窄分子量分布?xì)ぞ厶堑闹苽涔に囇芯?/h1>
2012-10-25 01:23李星科夏文水
食品工業(yè)科技 2012年14期
李星科，縱 偉，夏文水
（1.鄭州輕工業(yè)學(xué)院食品與生物工程系，河南鄭州 450002;2.江南大學(xué)食品學(xué)院，江蘇無錫 214122)
窄分子量分布?xì)ぞ厶堑闹苽涔に囇芯?/p>
李星科1，縱 偉1，夏文水2，*
（1.鄭州輕工業(yè)學(xué)院食品與生物工程系，河南鄭州 450002;2.江南大學(xué)食品學(xué)院，江蘇無錫 214122)
研究了超聲波法制備窄分子量分布?xì)ぞ厶堑闹苽涔に?，在單因素?shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，根據(jù)旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計(jì)原理，研究溫度、殼聚糖濃度、乙酸濃度三個(gè)影響因素對(duì)超聲波處理后殼聚糖分子量分布指數(shù)的影響，并建立了回歸數(shù)學(xué)模型，通過實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行方差分析及對(duì)數(shù)學(xué)模型進(jìn)行優(yōu)化得到了窄分子量分布的殼聚糖的制備條件。結(jié)果表明，最佳工藝參數(shù)為：溫度24℃、乙酸濃度0.27mol/L，殼聚糖濃度根據(jù)實(shí)際需要定為1%，經(jīng)過超聲波處理后殼聚糖分子量分布指數(shù)從11.51降到了4.25。
殼聚糖，超聲波處理，分子量分布指數(shù)，優(yōu)化
分子量分布是指高聚物中各種不同的分子量組分在總量中所占的分量，一般用分子量分布指數(shù)表示，重均分子量與數(shù)均分子量的比值（Mw/Mn)，比值愈大說明分子量分布愈寬。分子量分布直接影響著高聚物的物理化學(xué)性質(zhì)以及其加工性能等[1]。殼聚糖是自然界唯一的堿性多糖，具有生物相容性、可降解性、無毒性及多種對(duì)人體有益的功能活性，日益受到人們的關(guān)注和青睞，在食品、化工、紡織、醫(yī)藥、環(huán)保等領(lǐng)域都有著廣泛的用途[2]。殼聚糖屬于高聚物，自然界中天然存在的殼聚糖分子量一般也在幾萬至上百萬不等，經(jīng)過化學(xué)方法提取出來的殼聚糖的分子量一般分布很寬[3]。Mette H Ottsy等用凝膠過濾色譜法對(duì)殼聚糖進(jìn)行分級(jí)[4]，這種方法得到的多糖純度較高，但該技術(shù)過程較為繁瑣、處理量太小難以實(shí)現(xiàn)工業(yè)化應(yīng)用。非對(duì)稱場(chǎng)流分離技術(shù)（AFFFF)是一個(gè)全新的技術(shù)，能快速而有效分離和準(zhǔn)確表征不同的粒子和高聚物，Mao Shirui和Augsten Christian利用非對(duì)稱場(chǎng)流分離技術(shù)對(duì)殼聚糖進(jìn)行了分離，但是該技術(shù)也存在處理量太小的問題，適合于分離和測(cè)定大分子化合物、膠體和顆粒樣品[5-6]。據(jù)報(bào)道超聲波處理可以降低殼聚糖的分子量分布指數(shù)，而且處理過程中殼聚糖的氨基含量不會(huì)發(fā)生改變[7-10]。因此本文采用超聲波處理殼聚糖，并系統(tǒng)研究關(guān)鍵因素對(duì)超聲波處理后殼聚糖分子量分布指數(shù)的影響，以確定超聲波法制備窄分子量分布?xì)ぞ厶堑淖罴压に嚒?/p>
1 材料與方法
1.1 材料與設(shè)備
殼聚糖（重均分子量58萬，分子量分布指數(shù)11.52，脫乙酰度86.1%，實(shí)驗(yàn)室自測(cè)) 由南通雙林生物制品有限責(zé)任公司提供;冰乙酸、氨水等 均為分析純。
Y88-II超聲波細(xì)胞破碎儀 中國寧波新芝生物科技股份有限公司;CHRIST凍干機(jī) 德國Martin Christ GmbH;DELTA-320-S pH計(jì) 梅特勒-托利多儀器上海有限公司;Waters600高效液相色譜儀 包括2410示差折光檢測(cè)器、Empower工作站、ultrahydrogel 2000和ultrahydrogel 250色譜分離柱。
1.2 實(shí)驗(yàn)方法
1.2.1 超聲波處理殼聚糖 將一定量的殼聚糖溶解于酸溶液中配制成殼聚糖溶液，冰箱中放置過夜，于一定溫度下間歇式超聲波處理后，用稀氨水溶液調(diào)節(jié)溶液的pH至8～8.5，收集沉淀，用蒸餾水反復(fù)洗滌至中性，冷凍干燥即得到樣品。
1.2.2 單因素實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 當(dāng)超聲波細(xì)胞破碎儀的功率為150W，超聲時(shí)間為60min時(shí)，研究殼聚糖濃度（0.5%、1.0%、1.5%、2%)、酸的種類（相同濃度的乙酸、鹽酸、乳酸溶液)、乙酸濃度（0.1、0.2、0.5、1mol/L)、溫度（10、30、50℃)、溶液pH（3.9、4.4、4.9、5.4、5.9)等因素對(duì)超聲波處理后殼聚糖分子量分布指數(shù)的影響。
當(dāng)超聲波細(xì)胞破碎儀的功率為150W、殼聚糖濃度為1.0%、乙酸濃度為0.2mol/L、溫度為30℃時(shí)，研究不同的超聲時(shí)間對(duì)殼聚糖分子量分布指數(shù)的影響。
1.2.3 旋轉(zhuǎn)正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用三因素二次通用旋轉(zhuǎn)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，研究溫度、殼聚糖的濃度、乙酸濃度3個(gè)因素對(duì)超聲波處理后的殼聚糖分子量分布指數(shù)的影響。其中超聲波細(xì)胞破碎儀的功率為150W，超聲時(shí)間為60min。因素水平編碼如表1所示。
表1 三因素二次通用旋轉(zhuǎn)設(shè)計(jì)因素水平編碼表Table 1 Factors and levels coding of three factors quadratic rotation design
1.2.4 殼聚糖分子量分布的測(cè)定 在Waters600高效液相色譜儀（2410示差折光檢測(cè)器、Empower工作站)上，用ultrahydrogel 2000和ultrahydrogel 250作為色譜分離柱，進(jìn)行分子量分布測(cè)定，用Empower工作站進(jìn)行數(shù)據(jù)采集和分析，標(biāo)準(zhǔn)樣品為已知分子量的水溶性右旋糖苷（2000000、133800、41100、21400、4600、2500)，以0.2mol/L CH3COOH/0.15mol/L CH3COONH4緩沖溶液為流動(dòng)相，流速為0.9mL/min，柱溫30℃。
分子量分布指數(shù)=重均分子量（Mw)/數(shù)均分子量（Mn)
1.2.5 殼聚糖脫乙酰度（DD)的測(cè)定 DD的測(cè)定參見文獻(xiàn)[10]。
1.2.6 數(shù)據(jù)分析與作圖 采用SASV8軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，orign8.0軟件作圖。
2 結(jié)果與討論
2.1 單因素實(shí)驗(yàn)
2.1.1 殼聚糖濃度的影響 當(dāng)超聲波細(xì)胞破碎儀的功率為150W、乙酸濃度為0.2mol/L、溫度為30℃、超聲時(shí)間為30min時(shí)，研究不同的殼聚糖濃度對(duì)超聲處理后的殼聚糖分子量分布指數(shù)的影響。如圖1所示，在殼聚糖濃度0.5%～2.0%的范圍內(nèi)，隨著殼聚糖濃度的增大，殼聚糖的分子量分布指數(shù)增大，說明殼聚糖濃度對(duì)超聲波處理后殼聚糖的分子量分布有一定的影響。
圖1殼聚糖濃度對(duì)分子量分布的影響Fig.1 Effect of chitosan concentration on molecular weight distribution
2.1.2 酸的種類的影響 將殼聚糖分別溶解在相同濃度的乳酸、乙酸和鹽酸溶液，當(dāng)超聲波細(xì)胞破碎儀的功率為150W、殼聚糖濃度為1%、酸濃度為0.2mol/L、溫度為30℃、超聲時(shí)間為30min時(shí)，研究酸的種類對(duì)超聲波處理后的殼聚糖分子量分布的影響。如圖2所示，經(jīng)超聲波處理的殼聚糖的分子量分布指數(shù)三者沒有顯著差別，說明酸的種類對(duì)超聲波處理后殼聚糖的分子量分布沒有顯著影響。
圖2 酸種類對(duì)分子量分布的影響Fig.2 Effect of acid species on molecular weight distribution
2.1.3 乙酸濃度的影響 當(dāng)超聲波細(xì)胞破碎儀的功率為150W、殼聚糖濃度為1%、溫度為30℃、超聲時(shí)間為30min時(shí)，研究乙酸濃度對(duì)超聲波處理的殼聚糖的分子量分布指數(shù)的影響。如圖3所示，在0.1～1mol/L的范圍內(nèi)，隨著乙酸濃度的提高，超聲波處理的殼聚糖的分子量分布指數(shù)先減小后增大，在濃度0.2mol/L時(shí)達(dá)到最低，但濃度大于0.5mol/L時(shí)，乙酸濃度對(duì)處理后的分子量分布指數(shù)影響不大，說明乙酸濃度對(duì)超聲波處理后殼聚糖的分子量分布有一定的影響。
圖3 乙酸濃度對(duì)分子量分布的影響Fig.3 Effect of acetic acid concentration on molecular weight distribution
2.1.4 超聲時(shí)間的影響 當(dāng)超聲波細(xì)胞破碎儀的功率為150W、殼聚糖濃度為1%、乙酸濃度為0.2mol/L、溫度為30℃時(shí)，研究超聲時(shí)間對(duì)超聲波處理的殼聚糖的分子量分布指數(shù)的影響。如圖4所示，在0～90min內(nèi)，隨著時(shí)間的延長，超聲波處理后的殼聚糖的分子量分布指數(shù)呈下降趨勢(shì)，在0～60min內(nèi)下降比較快，在60～ 90min內(nèi)下降比較緩慢，說明處理時(shí)間對(duì)分子量分布指數(shù)有顯著影響。
圖4 超聲時(shí)間對(duì)分子量分布的影響Fig.4 Effect of ultrasonic time on molecular weight distribution
2.1.5 溫度的影響 當(dāng)超聲波細(xì)胞破碎儀的功率為150W、殼聚糖濃度為1%、酸濃度為0.2mol/L、超聲時(shí)間為30min時(shí)，研究溫度對(duì)超聲波處理的殼聚糖的分子量分布指數(shù)的影響。如圖5所示，在選擇的10、30、50℃三個(gè)溫度范圍內(nèi)，隨著溫度的升高，超聲波處理后的殼聚糖的分子量分布指數(shù)先減小后增大，在30℃條件下處理殼聚糖得到的分子量分布最窄，說明溫度對(duì)超聲波處理后殼聚糖的分子量分布有一定的影響。
圖5 溫度對(duì)分子量分布的影響Fig.5 Effect of temperature on molecular weight distribution
2.1.6 pH的影響 當(dāng)超聲波細(xì)胞破碎儀的功率為150W、殼聚糖濃度為1%、酸濃度為0.2mol/L、溫度為30℃、超聲時(shí)間為30min時(shí)，研究溶液的pH對(duì)超聲波處理后殼聚糖的分子量分布指數(shù)的影響。如圖6所示，在3.9～5.9的范圍內(nèi)，隨著殼聚糖溶液pH的升高，超聲波處理后的殼聚糖的分子量分布指數(shù)先增大后減小，在pH4.4時(shí)達(dá)到最大值。而在pH4.4、4.9、5.4、5.9的條件下，超聲波處理后的殼聚糖的分子量分布指數(shù)都比殼聚糖溶解于單一的乙酸溶液后的pH3.9都大，說明pH對(duì)超聲波處理后殼聚糖的分子量分布沒有積極的影響。
圖6 pH對(duì)分子量分布的影響Fig.6 Effect of pH on molecular weight distribution
從單因素實(shí)驗(yàn)可以得出，殼聚糖濃度、乙酸濃度和溫度對(duì)超聲波降解后的殼聚糖的分子量分布指數(shù)影響較大，因此選擇這三個(gè)因素建立旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計(jì)，系統(tǒng)研究關(guān)鍵因素對(duì)超聲波處理后殼聚糖分子量分布指數(shù)的影響，并確定超聲波法制備窄分子量分布?xì)ぞ厶堑淖罴压に嚒?/p>
2.2 三因素二次通用旋轉(zhuǎn)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果分析
表2 三因素二次通用旋轉(zhuǎn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Three elements quadratic current revolving design and results
表3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果的方差分析Table 3 Variance analysis of experimental results
2.2.1 回歸分析及回歸模型的建立 對(duì)實(shí)驗(yàn)所得的結(jié)果采用SAS軟件RSREG過程進(jìn)行多元回歸分析，表3為實(shí)驗(yàn)結(jié)果的方差分析表。由表3可知，該回歸模型的F值為165，大于在0.01水平上的F值，而失擬項(xiàng)的F值為4.41，小于在0.05水平上的F值，說明模型擬合結(jié)果較好;此外由表3可知，回歸方程的一次項(xiàng)均差異極顯著（p＜0.0001)，說明各個(gè)單因素都對(duì)分子量分布值有極顯著影響;二次項(xiàng)中X1、X3對(duì)分子量分布值有極顯著影響，而X2對(duì)分子量分布值有顯著影響，說明三因素對(duì)分子量分布值的影響并不是簡單的線性關(guān)系，但是因素之間的交互作用對(duì)分子量分布值的影響不顯著[11-12]。
以分子量分布指數(shù)為Y值，得出與三種實(shí)驗(yàn)因素的編碼值為自變量的回歸方程。一次回歸模型和二次回歸模型的F值都可以說明模型方程差異極顯著;回歸方程的決定系數(shù)R2=0.9933，失擬項(xiàng)分析表明，該回歸方程無失擬因素存在，回歸模型與實(shí)測(cè)值能較好地?cái)M合，因此可以用該模型分析各工藝參數(shù)對(duì)分子量分布指數(shù)的影響。由該回歸方程偏回歸系數(shù)絕對(duì)值的大小，可以得到各因素影響程度從大到小依次排列為殼聚糖的濃度、溫度和乙酸濃度。
2.2.2 單因素效應(yīng)分析 在單因子效應(yīng)分析中，采用降維分析，將其它的因素固定在零水平，可分別得到各個(gè)單因素對(duì)應(yīng)的回歸方程，從此可以表述單因素變動(dòng)時(shí)對(duì)分子量分布指數(shù)的影響，3個(gè)單因子效應(yīng)方程如下，根據(jù)以上式（1)作圖，可以得到單因子效應(yīng)曲線圖7。
目前研究認(rèn)為，超聲波處理大分子物質(zhì)的主要機(jī)理是機(jī)械性斷鍵作用以及自由基的氧化還原反應(yīng)，部分學(xué)者認(rèn)為機(jī)械效應(yīng)所作用的位點(diǎn)靠近最大分子的中心[13-16]。因此經(jīng)過超聲波處理后，大分子的殼聚糖變成小分子的殼聚糖，殼聚糖的平均分子量降低，而小分子的殼聚糖變化不大，分子量分布指數(shù)也減小。李瑾等研究證明隨反應(yīng)時(shí)間的延長，分子量大的殼聚糖更容易受到降解，其降解速率和降解速率常數(shù)降低較快，而分子量小的殼聚糖具有較低的降解速率和降解速率常數(shù)，隨時(shí)間變化不明顯[17]。
2.2.2.1 溫度的效應(yīng)分析 隨著溫度的升高，殼聚糖的分子量分布指數(shù)先減小后增大，這與單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果相一致。當(dāng)溫度的實(shí)驗(yàn)水平為-0.2680時(shí)，即溫度為26.8℃時(shí)，分子量分布指數(shù)最小。當(dāng)溫度開始升高時(shí)，殼聚糖分子熱運(yùn)動(dòng)加劇，快速變化的機(jī)械運(yùn)動(dòng)足以引起大分子的殼聚糖分子中共價(jià)鍵的斷裂，而導(dǎo)致殼聚糖的降解，分子量分布指數(shù)的降低;同時(shí)溫度升高，溶劑蒸氣壓隨著增大，樣品溶液內(nèi)部的氣體流失，超聲空化作用產(chǎn)生的空泡爆裂強(qiáng)度較低，所釋放出的能量也就較低，產(chǎn)生的自由基也少，因此由自由基氧化還原反應(yīng)引起的殼聚糖的降解速率降低，分子量分布指數(shù)升高。從圖7可以看出，在溫度低于26.8℃時(shí)，分子量分布指數(shù)隨溫度的升高而降低趨勢(shì)并不明顯，而當(dāng)溫度高于26.8℃時(shí)，超聲降解作用隨著溫度的升高而升高的趨勢(shì)非常顯著。這也說明了，殼聚糖的降解是機(jī)械效應(yīng)與自由基的氧化還原反應(yīng)的共同作用的結(jié)果。
圖7 單因子效應(yīng)曲線Fig.7 Single factor utility curves
2.2.2.2 殼聚糖濃度的效應(yīng)分析 濃度對(duì)分子量分布指數(shù)的影響接近線性關(guān)系，從圖7可以看出，分子量分布指數(shù)隨著體系中殼聚糖濃度的增大而增大。這與Chen Rong Huei等的研究結(jié)果一致[7]。殼聚糖溶液濃度較大時(shí)，在相同的超聲功率下，分子鏈所接受的切點(diǎn)少，分子量變化幅度小，而濃度低時(shí)分子鏈所接受的切點(diǎn)多，分子量下降幅度大，殼聚糖降解速度快。同時(shí)殼聚糖濃度低時(shí)，溶液粘度也低，有利于空化泡的發(fā)生，從而使降解反應(yīng)容易進(jìn)行。
2.2.2.3 乙酸濃度的效應(yīng)分析 乙酸濃度分子量分布指數(shù)的影響是二次關(guān)系，從圖7可以看出，隨著乙酸濃度的增加，殼聚糖的分子量分布指數(shù)是先減小后增大，這與單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果相一致。當(dāng)乙酸濃度的實(shí)驗(yàn)水平為-0.3341時(shí)，即乙酸濃度為0.26mol/L時(shí)，分子量分布指數(shù)最小。Trzcinski等用低功率超聲發(fā)生器降解殼聚糖時(shí)發(fā)現(xiàn)，動(dòng)力學(xué)降解速率參數(shù)k隨著乙酸濃度的增加而增加，表明超聲能夠加速殼聚糖酸性水解[15]。因?yàn)樗嵝运馐菬o規(guī)律的，因此這也說明了隨著乙酸濃度的增加，分子量分布指數(shù)升高的原因。
將各模型分別固定2個(gè)因素于0水平，可以得到剩下1個(gè)因素與分子量分布指數(shù)的一元降維的回歸模型，得到單因子邊際效應(yīng)方程。單因子邊際效應(yīng)方程反映了分子量分布指數(shù)隨不同因子編碼值的變化速率。單因子效應(yīng)方程如下：
圖8 邊際效應(yīng)曲線Fig.8 Marginal utility curves
根據(jù)單因子邊際效應(yīng)方程可以作出單因子邊際效應(yīng)曲線。由圖8可知，隨著因素水平的提高，X1、X2、X3的邊際得率都呈上升趨勢(shì)。3條單因子邊際效應(yīng)曲線中，超聲溫度對(duì)應(yīng)的斜率最大，其次是乙酸濃度，最小的是殼聚糖濃度對(duì)應(yīng)的斜率，這說明殼聚糖濃度的變化對(duì)分子量分布的邊際得率的影響較其他兩個(gè)因素穩(wěn)定。當(dāng)X1、X3的水平分別取-0.2680、-0.3341時(shí)，X1、X3的邊際得率均為0，此時(shí)無減小效應(yīng)，2個(gè)因素在該水平對(duì)應(yīng)的分子量分布指數(shù)達(dá)到最小值，繼續(xù)提高因素水平，邊際得率為正值，分子量分布指數(shù)開始增大。
2.3 最佳工藝參數(shù)的確定及回歸模型的驗(yàn)證
表4 回歸模型驗(yàn)證和結(jié)果比較Table 4 Validation of regression model and result comparison
由SAS軟件RSREG過程結(jié)果可知，當(dāng)溫度、乙酸濃度分別為24℃、0.27mol/L（相當(dāng)于1.6%)時(shí)，殼聚糖濃度是越小越好，此時(shí)能取得分子量分布指數(shù)的最小值。殼聚糖濃度很低，每次的處理量太小，在實(shí)際操作中選擇殼聚糖濃度為1%左右較適宜。理論值與實(shí)際值經(jīng)驗(yàn)證誤差為1.7%，所以該模型較好地反映了各因素對(duì)分子量分布指數(shù)的影響。如圖9所示，經(jīng)過超聲波處理后殼聚糖分子量分布變窄了，分子量分布指數(shù)從11.51降到了4.25。
超聲波處理后的殼聚糖的脫乙酰度基本沒有改變，這與王偉、Baxter等人的研究結(jié)果一致[9，14]，這表明超聲波作用于殼聚糖時(shí)，對(duì)殼聚糖分子內(nèi)存在的四種不同的糖苷鍵連接方式不存在特異性識(shí)別能力，所以不會(huì)選擇性地切斷殼聚糖分子的糖苷鍵，使得降解產(chǎn)物的脫乙酰度與殼聚糖原料相比沒有改變。
圖9 殼聚糖的分子量分布Fig.9 Molecular weight distribution of chitosan
3 結(jié)論
對(duì)超聲波處理后殼聚糖分子量分布指數(shù)的影響因素由大到小依次順序是殼聚糖濃度、溫度、乙酸濃度。采用三因素二次通用旋轉(zhuǎn)設(shè)計(jì)，建立了溫度、殼聚糖濃度和乙酸濃度3個(gè)因素對(duì)應(yīng)的分子量分布指數(shù)的數(shù)學(xué)模型，實(shí)現(xiàn)了對(duì)工藝的優(yōu)化，得出最佳工藝參數(shù)：溫度為24℃、乙酸濃度為0.27mol/L、殼聚糖濃度根據(jù)實(shí)際需要定為1%，各個(gè)因素對(duì)分子量分布指數(shù)的影響由大到小依次順序是殼聚糖濃度、溫度、乙酸濃度。經(jīng)過化學(xué)方法提取出來的殼聚糖一般分子量分布很寬，但是經(jīng)過超聲波處理后分子量分布變窄了，分子量分布系數(shù)從11.51降到了4.25。
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Study on preparing technique of chitosan with narrow molecular weight distribution
LI Xing-ke1，ZONG Wei1，XIA Wen-shui2，*
（1.Department of Food&Biological Engineering，Zhengzhou University of Light Industry，Zhengzhou 450002，China;2.School of Food Science and Technology，Jiangnan University，Wuxi 214122，China)
Preparing technique of chitosan with narrow molecular weight distribution through ultrasonic processed was investigated.According to the rotary unitized design principles，the influence of temperature and the concentration of chitosan and acetic acid on the polydispersity of chitosan after ultrasonic process were studied and the mathematical model was established based on the basis of single factor experiments.The preparation conditions of chitosan with narrow polydispersity were obtained by variance analysis and the optimization of mathematical model.Results showed that the optimum conditions of ultrasonic process were that the temperature of 24℃，the concentration of acetic acid of 0.27mol/L and the concentration of chitosan of 1%according to the actual situation.The polydispersity of chitosan decreased from 11.51 to 4.25 after ultrasonic processed.
chitosan;ultrasonic process;polydispersity;optimization
TS201.1
B
1002-0306（2012)14-0255-05
2011－11－29 *通訊聯(lián)系人
李星科（1981-)，男，講師，博士，研究方向：多糖化學(xué)。
國家863計(jì)劃項(xiàng)目（2007AA100401);重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室目標(biāo)導(dǎo)向項(xiàng)目（SKLF-MB-200805);江蘇省科技成果轉(zhuǎn)化項(xiàng)目（BA2009082)。
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李星科，縱 偉，夏文水
（1.鄭州輕工業(yè)學(xué)院食品與生物工程系，河南鄭州 450002;2.江南大學(xué)食品學(xué)院，江蘇無錫 214122)
窄分子量分布?xì)ぞ厶堑闹苽涔に囇芯?/p>
李星科1，縱 偉1，夏文水2，*
（1.鄭州輕工業(yè)學(xué)院食品與生物工程系，河南鄭州 450002;2.江南大學(xué)食品學(xué)院，江蘇無錫 214122)
研究了超聲波法制備窄分子量分布?xì)ぞ厶堑闹苽涔に?，在單因素?shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，根據(jù)旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計(jì)原理，研究溫度、殼聚糖濃度、乙酸濃度三個(gè)影響因素對(duì)超聲波處理后殼聚糖分子量分布指數(shù)的影響，并建立了回歸數(shù)學(xué)模型，通過實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行方差分析及對(duì)數(shù)學(xué)模型進(jìn)行優(yōu)化得到了窄分子量分布的殼聚糖的制備條件。結(jié)果表明，最佳工藝參數(shù)為：溫度24℃、乙酸濃度0.27mol/L，殼聚糖濃度根據(jù)實(shí)際需要定為1%，經(jīng)過超聲波處理后殼聚糖分子量分布指數(shù)從11.51降到了4.25。
殼聚糖，超聲波處理，分子量分布指數(shù)，優(yōu)化
分子量分布是指高聚物中各種不同的分子量組分在總量中所占的分量，一般用分子量分布指數(shù)表示，重均分子量與數(shù)均分子量的比值（Mw/Mn)，比值愈大說明分子量分布愈寬。分子量分布直接影響著高聚物的物理化學(xué)性質(zhì)以及其加工性能等[1]。殼聚糖是自然界唯一的堿性多糖，具有生物相容性、可降解性、無毒性及多種對(duì)人體有益的功能活性，日益受到人們的關(guān)注和青睞，在食品、化工、紡織、醫(yī)藥、環(huán)保等領(lǐng)域都有著廣泛的用途[2]。殼聚糖屬于高聚物，自然界中天然存在的殼聚糖分子量一般也在幾萬至上百萬不等，經(jīng)過化學(xué)方法提取出來的殼聚糖的分子量一般分布很寬[3]。Mette H Ottsy等用凝膠過濾色譜法對(duì)殼聚糖進(jìn)行分級(jí)[4]，這種方法得到的多糖純度較高，但該技術(shù)過程較為繁瑣、處理量太小難以實(shí)現(xiàn)工業(yè)化應(yīng)用。非對(duì)稱場(chǎng)流分離技術(shù)（AFFFF)是一個(gè)全新的技術(shù)，能快速而有效分離和準(zhǔn)確表征不同的粒子和高聚物，Mao Shirui和Augsten Christian利用非對(duì)稱場(chǎng)流分離技術(shù)對(duì)殼聚糖進(jìn)行了分離，但是該技術(shù)也存在處理量太小的問題，適合于分離和測(cè)定大分子化合物、膠體和顆粒樣品[5-6]。據(jù)報(bào)道超聲波處理可以降低殼聚糖的分子量分布指數(shù)，而且處理過程中殼聚糖的氨基含量不會(huì)發(fā)生改變[7-10]。因此本文采用超聲波處理殼聚糖，并系統(tǒng)研究關(guān)鍵因素對(duì)超聲波處理后殼聚糖分子量分布指數(shù)的影響，以確定超聲波法制備窄分子量分布?xì)ぞ厶堑淖罴压に嚒?/p>
1 材料與方法
1.1 材料與設(shè)備
殼聚糖（重均分子量58萬，分子量分布指數(shù)11.52，脫乙酰度86.1%，實(shí)驗(yàn)室自測(cè)) 由南通雙林生物制品有限責(zé)任公司提供;冰乙酸、氨水等 均為分析純。
Y88-II超聲波細(xì)胞破碎儀 中國寧波新芝生物科技股份有限公司;CHRIST凍干機(jī) 德國Martin Christ GmbH;DELTA-320-S pH計(jì) 梅特勒-托利多儀器上海有限公司;Waters600高效液相色譜儀 包括2410示差折光檢測(cè)器、Empower工作站、ultrahydrogel 2000和ultrahydrogel 250色譜分離柱。
1.2 實(shí)驗(yàn)方法
1.2.1 超聲波處理殼聚糖 將一定量的殼聚糖溶解于酸溶液中配制成殼聚糖溶液，冰箱中放置過夜，于一定溫度下間歇式超聲波處理后，用稀氨水溶液調(diào)節(jié)溶液的pH至8～8.5，收集沉淀，用蒸餾水反復(fù)洗滌至中性，冷凍干燥即得到樣品。
1.2.2 單因素實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 當(dāng)超聲波細(xì)胞破碎儀的功率為150W，超聲時(shí)間為60min時(shí)，研究殼聚糖濃度（0.5%、1.0%、1.5%、2%)、酸的種類（相同濃度的乙酸、鹽酸、乳酸溶液)、乙酸濃度（0.1、0.2、0.5、1mol/L)、溫度（10、30、50℃)、溶液pH（3.9、4.4、4.9、5.4、5.9)等因素對(duì)超聲波處理后殼聚糖分子量分布指數(shù)的影響。
當(dāng)超聲波細(xì)胞破碎儀的功率為150W、殼聚糖濃度為1.0%、乙酸濃度為0.2mol/L、溫度為30℃時(shí)，研究不同的超聲時(shí)間對(duì)殼聚糖分子量分布指數(shù)的影響。
1.2.3 旋轉(zhuǎn)正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用三因素二次通用旋轉(zhuǎn)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，研究溫度、殼聚糖的濃度、乙酸濃度3個(gè)因素對(duì)超聲波處理后的殼聚糖分子量分布指數(shù)的影響。其中超聲波細(xì)胞破碎儀的功率為150W，超聲時(shí)間為60min。因素水平編碼如表1所示。
表1 三因素二次通用旋轉(zhuǎn)設(shè)計(jì)因素水平編碼表Table 1 Factors and levels coding of three factors quadratic rotation design
1.2.4 殼聚糖分子量分布的測(cè)定 在Waters600高效液相色譜儀（2410示差折光檢測(cè)器、Empower工作站)上，用ultrahydrogel 2000和ultrahydrogel 250作為色譜分離柱，進(jìn)行分子量分布測(cè)定，用Empower工作站進(jìn)行數(shù)據(jù)采集和分析，標(biāo)準(zhǔn)樣品為已知分子量的水溶性右旋糖苷（2000000、133800、41100、21400、4600、2500)，以0.2mol/L CH3COOH/0.15mol/L CH3COONH4緩沖溶液為流動(dòng)相，流速為0.9mL/min，柱溫30℃。
分子量分布指數(shù)=重均分子量（Mw)/數(shù)均分子量（Mn)
1.2.5 殼聚糖脫乙酰度（DD)的測(cè)定 DD的測(cè)定參見文獻(xiàn)[10]。
1.2.6 數(shù)據(jù)分析與作圖 采用SASV8軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，orign8.0軟件作圖。
2 結(jié)果與討論
2.1 單因素實(shí)驗(yàn)
2.1.1 殼聚糖濃度的影響 當(dāng)超聲波細(xì)胞破碎儀的功率為150W、乙酸濃度為0.2mol/L、溫度為30℃、超聲時(shí)間為30min時(shí)，研究不同的殼聚糖濃度對(duì)超聲處理后的殼聚糖分子量分布指數(shù)的影響。如圖1所示，在殼聚糖濃度0.5%～2.0%的范圍內(nèi)，隨著殼聚糖濃度的增大，殼聚糖的分子量分布指數(shù)增大，說明殼聚糖濃度對(duì)超聲波處理后殼聚糖的分子量分布有一定的影響。
圖1殼聚糖濃度對(duì)分子量分布的影響Fig.1 Effect of chitosan concentration on molecular weight distribution
2.1.2 酸的種類的影響 將殼聚糖分別溶解在相同濃度的乳酸、乙酸和鹽酸溶液，當(dāng)超聲波細(xì)胞破碎儀的功率為150W、殼聚糖濃度為1%、酸濃度為0.2mol/L、溫度為30℃、超聲時(shí)間為30min時(shí)，研究酸的種類對(duì)超聲波處理后的殼聚糖分子量分布的影響。如圖2所示，經(jīng)超聲波處理的殼聚糖的分子量分布指數(shù)三者沒有顯著差別，說明酸的種類對(duì)超聲波處理后殼聚糖的分子量分布沒有顯著影響。
圖2 酸種類對(duì)分子量分布的影響Fig.2 Effect of acid species on molecular weight distribution
2.1.3 乙酸濃度的影響 當(dāng)超聲波細(xì)胞破碎儀的功率為150W、殼聚糖濃度為1%、溫度為30℃、超聲時(shí)間為30min時(shí)，研究乙酸濃度對(duì)超聲波處理的殼聚糖的分子量分布指數(shù)的影響。如圖3所示，在0.1～1mol/L的范圍內(nèi)，隨著乙酸濃度的提高，超聲波處理的殼聚糖的分子量分布指數(shù)先減小后增大，在濃度0.2mol/L時(shí)達(dá)到最低，但濃度大于0.5mol/L時(shí)，乙酸濃度對(duì)處理后的分子量分布指數(shù)影響不大，說明乙酸濃度對(duì)超聲波處理后殼聚糖的分子量分布有一定的影響。
圖3 乙酸濃度對(duì)分子量分布的影響Fig.3 Effect of acetic acid concentration on molecular weight distribution
2.1.4 超聲時(shí)間的影響 當(dāng)超聲波細(xì)胞破碎儀的功率為150W、殼聚糖濃度為1%、乙酸濃度為0.2mol/L、溫度為30℃時(shí)，研究超聲時(shí)間對(duì)超聲波處理的殼聚糖的分子量分布指數(shù)的影響。如圖4所示，在0～90min內(nèi)，隨著時(shí)間的延長，超聲波處理后的殼聚糖的分子量分布指數(shù)呈下降趨勢(shì)，在0～60min內(nèi)下降比較快，在60～ 90min內(nèi)下降比較緩慢，說明處理時(shí)間對(duì)分子量分布指數(shù)有顯著影響。
圖4 超聲時(shí)間對(duì)分子量分布的影響Fig.4 Effect of ultrasonic time on molecular weight distribution
2.1.5 溫度的影響 當(dāng)超聲波細(xì)胞破碎儀的功率為150W、殼聚糖濃度為1%、酸濃度為0.2mol/L、超聲時(shí)間為30min時(shí)，研究溫度對(duì)超聲波處理的殼聚糖的分子量分布指數(shù)的影響。如圖5所示，在選擇的10、30、50℃三個(gè)溫度范圍內(nèi)，隨著溫度的升高，超聲波處理后的殼聚糖的分子量分布指數(shù)先減小后增大，在30℃條件下處理殼聚糖得到的分子量分布最窄，說明溫度對(duì)超聲波處理后殼聚糖的分子量分布有一定的影響。
圖5 溫度對(duì)分子量分布的影響Fig.5 Effect of temperature on molecular weight distribution
2.1.6 pH的影響 當(dāng)超聲波細(xì)胞破碎儀的功率為150W、殼聚糖濃度為1%、酸濃度為0.2mol/L、溫度為30℃、超聲時(shí)間為30min時(shí)，研究溶液的pH對(duì)超聲波處理后殼聚糖的分子量分布指數(shù)的影響。如圖6所示，在3.9～5.9的范圍內(nèi)，隨著殼聚糖溶液pH的升高，超聲波處理后的殼聚糖的分子量分布指數(shù)先增大后減小，在pH4.4時(shí)達(dá)到最大值。而在pH4.4、4.9、5.4、5.9的條件下，超聲波處理后的殼聚糖的分子量分布指數(shù)都比殼聚糖溶解于單一的乙酸溶液后的pH3.9都大，說明pH對(duì)超聲波處理后殼聚糖的分子量分布沒有積極的影響。
圖6 pH對(duì)分子量分布的影響Fig.6 Effect of pH on molecular weight distribution
從單因素實(shí)驗(yàn)可以得出，殼聚糖濃度、乙酸濃度和溫度對(duì)超聲波降解后的殼聚糖的分子量分布指數(shù)影響較大，因此選擇這三個(gè)因素建立旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計(jì)，系統(tǒng)研究關(guān)鍵因素對(duì)超聲波處理后殼聚糖分子量分布指數(shù)的影響，并確定超聲波法制備窄分子量分布?xì)ぞ厶堑淖罴压に嚒?/p>
2.2 三因素二次通用旋轉(zhuǎn)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果分析
表2 三因素二次通用旋轉(zhuǎn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Three elements quadratic current revolving design and results
表3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果的方差分析Table 3 Variance analysis of experimental results
2.2.1 回歸分析及回歸模型的建立 對(duì)實(shí)驗(yàn)所得的結(jié)果采用SAS軟件RSREG過程進(jìn)行多元回歸分析，表3為實(shí)驗(yàn)結(jié)果的方差分析表。由表3可知，該回歸模型的F值為165，大于在0.01水平上的F值，而失擬項(xiàng)的F值為4.41，小于在0.05水平上的F值，說明模型擬合結(jié)果較好;此外由表3可知，回歸方程的一次項(xiàng)均差異極顯著（p＜0.0001)，說明各個(gè)單因素都對(duì)分子量分布值有極顯著影響;二次項(xiàng)中X1、X3對(duì)分子量分布值有極顯著影響，而X2對(duì)分子量分布值有顯著影響，說明三因素對(duì)分子量分布值的影響并不是簡單的線性關(guān)系，但是因素之間的交互作用對(duì)分子量分布值的影響不顯著[11-12]。
以分子量分布指數(shù)為Y值，得出與三種實(shí)驗(yàn)因素的編碼值為自變量的回歸方程。一次回歸模型和二次回歸模型的F值都可以說明模型方程差異極顯著;回歸方程的決定系數(shù)R2=0.9933，失擬項(xiàng)分析表明，該回歸方程無失擬因素存在，回歸模型與實(shí)測(cè)值能較好地?cái)M合，因此可以用該模型分析各工藝參數(shù)對(duì)分子量分布指數(shù)的影響。由該回歸方程偏回歸系數(shù)絕對(duì)值的大小，可以得到各因素影響程度從大到小依次排列為殼聚糖的濃度、溫度和乙酸濃度。
2.2.2 單因素效應(yīng)分析 在單因子效應(yīng)分析中，采用降維分析，將其它的因素固定在零水平，可分別得到各個(gè)單因素對(duì)應(yīng)的回歸方程，從此可以表述單因素變動(dòng)時(shí)對(duì)分子量分布指數(shù)的影響，3個(gè)單因子效應(yīng)方程如下，根據(jù)以上式（1)作圖，可以得到單因子效應(yīng)曲線圖7。
目前研究認(rèn)為，超聲波處理大分子物質(zhì)的主要機(jī)理是機(jī)械性斷鍵作用以及自由基的氧化還原反應(yīng)，部分學(xué)者認(rèn)為機(jī)械效應(yīng)所作用的位點(diǎn)靠近最大分子的中心[13-16]。因此經(jīng)過超聲波處理后，大分子的殼聚糖變成小分子的殼聚糖，殼聚糖的平均分子量降低，而小分子的殼聚糖變化不大，分子量分布指數(shù)也減小。李瑾等研究證明隨反應(yīng)時(shí)間的延長，分子量大的殼聚糖更容易受到降解，其降解速率和降解速率常數(shù)降低較快，而分子量小的殼聚糖具有較低的降解速率和降解速率常數(shù)，隨時(shí)間變化不明顯[17]。
2.2.2.1 溫度的效應(yīng)分析 隨著溫度的升高，殼聚糖的分子量分布指數(shù)先減小后增大，這與單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果相一致。當(dāng)溫度的實(shí)驗(yàn)水平為-0.2680時(shí)，即溫度為26.8℃時(shí)，分子量分布指數(shù)最小。當(dāng)溫度開始升高時(shí)，殼聚糖分子熱運(yùn)動(dòng)加劇，快速變化的機(jī)械運(yùn)動(dòng)足以引起大分子的殼聚糖分子中共價(jià)鍵的斷裂，而導(dǎo)致殼聚糖的降解，分子量分布指數(shù)的降低;同時(shí)溫度升高，溶劑蒸氣壓隨著增大，樣品溶液內(nèi)部的氣體流失，超聲空化作用產(chǎn)生的空泡爆裂強(qiáng)度較低，所釋放出的能量也就較低，產(chǎn)生的自由基也少，因此由自由基氧化還原反應(yīng)引起的殼聚糖的降解速率降低，分子量分布指數(shù)升高。從圖7可以看出，在溫度低于26.8℃時(shí)，分子量分布指數(shù)隨溫度的升高而降低趨勢(shì)并不明顯，而當(dāng)溫度高于26.8℃時(shí)，超聲降解作用隨著溫度的升高而升高的趨勢(shì)非常顯著。這也說明了，殼聚糖的降解是機(jī)械效應(yīng)與自由基的氧化還原反應(yīng)的共同作用的結(jié)果。
圖7 單因子效應(yīng)曲線Fig.7 Single factor utility curves
2.2.2.2 殼聚糖濃度的效應(yīng)分析 濃度對(duì)分子量分布指數(shù)的影響接近線性關(guān)系，從圖7可以看出，分子量分布指數(shù)隨著體系中殼聚糖濃度的增大而增大。這與Chen Rong Huei等的研究結(jié)果一致[7]。殼聚糖溶液濃度較大時(shí)，在相同的超聲功率下，分子鏈所接受的切點(diǎn)少，分子量變化幅度小，而濃度低時(shí)分子鏈所接受的切點(diǎn)多，分子量下降幅度大，殼聚糖降解速度快。同時(shí)殼聚糖濃度低時(shí)，溶液粘度也低，有利于空化泡的發(fā)生，從而使降解反應(yīng)容易進(jìn)行。
2.2.2.3 乙酸濃度的效應(yīng)分析 乙酸濃度分子量分布指數(shù)的影響是二次關(guān)系，從圖7可以看出，隨著乙酸濃度的增加，殼聚糖的分子量分布指數(shù)是先減小后增大，這與單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果相一致。當(dāng)乙酸濃度的實(shí)驗(yàn)水平為-0.3341時(shí)，即乙酸濃度為0.26mol/L時(shí)，分子量分布指數(shù)最小。Trzcinski等用低功率超聲發(fā)生器降解殼聚糖時(shí)發(fā)現(xiàn)，動(dòng)力學(xué)降解速率參數(shù)k隨著乙酸濃度的增加而增加，表明超聲能夠加速殼聚糖酸性水解[15]。因?yàn)樗嵝运馐菬o規(guī)律的，因此這也說明了隨著乙酸濃度的增加，分子量分布指數(shù)升高的原因。
將各模型分別固定2個(gè)因素于0水平，可以得到剩下1個(gè)因素與分子量分布指數(shù)的一元降維的回歸模型，得到單因子邊際效應(yīng)方程。單因子邊際效應(yīng)方程反映了分子量分布指數(shù)隨不同因子編碼值的變化速率。單因子效應(yīng)方程如下：
圖8 邊際效應(yīng)曲線Fig.8 Marginal utility curves
根據(jù)單因子邊際效應(yīng)方程可以作出單因子邊際效應(yīng)曲線。由圖8可知，隨著因素水平的提高，X1、X2、X3的邊際得率都呈上升趨勢(shì)。3條單因子邊際效應(yīng)曲線中，超聲溫度對(duì)應(yīng)的斜率最大，其次是乙酸濃度，最小的是殼聚糖濃度對(duì)應(yīng)的斜率，這說明殼聚糖濃度的變化對(duì)分子量分布的邊際得率的影響較其他兩個(gè)因素穩(wěn)定。當(dāng)X1、X3的水平分別取-0.2680、-0.3341時(shí)，X1、X3的邊際得率均為0，此時(shí)無減小效應(yīng)，2個(gè)因素在該水平對(duì)應(yīng)的分子量分布指數(shù)達(dá)到最小值，繼續(xù)提高因素水平，邊際得率為正值，分子量分布指數(shù)開始增大。
2.3 最佳工藝參數(shù)的確定及回歸模型的驗(yàn)證
表4 回歸模型驗(yàn)證和結(jié)果比較Table 4 Validation of regression model and result comparison
由SAS軟件RSREG過程結(jié)果可知，當(dāng)溫度、乙酸濃度分別為24℃、0.27mol/L（相當(dāng)于1.6%)時(shí)，殼聚糖濃度是越小越好，此時(shí)能取得分子量分布指數(shù)的最小值。殼聚糖濃度很低，每次的處理量太小，在實(shí)際操作中選擇殼聚糖濃度為1%左右較適宜。理論值與實(shí)際值經(jīng)驗(yàn)證誤差為1.7%，所以該模型較好地反映了各因素對(duì)分子量分布指數(shù)的影響。如圖9所示，經(jīng)過超聲波處理后殼聚糖分子量分布變窄了，分子量分布指數(shù)從11.51降到了4.25。
超聲波處理后的殼聚糖的脫乙酰度基本沒有改變，這與王偉、Baxter等人的研究結(jié)果一致[9，14]，這表明超聲波作用于殼聚糖時(shí)，對(duì)殼聚糖分子內(nèi)存在的四種不同的糖苷鍵連接方式不存在特異性識(shí)別能力，所以不會(huì)選擇性地切斷殼聚糖分子的糖苷鍵，使得降解產(chǎn)物的脫乙酰度與殼聚糖原料相比沒有改變。
圖9 殼聚糖的分子量分布Fig.9 Molecular weight distribution of chitosan
3 結(jié)論
對(duì)超聲波處理后殼聚糖分子量分布指數(shù)的影響因素由大到小依次順序是殼聚糖濃度、溫度、乙酸濃度。采用三因素二次通用旋轉(zhuǎn)設(shè)計(jì)，建立了溫度、殼聚糖濃度和乙酸濃度3個(gè)因素對(duì)應(yīng)的分子量分布指數(shù)的數(shù)學(xué)模型，實(shí)現(xiàn)了對(duì)工藝的優(yōu)化，得出最佳工藝參數(shù)：溫度為24℃、乙酸濃度為0.27mol/L、殼聚糖濃度根據(jù)實(shí)際需要定為1%，各個(gè)因素對(duì)分子量分布指數(shù)的影響由大到小依次順序是殼聚糖濃度、溫度、乙酸濃度。經(jīng)過化學(xué)方法提取出來的殼聚糖一般分子量分布很寬，但是經(jīng)過超聲波處理后分子量分布變窄了，分子量分布系數(shù)從11.51降到了4.25。
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Study on preparing technique of chitosan with narrow molecular weight distribution
LI Xing-ke1，ZONG Wei1，XIA Wen-shui2，*
（1.Department of Food&Biological Engineering，Zhengzhou University of Light Industry，Zhengzhou 450002，China;2.School of Food Science and Technology，Jiangnan University，Wuxi 214122，China)
Preparing technique of chitosan with narrow molecular weight distribution through ultrasonic processed was investigated.According to the rotary unitized design principles，the influence of temperature and the concentration of chitosan and acetic acid on the polydispersity of chitosan after ultrasonic process were studied and the mathematical model was established based on the basis of single factor experiments.The preparation conditions of chitosan with narrow polydispersity were obtained by variance analysis and the optimization of mathematical model.Results showed that the optimum conditions of ultrasonic process were that the temperature of 24℃，the concentration of acetic acid of 0.27mol/L and the concentration of chitosan of 1%according to the actual situation.The polydispersity of chitosan decreased from 11.51 to 4.25 after ultrasonic processed.
chitosan;ultrasonic process;polydispersity;optimization
TS201.1
B
1002-0306（2012)14-0255-05
2011－11－29 *通訊聯(lián)系人
李星科（1981-)，男，講師，博士，研究方向：多糖化學(xué)。
國家863計(jì)劃項(xiàng)目（2007AA100401);重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室目標(biāo)導(dǎo)向項(xiàng)目（SKLF-MB-200805);江蘇省科技成果轉(zhuǎn)化項(xiàng)目（BA2009082)。
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