湯佳鵬，柳依婷，趙 強，董 偉，朱 俐

(南通大學航海醫(yī)學研究所生化與藥學研究室，江蘇南通 226001)

蛹蟲草發(fā)酵產(chǎn)蟲草素的培養(yǎng)條件研究

湯佳鵬，柳依婷，趙 強，董 偉，朱 俐

(南通大學航海醫(yī)學研究所生化與藥學研究室，江蘇南通 226001)

研究外源添加物，麩皮、玉米芯、腺苷等對蛹蟲草液體發(fā)酵合成蟲草素的影響，結(jié)果表明，發(fā)酵5d后加入3g/L腺苷，蟲草素的產(chǎn)量最高。當腺苷添加量大于4g/L時，蟲草素對腺苷的得率維持在25%，蟲草素產(chǎn)量最大能達到1.62g/L。通過分析菌絲體生長與蟲草素合成的動力學關系，發(fā)現(xiàn)蟲草素的合成屬于部分生長偶聯(lián)型發(fā)酵。當振蕩發(fā)酵4d后，靜置發(fā)酵7d，蟲草素的產(chǎn)量達到1.60g/L，產(chǎn)率達到145.5mg/L/d。這一蛹蟲草合成蟲草素的發(fā)酵工藝具有潛在的工業(yè)應用價值。

蛹蟲草，蟲草素，腺苷，振蕩－靜置培養(yǎng)

蟲草菌素(cordycepin)，即3'－脫氧腺苷，有多種生物學活性，如抗腫瘤、抗增殖、抗轉(zhuǎn)移、抗菌、抗病毒、免疫調(diào)節(jié)和抗炎等［1－2］。最近十年，以蟲草菌素作為治療藥物的靶向研究取得重大進展。這些研究包括蟲草菌素在各種癌癥上的應用，特別是白血病［3］，還有非洲錐蟲?。?］和血管成形術引起的再狹窄［5］以及蟲草菌素衍生物體內(nèi)抗氧化的作用等。目前研究的蛹蟲草液體深層發(fā)酵技術均基于將絕大部分蟲草素分泌至胞外的蛹蟲草菌株，其中中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心的Cordyceps militarisCICC No.14014就具有該特性。近年來，國內(nèi)外對蛹蟲草菌株的誘變篩選和蟲草素的發(fā)酵條件優(yōu)化做了大量研究，但蟲草素產(chǎn)量依然較低［6］。為了提高液體深層發(fā)酵法的蟲草素產(chǎn)量，我們對液體深層培養(yǎng)的方式進行了優(yōu)化研究，旨在尋找一種適合蛹蟲草菌株特性的工業(yè)化生物合成蟲草素的工藝。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

蛹蟲草Cordyceps militarisCICC No.14014 購自中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心;斜面培養(yǎng)基馬鈴薯汁200g/L，葡萄糖20g/L，瓊脂15g/L，KH2PO43g/L，MgSO4·7H2O 1.5g/L，VB1微量，121℃滅菌20min;基礎發(fā)酵培養(yǎng)基 葡萄糖42g/L，蛋白胨10g/ L，酵母膏 6g/L KH2PO40.5g/L，MgSO4·7H2O 0.5g/L，K2HPO40.5g/L，調(diào)節(jié) pH至 6.00，121℃滅菌15min。

ES－315全自動滅菌鍋 山東新華醫(yī)療器械廠; GNP－9080隔水式恒溫培養(yǎng)箱 上海三發(fā)科學儀器有限公司;SW－CJ－1BU超凈工作臺 蘇州安泰空氣技術有限公司;HYG－A全溫搖瓶柜 太倉市實驗設備廠;PHS－3E酸度計 上海精科雷磁儀器廠;高效液相色譜儀LC－20AD 日本島津。

1.2 實驗方法

1.2.1 發(fā)酵接種方法 將菌種接種到斜面培養(yǎng)基，在25℃培養(yǎng)6～7d。待菌株長滿斜面后，將斜面的孢子用50mL已滅菌的基礎發(fā)酵培養(yǎng)基刮下，一并倒入250mL三角瓶，在25℃，180r/min振蕩培養(yǎng)4d，制得種子液。將培養(yǎng)好的種子液以10%(V/V)接種量接到發(fā)酵培養(yǎng)基中，進行發(fā)酵培養(yǎng)。

1.2.2 檢測方法 將培養(yǎng)一定時間的樣品離心(10000r/min 10min)后，取上清液用純水稀釋6倍，振蕩混勻，留作檢測腺苷和蟲草素。離心沉淀經(jīng)2次水洗，在110℃烘干至恒重，測定菌絲體干重。

發(fā)酵液中的腺苷和蟲草素的含量通過高效液相色譜法測定［7］。色譜條件:色譜柱:Ultimate AQ－C18(4.6mm×250mm，5μm)，流動相:甲醇∶磷酸鹽溶液(10mmol/L KH2PO4溶液)=15∶85，柱溫40℃，流速1mL/min，進樣量20μL，檢測波長為260nm。

1.2.3 麩皮、玉米芯添加對蟲草素合成的影響 培養(yǎng)基配方對蟲草素的產(chǎn)量影響較大。因此，大量的蛹蟲草發(fā)酵研究與培養(yǎng)基優(yōu)化有關。特別是麩皮，含有豐富的微量元素以及維生素等，還具有價格便宜、容易獲得的優(yōu)點，是優(yōu)良的培養(yǎng)原料。因此，本研究考察了麩皮和玉米芯的添加對蟲草素產(chǎn)量的影響。

在基礎發(fā)酵培養(yǎng)基中加入4、8、12、16、20g/L的麩皮或玉米芯粉，按照1.2.1的方法接種后，在25℃，180r/min振蕩培養(yǎng)10d后測定發(fā)酵液中蟲草素的濃度。

1.2.4 腺苷最佳補料時間 已接種三角瓶在25℃，180r/min的全溫搖瓶柜中振蕩培養(yǎng)。分別在發(fā)酵的第4、5、6、7、8d在三角瓶中加入腺苷，濃度為3g/L。在加入腺苷后2d進行取樣，每天取樣一次，連取3d，檢測腺苷與蟲草素的含量，根據(jù)色譜結(jié)果判斷最優(yōu)的腺苷添加時間。

1.2.5 腺苷添加量對蟲草素合成的影響 三角瓶接種步驟同1.2.1，在25℃，180r/min振蕩培養(yǎng)，培養(yǎng)至第5d，分別補加腺苷2、3、4、5、6g/L繼續(xù)振蕩培養(yǎng)。然后在補加腺苷后的第2、4、6d，分別取樣檢測蟲草素的含量。

1.2.6 振蕩培養(yǎng)時間對兩步法發(fā)酵產(chǎn)蟲草素的影響

三角瓶接種步驟同1.2.1，在25℃，180r/min振蕩培養(yǎng)。培養(yǎng)4、5、6、7d后，將三角瓶轉(zhuǎn)移至25℃恒溫培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)。靜置培養(yǎng)7d后測定發(fā)酵液中蟲草素的濃度及菌絲體干重。

2 結(jié)果與討論

2.1 麩皮、玉米芯對蟲草素產(chǎn)量的影響

圖1顯示的是在基礎發(fā)酵培養(yǎng)基中加入麩皮和玉米芯粉對蟲草素合成的影響。加入8g/L玉米芯粉使得蟲草素產(chǎn)量有顯著提高，達到0.19g/L。這可能是由于玉米芯粉中含有蛹蟲草菌絲體生長和蟲草素合成所需的營養(yǎng)物質(zhì)，例如糖和蛋白等。但總體來講，麩皮和玉米芯的加入對蟲草素的產(chǎn)量極為不利。特別是麩皮的加入，使得蟲草素的產(chǎn)量僅為0.03～0.10g/L。而李瑞雪等將3%麩皮加入蟬擬青霉發(fā)酵的液體培養(yǎng)基，發(fā)酵4d蟲草素含量達到36.7mg/L［7］。這可能是由于發(fā)酵菌株不同造成的，蛹蟲草屬于寄生真菌，蛋白酶活性較強。而麩皮和玉米芯中含有3%～6%的植酸，植酸能夠絡合金屬離子，導致蛋白酶活性下降。而且，蛹蟲草菌體中可能缺乏植酸酶。因此，麩皮和玉米芯粉不但不能促進蟲草素的合成，而且能通過抑制菌體對蛋白的消化吸收抑制蟲草素合成活性。因此，若采用谷物原料進行蛹蟲草固態(tài)發(fā)酵或者液體發(fā)酵均應先去除其中的植酸，這樣才能不影響菌絲體的生長和蟲草素的積累。

2.2 蛹蟲草菌絲體生長與蟲草素合成的關系

圖2顯示的是菌體量和蟲草素的變化曲線。在有氧振蕩培養(yǎng)的條件下，蛹蟲草的生長延遲期較短，對數(shù)生長期菌絲體生長速率快，在第4d附近即達到最大菌體量(25.03g/L)，其對數(shù)生長期的菌體生長速率達到12.06g/L/d。蟲草素的合成是在培養(yǎng)至第2d以后才開始進行的，說明在此之前，菌絲體中合成蟲草素的相關酶系還不健全或是缺乏某一重要輔因子。培養(yǎng)3d后，蟲草素的合成以恒定的速率積累，在第 9d時達到 0.51g/L，蟲草素合成效率為0.057g/L/d。由圖2可知，蟲草素的合成與菌體生長是部分分離的。因此，蟲草素發(fā)酵模式屬于部分生長偶聯(lián)型發(fā)酵。

圖2 菌絲體生長曲線與蟲草素的積累進程曲線Fig.2 The growth curve of C.militaris and the process of cordycepin production

2.3 腺苷補料時間對蟲草素合成的影響

眾多的研究已表明，蟲草素的直接合成前體是腺苷［8］，而腺苷是通過嘌呤核苷酸的合成途徑合成的。在深層液體發(fā)酵中，蛹蟲草菌絲體的形態(tài)不斷變化，同時其代謝特性也在發(fā)生變化。因此，腺苷的加入時間對腺苷的轉(zhuǎn)化、蟲草素的合成具有明顯影響。

如圖3所示，加入3g/L腺苷后的第2d開始連續(xù)3d監(jiān)測發(fā)酵液中蟲草素產(chǎn)量的變化。第4d加入腺苷，在第7d時，蟲草素產(chǎn)量達到最高，為0.63g/L，比未加腺苷的最高產(chǎn)量0.51g/L多23.5%，說明腺苷的加入能夠促進蟲草素的合成。第5d加入3g/L腺苷，蟲草素積累量最大，發(fā)酵至第9d時為0.91g/L，比0.51g/L提高78.4%，而且有不斷增加的趨勢。過了第5d，加入腺苷，蟲草素的積累開始下降。至第8d時，加入3g/L腺苷，蟲草素的積累僅為0.3～0.4g/L，比未加入腺苷的還低。因此，腺苷補料時間在整個發(fā)酵過程中的起著至關重要的作用，當發(fā)酵至第5d時添加3g/L腺苷，蟲草素的積累能夠達到最大。這進一步證明了蟲草素的合成屬于部分生長偶聯(lián)型，蟲草素的最佳合成時機應該滯后于最大菌體量出現(xiàn)的時間。由圖2可知，最大菌體量出現(xiàn)的時間為第4d，而從圖3可知第5d加入腺苷最有利于蟲草素積累，因此從圖2和圖3判斷這一滯后的時間大約是1d。而在最佳補料時間之前加入腺苷，腺苷可能對菌體生長有一定的抑制，繼而影響蟲草素的合成;在最佳補料時間之后加入腺苷，由于有氧條件下，菌體代謝速率較快導致葡萄糖等底物快速消耗，此時已無足夠能量和還原力供給腺苷向蟲草素的轉(zhuǎn)化，使得蟲草素的積累不高。

圖3 腺苷補料時間對蟲草素合成的影響Fig.3 Effect of adenosine addition time on cordycepin production

2.4 腺苷添加量對蟲草素合成的影響

很多文獻報道了腺苷的加入對蟲草素積累的作用。文庭池等對添加前體促進蟲草素合成做了深入的研究，發(fā)現(xiàn)單獨添加8g/L腺苷，蟲草素濃度達到0.68g/L，但是剩余腺苷濃度也較大，達到0.4g/L。而2g/L腺苷和16g/L谷氨酰胺組合添加胞內(nèi)蟲草素含量達到了0.74g/L，菌絲體產(chǎn)量也達到28.5g/L;1g/L腺苷和2g/L甘氨酸組合添加蟲草素含量達到了1.09g/L［9－10］。因此，我們考察了在最優(yōu)添加時間下，腺苷添加量對蟲草素積累的影響。

如圖4所示，發(fā)酵7d后，6g/L的腺苷加入對菌絲體產(chǎn)蟲草素的酶系有一定的抑制作用，蟲草素的積累僅為0.5g/L。但是隨著發(fā)酵的繼續(xù)進行，發(fā)現(xiàn)加入4g/L腺苷的蟲草素積累速率較小。而腺苷加入量小于4g/L和大于4g/L的實驗組蟲草素均有較大的蟲草素積累速率，而且這一分布類似“V”形曲線。發(fā)酵11d后，加入6g/L腺苷的實驗組蟲草素積累達到1.62g/L，優(yōu)于1.09g/L。

由圖5可知，發(fā)酵5d后，大于4g/L腺苷加入量的實驗組，蟲草素對腺苷的得率控制在25%附近。推測形成“V”形曲線的可能原因是由于當腺苷的濃度大于4g/L時，整個發(fā)酵過程受到酶反應平衡的控制;但當腺苷濃度低于4g/L時，蟲草素對腺苷的得率不會對酶反應產(chǎn)生明顯影響，蟲草素的合成可以達到很高的得率。當腺苷濃度為2g/L時，蟲草素對腺苷的得率達到67.0%。這一現(xiàn)象進一步說明了腺苷在蟲草素合成中的雙重作用。一方面腺苷作為蟲草素的直接轉(zhuǎn)化前體，可以不斷合成蟲草素;另一方面，當腺苷濃度超過4g/L，蟲草素對腺苷的得率有可能阻止該反應平衡向蟲草素合成方向移動。

圖4 發(fā)酵5d添加腺苷對蟲草素產(chǎn)量的影響Fig.4 Effect of adenosine on cordycepin production during 5 days of fermentation

圖5 發(fā)酵5d后添加腺苷對蟲草素得率的影響Fig.5 Effect of adenosine on the yield of cordycepin on 5 days of fermentation

2.5 振蕩培養(yǎng)時間對兩步法發(fā)酵產(chǎn)蟲草素的影響

Shih等人比較了振蕩培養(yǎng)與振蕩－靜置兩步培養(yǎng)，提出了先振蕩后靜置的發(fā)酵策略。經(jīng)過Box－Behnken實驗設計和響應面優(yōu)化，最終蟲草素產(chǎn)量達到2214.5mg/L，產(chǎn)率為92.3mg/L/d［11］。隨后，劉艷芳等人也對蛹蟲草的靜置發(fā)酵進行了深入研究。純靜置發(fā)酵有利于蟲草素的產(chǎn)生和積累。在添加0.5g/L腺嘌呤的條件下靜置發(fā)酵28d，蟲草素產(chǎn)量達到2.05g/L，產(chǎn)率達到73.2mg/L/d［12］。而且，崔建東等在研究了不同培養(yǎng)方法對北冬蟲夏草生長和多糖合成的影響后，發(fā)現(xiàn)兩階段發(fā)酵方法(搖動培養(yǎng)加靜止培養(yǎng))對于蟲草多糖的合成效果也是最好的，通過響應面優(yōu)化的方法獲得兩階段發(fā)酵培養(yǎng)的最佳工藝，并建立了適合蟲草兩階段發(fā)酵合成多糖的模型。蟲草多糖的最大產(chǎn)量分別是搖動培養(yǎng)和靜止培養(yǎng)的1.5倍和2倍［13］。表1顯示的是振蕩發(fā)酵時間對蟲草素產(chǎn)量的影響，發(fā)現(xiàn)振蕩發(fā)酵4d后靜置發(fā)酵，蟲草素產(chǎn)量最大，能夠達到1.6g/L，產(chǎn)率達到145.5mg/L/d。蟲草素的產(chǎn)率比之前的研究分別提高 57.6% (92.3mg/L/d［11］)和98.8%(73.2mg/L/d［12］)。

表1 振蕩培養(yǎng)時間對兩步法發(fā)酵產(chǎn)蟲草素的影響Table 1 Effect of the shake－culture time on cordycepin production using two－step fermentation

3 結(jié)論

本文通過對外源添加物以及發(fā)酵方式的研究，發(fā)現(xiàn)了腺苷的加入時機和加入量與蟲草素合成的關系。當腺苷加入量大于4g/L時，蟲草素得率維持在25%，體現(xiàn)了該酶反應平衡的關系。另外，通過菌絲體生長曲線的繪制，發(fā)現(xiàn)蟲草素合成與菌絲體生長之間存在部分偶聯(lián)。而且，通過振蕩－靜置發(fā)酵實驗得到當菌絲體量達到最大時(振蕩發(fā)酵4d)，改用靜置發(fā)酵(7d)，獲得的蟲草素產(chǎn)量和產(chǎn)率分別達到1.6g/L和145.5mg/L/d。該蟲草素產(chǎn)率在同類型發(fā)酵中是最高的。

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Study on culture condition of cordycepin fromCordyceps militarisfermentation

TANG Jia－peng，LIU Yi－ting，ZHAO Qiang，DONG Wei，ZHU Li
(Department of Biochemistry and Pharmacy，Institute of Nautical Medicine，Nantong University，Nantong 226001，China)

Effects of exogenous additives，such as wheat bran，corn cob and adenosine on cordycepin production in a submerged culture ofCordyceps militariswere investigated.The results showed that the addition of 3g/L of adenosine on the fifth day of fermentation was superior to other day.When addition amount of adenosine exceeds 4g/L，the yield of cordycepin on adenosine was about 25%and the maximal cordycepin production reached 1.6g/L.The dynamics between growth of mycelium and the cordycepin synthesis were analyzed.The fermentation was mixed－growth associated.The optimum values for cordycepin production were shaken for 4d followed by 7d static culture.The maximum cordycepin production and productivity reached 1.60g/L and 145.5mg/L/d，respectively.It was indicated that the new culture technology obtained in this work possessed a high potential for the industrial production of cordycepin ofCordyceps militaris.

Cordyceps militaris;cordycepin;adenosine;shake－static culture

TQ920.6

A

1002－0306(2012)21－0181－04

2012－03－30

湯佳鵬(1981－)，男，博士，助理研究員，主要從事發(fā)酵工程及代謝調(diào)控研究。

江蘇省自然科學基金(BK2011392);南通市應用研究計劃(AS2011021)。