羅盛蓮，游 霞，丁聰聰，李 珍，林國秀，于志偉，張 杰

(四川大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，生物資源與生態(tài)環(huán)境教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川成都 610064)

長(zhǎng)裙竹蓀和棘托竹蓀的抑菌作用及其化學(xué)成分研究

羅盛蓮，游 霞，丁聰聰，李 珍，林國秀，于志偉，張 杰*

(四川大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，生物資源與生態(tài)環(huán)境教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川成都 610064)

對(duì)長(zhǎng)裙竹蓀和棘托竹蓀乙酸乙酯浸膏水溶液采用濾紙片擴(kuò)散法進(jìn)行抑菌作用的研究，并應(yīng)用氣相色譜－質(zhì)譜聯(lián)用(GC－MS)對(duì)其化學(xué)成分進(jìn)行分析。結(jié)果表明:長(zhǎng)裙竹蓀乙酸乙酯浸膏的水溶液對(duì)供試細(xì)菌表現(xiàn)出明顯抑制作用，但對(duì)供試酵母和霉菌抑制作用不明顯;棘托竹蓀乙酸乙酯浸膏的水溶液對(duì)各供試菌均表現(xiàn)出明顯抑制作用。兩種竹蓀水溶液均對(duì)高溫高壓穩(wěn)定。GC－MS分析表明，長(zhǎng)裙竹蓀和棘托竹蓀乙酸乙酯浸膏水溶液的主要成分是脂肪酸及其酯類、烯烴、鄰苯二甲酸酯類、酚類和酮類。

長(zhǎng)裙竹蓀，棘托竹蓀，抑菌作用，化學(xué)成分

竹蓀，也稱竹參、竹菌、竹笙，是一類營養(yǎng)豐富的大型野生食用真菌，隸屬于擔(dān)子菌亞門、腹菌綱、鬼筆目、鬼筆科、竹蓀屬。竹蓀作為名貴的食用菌，歷史上列為“宮廷貢品”，近代作為國宴名菜，而且也是醫(yī)學(xué)上的新秀，亦是食療佳品，素有“山珍之王”、“菌中皇后”的美稱［1］。我國有紅托竹蓀、黃裙竹蓀、朱紅竹蓀、長(zhǎng)裙竹蓀、短裙竹蓀、皺蓋竹蓀和棘托竹蓀7個(gè)種［2］。目前用于人工栽培的竹蓀有長(zhǎng)裙竹蓀、短裙竹蓀、紅托竹蓀和棘托竹蓀。竹蓀在治療高血壓、精神衰弱和腸胃疾病等方面具有顯著效果，而且能防癌抗癌［3］。特別的是，竹蓀還具有特異的防腐功能，在炎熱的夏季做菜煲湯時(shí)，置少許竹蓀入內(nèi)，可防止酸敗，并延長(zhǎng)存放時(shí)間［4］。據(jù)報(bào)道，我國每年由于微生物污染造成的糧食食品腐敗現(xiàn)象十分嚴(yán)重，這不僅對(duì)人類健康產(chǎn)生威脅，而且造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。目前用于防止食品腐敗變質(zhì)的重要手段是添加化學(xué)合成防腐劑和天然防腐劑［5］。但是隨著科學(xué)技術(shù)的進(jìn)步，人們逐步發(fā)現(xiàn)化學(xué)合成食品防腐劑對(duì)人體健康存在潛在威脅。因此，開發(fā)更安全、更方便使用的天然防腐劑［6］成為了食品防腐劑發(fā)展的新趨勢(shì)。鑒于竹蓀對(duì)食物的防腐效果，選取目前種植最廣的長(zhǎng)裙竹蓀和棘托竹蓀作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，研究其對(duì)8種常見的致病致腐菌的抑制作用，并對(duì)兩種竹蓀的抑菌成分進(jìn)行初步分析，為進(jìn)一步開發(fā)利用竹蓀成為天然防腐劑提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

長(zhǎng)裙竹蓀和棘托竹蓀子實(shí)體干品 市售，粉碎后過80目篩;乙酸乙酯 分析純，成都科亞公司; R－200旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀、島津 2010－plus氣質(zhì)聯(lián)用儀 BUCHZ公司;大腸桿菌(Escherichia coli)、枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)、蠟狀芽孢桿菌(Bacillus cereus)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、沙門氏菌(Salmonella coli)、假絲酵母(Saccharomyces cerevisiae)、黃 曲 霉 (Aspergillusflavus)、青 霉(Penicillium sp.) 四川大學(xué)生物資源與生態(tài)環(huán)境教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供;LB培養(yǎng)基、馬鈴薯培養(yǎng)基(PDA) 廣東環(huán)凱微生物科技有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 提取物的制備 分別取長(zhǎng)裙竹蓀和棘托竹蓀干子實(shí)體粉末10g，按照料液比1∶10加入乙酸乙酯，混勻后置于水浴中80℃回流抽提8h，過濾，所得濾渣再加入70mL乙酸乙酯，按原條件進(jìn)行抽提，過濾，棄濾渣，合并兩次濾液，減壓濃縮至恒重?；谥皩?shí)驗(yàn)，浸膏選用無菌水溶解，浸膏分別加入10mL無菌水溶解，即得長(zhǎng)裙竹蓀和棘托竹蓀乙酸乙酯浸膏的水溶液(以下簡(jiǎn)稱提取物)，質(zhì)量濃度為1g/mL(相當(dāng)于1mL溶液中含有1g原材料)，保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 抑菌實(shí)驗(yàn)

1.2.2.1 供試菌株懸浮液的制備 將供試菌種接入相應(yīng)的試管斜面培養(yǎng)基上進(jìn)行活化。活化之后，用接種環(huán)挑少許菌體于裝有5mL液體培養(yǎng)基的試管內(nèi)，細(xì)菌置37℃振蕩培養(yǎng)3h，霉菌、酵母菌置25℃振蕩培養(yǎng)3h，制成菌體懸浮液。

1.2.2.2 含菌培養(yǎng)基平板的制備 配制好的PDA固體培養(yǎng)基和LB固體培養(yǎng)基，高壓滅菌后，冷卻至50℃左右。無菌操作下，向干熱滅菌的培養(yǎng)皿中加入200μL菌懸液，再倒入適量的培養(yǎng)基混勻，每皿15～20mL［7］。

1.2.2.3 抑菌實(shí)驗(yàn) 將直徑13mm的小濾紙圓片，于培養(yǎng)皿中160℃干熱滅菌1～2h。將滅菌濾紙片貼在

1.2.2.2中制備好的含菌平板上，再往每個(gè)圓片上加入30μL提取物，以無菌水做空白對(duì)照，每個(gè)平皿放3個(gè)圓片。接好的平板于4℃放置4h，再置恒溫箱中培養(yǎng)，細(xì)菌于37℃培養(yǎng)18h，霉菌、酵母菌于25℃培養(yǎng)48h，利用十字交叉法［8］測(cè)量抑菌圈直徑。

1.2.2.4 最低抑菌濃度(MIC)的測(cè)定 利用LB培養(yǎng)基和竹蓀提取物，經(jīng)試管連續(xù)雙倍稀釋法得竹蓀提取物質(zhì)量濃度分別為 0.1、0.05、0.025、0.0125、0.00625g/mL的培養(yǎng)基各10mL，另設(shè)不加提取液的培養(yǎng)基為空白對(duì)照，121℃滅菌15min。趁熱倒入已滅菌的培養(yǎng)皿中，冷卻后在每一濃度培養(yǎng)基上劃線接種供試菌，每個(gè)濃度三個(gè)平行。細(xì)菌置37℃下培養(yǎng)18h，真菌置25℃下培養(yǎng)48h，觀察生長(zhǎng)情況，以平板中沒有菌體生長(zhǎng)的最低濃度即為提取物的最低抑菌濃度MIC。

1.2.2.5 穩(wěn)定性研究 將長(zhǎng)裙竹蓀和棘托竹蓀提取物在121℃下高壓滅菌15min，以枯草芽孢桿菌、假絲酵母和黃曲霉為代表，按照1.2.2.3方法測(cè)定抑菌圈，以未處理的提取物為對(duì)照。

1.2.3 化學(xué)成分的分離與鑒定

1.2.3.1 氣相色譜條件 色譜柱:FFAP極性柱(30m ×0.32mm×0.25μm);進(jìn)樣口溫度為250℃，檢測(cè)器溫度 280℃;采用程序升溫:70℃保持 3min，以5℃/min升至 100℃，保持 6min，以 5℃/min升至150℃，保持 6min，以 7℃/min升至 220℃，保持15min;柱流量 2.0mL/min，柱頭壓 5.5Psi，進(jìn)樣量0.5μL;分流比30∶1。

1.2.3.2 質(zhì)譜條件 電子轟擊(EI)離子源;電子能量70Ev;溶劑延遲時(shí)間6min;分子量范圍50～450amu。

2 結(jié)果與分析

2.1 提取物的抑菌效果

長(zhǎng)裙竹蓀乙酸乙酯浸膏為淺黃色油狀粘稠液體。由表1知，長(zhǎng)裙竹蓀提取物對(duì)兩類革蘭氏細(xì)菌均有明顯抑制作用，而且革蘭氏陽性菌(枯草芽孢桿菌、蠟狀芽孢桿菌和金黃色葡萄球菌)比革蘭氏陰性菌(大腸桿菌和沙門氏菌)更敏感;但對(duì)酵母和霉菌無明顯抑制作用。

棘托竹蓀乙酸乙酯浸膏為深黃色油狀粘稠液體。由表1知，棘托竹蓀提取物對(duì)各種供試細(xì)菌、真菌均有不同程度的抑制作用，其中酵母更敏感。

表1 長(zhǎng)裙竹蓀和棘托竹蓀提取物的抑菌實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 1 Antimicrobial activities of extracts of Dictyophora indusia fisscher and Dictyophora echinovolvata

2.2 最低抑菌濃度(MIC)

從表2知，長(zhǎng)裙竹蓀提取物對(duì)沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、蠟狀芽孢桿菌的MIC為0.05g/mL，對(duì)枯草芽孢桿菌的MIC為0.025g/mL，對(duì)大腸桿菌的MIC為0.1g/mL。抑菌結(jié)果顯示長(zhǎng)裙竹蓀提取物對(duì)真菌無明顯抑制作用，故不討論其對(duì)真菌的MIC。

棘托竹蓀提取物對(duì)沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、蠟狀芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、假絲酵母、黃曲霉、桔青霉的MIC為0.05g/mL，對(duì)大腸桿菌的MIC為0.1g/mL。

2.2 穩(wěn)定性分析

由表3知，經(jīng)高溫高壓處理后，長(zhǎng)裙竹蓀和棘托竹蓀提取物對(duì)枯草芽孢桿菌、假絲酵母和黃曲霉的抑制效果變化不大，表明兩種提取物中的有效成分對(duì)高溫、高壓穩(wěn)定，故而由此獲得的防腐劑性質(zhì)穩(wěn)定。

2.3 提取物的化學(xué)成分鑒定

實(shí)驗(yàn)對(duì)兩種竹蓀的抑菌成分進(jìn)行了初步分析。

通過GC－MS技術(shù)分離和鑒定，長(zhǎng)裙竹蓀提取物共鑒定出37種化學(xué)成分(表4)，占提取物總量的82.98%，主要是脂肪酸酯類 (41.27%)、烯烴(14.68%)、酮類(12.56%)、醛類(5.78%)、鄰苯二甲酸酯類(4.37%)、醇類(1.26%)、酚類(1.23%)、烷烴(1.01%)和酰胺類(0.82%)等。其中(－)－異長(zhǎng)葉烯－9－酮(10.73%)、苯乙醛(3.56%)、鄰苯二甲酸二異丁酯(2.59%)、棕櫚酸甲酯(4.88%)、2－氧－棕櫚酸甲酯(2.71%)、油酸甲酯(19.66%)、亞油酸甲酯(3.11%)和Z－9－十六烷基花生酸酯(4.26%)是主要成分。

表2 長(zhǎng)裙竹蓀和棘托竹蓀提取物對(duì)各種受試菌的MIC測(cè)定結(jié)果Table 2 MICs of extracts of Dictyophora indusia fisscher and Dictyophora echinovolvata

表3 長(zhǎng)裙竹蓀和棘托竹蓀提取物的穩(wěn)定性分析Table 3 Stability analysis of extracts of Dictyophora indusia fisscher and Dictyophora echinovolvata

通過GC－MS技術(shù)分離和鑒定，棘托竹蓀提取物共鑒定出21種化學(xué)成分(表4)，占提取物總量的84.83%，主要是脂肪酸及其酯類(25.85%)、鄰苯二甲酸酯類(19.01%)、酚類(18.18%)、酮類(8.67%)、烯烴(5.62%)、醛類(3.11%)、有機(jī)酸類(2.26%)、烷烴(1.16%)和醇類(0.97%)等。其中氧雜環(huán)十三烷－2－酮(6.02%)、(－)－異長(zhǎng)葉烯－9－酮(2.65%)、苯乙醛(3.11%)、α－芹子烯(4.44%)、2，6－二甲基對(duì)苯二酚(18.18%)、鄰苯二甲酸二異丁酯(14.12%)、鄰苯二甲酸二丁酯(4.89%)、7，10－十八碳二烯酸甲酯(4.49%)、棕櫚酸甲酯(8.34%)、油酸甲酯(6.17%)、硬脂酸甲酯(2.18%)、2－羧甲基－3－甲基－環(huán)戊甲酸(1.19%)和葵二酸(1.07%)是主要成分。

上述結(jié)果表明，相同濃度的長(zhǎng)裙竹蓀和棘托竹蓀提取物有11種相同成分，主要是酯類、酮類、酚類和醛類化合物。經(jīng)大量實(shí)驗(yàn)證明，各種酚類、脂肪酸酯類化合物均對(duì)革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌有抑制作用［9］，這可能是兩種提取物在抑制細(xì)菌方面表現(xiàn)出一致性的主要原因。而各成分的含量差異較大，酚類、鄰苯二甲酸酯類在棘托竹蓀提取物中的含量分別為18.18%、19.01%，遠(yuǎn)高于在長(zhǎng)裙竹蓀提取物中的含量(分別為1.23%、4.37%)，可能引起兩者在抑制真菌活性方面產(chǎn)生差異。據(jù)報(bào)道，酚類物質(zhì)的抑菌作用不僅限于細(xì)菌，對(duì)于酵母和霉菌也有效果［10］。陳敏［11］對(duì)鏈霉菌6803菌株產(chǎn)生的化感物質(zhì)進(jìn)行抑菌研究，結(jié)果表明鄰苯二甲酸二異丁酯和鄰苯二甲酸二丁酯能有效抑制荔枝炭疽病和小麥赤霉病。其中哪些成分抑菌效果較好，是否具有協(xié)同、加成或拮抗作用，還有待于進(jìn)一步研究。

3 結(jié)論

如今尚未有比較長(zhǎng)裙竹蓀和棘托竹蓀抑菌作用及其化學(xué)成分的報(bào)道，本實(shí)驗(yàn)對(duì)兩種竹蓀進(jìn)行了對(duì)比研究，結(jié)果表明長(zhǎng)裙竹蓀提取物對(duì)細(xì)菌抑制效果明顯，對(duì)酵母菌和霉菌基本無抑制作用，與譚敬軍等［12］實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。棘托竹蓀提取物對(duì)三類受試菌均有不同程度的抑菌作用，與檀東飛等［13］實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。MIC測(cè)定結(jié)果表明，長(zhǎng)裙竹蓀和棘托竹蓀提取物對(duì)沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、蠟狀芽孢桿菌的MIC均為0.05g/mL，對(duì)大腸桿菌的MIC均為0.1g/mL，而長(zhǎng)裙竹蓀提取物對(duì)枯草芽孢桿菌的MIC為0.025g/mL，棘托竹蓀提取物對(duì)枯草芽孢桿菌、假絲酵母、黃曲霉、桔青霉的MIC為0.05g/mL。穩(wěn)定性分析表明兩種竹蓀提取物都能耐高溫高壓，可應(yīng)用于食品中。通過GC－MS分析，長(zhǎng)裙竹蓀和棘托竹蓀提取物的主要成分均為酯類、酮類、酚類和醛類化合物，可能是兩種提取物對(duì)供試細(xì)菌產(chǎn)生明顯抑制作用的原因，而棘托竹蓀提取物中酚類和鄰苯二甲酸酯類的含量遠(yuǎn)高于長(zhǎng)裙竹蓀提取物，可能是酵母和霉菌對(duì)棘托竹蓀提取物更敏感的原因。

上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，長(zhǎng)裙竹蓀和棘托竹蓀均含有天然抑菌成分，但由于竹蓀提取物中成分比較復(fù)雜，需要對(duì)其子實(shí)體的抑菌成分和抑菌機(jī)理進(jìn)行進(jìn)一步分析，為新型防腐劑的研究開發(fā)開辟一條新的道路。

表4 長(zhǎng)裙竹蓀和棘托竹蓀提取物的GC－MS分析Table 4 Results of GC－MS analysis

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Antimicrobial activities and chemical compositions of Dictyophora indusia fisscherandDictyophora echinovolvata

LUO Sheng－lian，YOU Xia，DING Cong－cong，LI Zhen，LIN Guo－xiu，YU Zhi－wei，ZHANG Jie*
(Key Laboratory of Bio－resource and Ecological Environment，Ministry of Education，Life Science College of Sichuan University，Chengdu 610064，China)

Antimicrobial activities and chemical compositions of water extracts of ethyl acetate extracts ofDictyophora indusia fisscherandDictyophora echinovolvatawere studied.The filtering paper method was applied to the antimicrobial activity test.The chemical compositions of the extracts had been researched by Gas Chromatography－Mass Spectrometry(GC－MS).The results showed that the extract ofDictyophora indusia fisscherhad strong antimicrobial effects on bacteria but weak on yeast and mold.The extract ofDictyophora echinovolvatahad strong antimicrobial activity to mold，yeast and bacteria tested.Meanwhile，the antimicrobial activities under high temperature and strong pressure were stable.GC－MS analysis indicated that the major compositions of the extracts were fatty acids，olefins，phthalates，phenols and ketones.

Dictyophora indusia fisscher;Dictyophora echinovolvata;antimicrobial activity;chemical composition

TS202.3

A

1002－0306(2012)21－0070－04

2012－04－12 *通訊聯(lián)系人

羅盛蓮(1988－)，女，碩士研究生在讀，研究方向:食品研究與開發(fā)。

國家高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃(863計(jì)劃)(2007AA021506)。