快速下降，最后趨于平緩。由此說明，當(dāng)提取時(shí)間為60m in時(shí)，酶發(fā)揮了最大的作用。因此，當(dāng)酶解時(shí)間為60m in時(shí)，紅雪茶中粗多糖的提取率最大。

圖4 酶解時(shí)間對(duì)粗多糖提取率的影響Fig.4 Influence of enzymatic hydrolysis time on the yield rate of crude polysaccharide

2.2.4 酶解溫度對(duì)紅雪茶粗多糖提取率的影響 由圖5可知，酶解溫度低于40℃時(shí)，粗多糖提取率隨溫度升高而增大，而當(dāng)溫度高于40℃時(shí)，粗多糖的提取率隨溫度的升高而呈減少的趨勢(shì)，酶解溫度為40℃，粗多糖的提取率最高。這是由于剛開始隨著溫度升高，酶反應(yīng)速度加快，粗多糖的提取率增加，之后隨著溫度的進(jìn)一步升高，引起酶蛋白變性失活，酶活力降低，粗多糖提取率降低。

圖5 酶解溫度對(duì)粗多糖提取率的影響Fig.5 Influence of enzymatic hydrolysis temperature on the yield rate of crude polysaccharide

2.3 正交實(shí)驗(yàn)

2.3.1 復(fù)合酶配比正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果及分析 實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表3所示。因?yàn)闃O差RA＞RC＞RB，所以影響紅雪茶多糖提取率的復(fù)合酶的順序?yàn)槔w維素酶＞木瓜蛋白酶＞果膠酶;空列的RE(代表實(shí)驗(yàn)誤差包括交互作用的影響)為1.28，RA＞RE，說明中纖維素酶是主要因素，RB＜RE，RC＜RE，說明果膠酶和木瓜蛋白酶在紅雪茶多糖提取過程中影響不大。根據(jù)各因素的影響大小及正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果，綜合分析確定復(fù)合酶最佳酶配比為 A3B3C1，即纖維素酶為2.0%，果膠酶為2.0%，木瓜蛋白酶為0.5%。

由于選擇的最優(yōu)水平組合與實(shí)際結(jié)果不一致，進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)。在最佳酶配比條件下進(jìn)行，重復(fù)3次，多糖提取率分別為8.67%、8.91%、8.70%，則平均提取率為8.76%。

表3 復(fù)合酶正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 3 Results of orthogonal test on the complex enzyme

2.3.2 提取條件的正交實(shí)驗(yàn) 提取條件的正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表4所示。通過提取條件的正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果的極差分析可知，各因素對(duì)紅雪茶粗多糖提取率的影響程度強(qiáng)弱順序?yàn)?A＞C＞B＞D，即料液比對(duì)紅雪茶粗多糖提取率影響最大，其次是酶解溫度，影響較小的是pH和酶解時(shí)間。得出的最佳提取工藝條件為A3B1C2D3，即最佳料液比為1∶40，pH為4.5，溫度為40℃，酶解時(shí)間為80m in。

在最佳工藝條件下進(jìn)行提取多糖的驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，重復(fù)3次，提取率分別為8.86%、8.93%、8.95%，則平均提取率為8.91%。

表4 提取條件的正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 4 Results of orthogonal test on the extraction condition

3 結(jié)論

對(duì)影響紅雪茶粗多糖提取率的因素包括料液比、pH、酶解溫度和提取時(shí)間等進(jìn)行了研究，通過單因素實(shí)驗(yàn)得出了各因素的最佳水平，即最佳料液比為1∶30，pH為5，酶解溫度為40℃，提取時(shí)間為60min。

通過對(duì)復(fù)合酶配比的正交實(shí)驗(yàn)，影響紅雪茶粗多糖提取率的復(fù)合酶的主要因素是纖維素酶，果膠酶和木瓜蛋白酶在紅雪茶多糖提取過程中影響不大。確定了酶的最佳配比為纖維素酶2.0%，果膠酶2.0%，木瓜蛋白酶0.5%。

通過對(duì)復(fù)合酶提取工藝的正交實(shí)驗(yàn)，影響紅雪茶粗多糖提取率的四個(gè)因素的主次順序?yàn)?料液比＞酶解溫度＞pH＞酶解時(shí)間，即四個(gè)因素中對(duì)紅雪茶粗多糖提取率影響最大的為料液比，其次是酶解溫度，其中影響較小的是pH和酶解時(shí)間，通過極差分析得出的最佳提取工藝條件最佳料液比為1∶40，pH為4.5，溫度為40℃，酶解時(shí)間為80m in。

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Optim ization of polysaccharide extraction fromLethariellaCladonioidesby com pound enzymes method

YANG Rong－sheng，CHEN Lian－h(huán)ong*，TANG Jun－ni，CHEN Juan，TANG Yan－qiong
(College of Life Science＆Technology，Southwest University for Nationalities，Chengdu 610041，China)

To ob tain the op tim ized p rocess parameter of extrac ting the polysaccharide fromLethariella Cladonioides，sing le factor experiment and orthogonal testwere adop ted.The effect of different solid－liquid ratio，pH，tem perature of enzymatic hyd rolysi(cellulase，Pectinase，papain)，extrac ting time and com pound enzymes m ixture ratio on the extraction rate of polysaccharide fromLethariellaCladonioideswere studied.The results showed that com pound enzym e best ratio was 2.0%cellulase，2.0%pec tinase，0.5%papain.The im pac t fac tors were as follow ing:solid－liquid ratio＞temperature＞pH＞time.The op tim ized p rocess parameter was solid－liquid ratio 1∶40，pH4.5，tem perature 40℃，time 80m in.Under this cond ition the extrac tion rate of polysaccharide reached to 8.91%.This method was suitab le for polysaccharide extraction fromLethariellaCladonioides.

com pound enzymes;LethariellaCladonioides;polysaccharide;extrac tion

TS201.1

B

1002－0306(2012)12－0285－04

2011－11－18 *通訊聯(lián)系人

楊蓉生(1959－)，女，實(shí)驗(yàn)師，研究方向:畜產(chǎn)品加工。

中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)(11NZYTH08)。