蔡晶晶 陳永衛(wèi) 張建敏*

(1.首都醫(yī)科大學附屬北京兒童醫(yī)院麻醉科，北京 100045;2.首都醫(yī)科大學附屬北京兒童醫(yī)院外科，北京 100045)

先天性膈疝(congenital diaphragmatic hernia，CDH)是由于膈肌發(fā)育缺損或發(fā)育不全，腹腔臟器經(jīng)過這些缺損進入胸腔的一種疾病，不僅造成同側肺臟發(fā)育不良，同時也引起對側肺臟的發(fā)育和功能異常，活產(chǎn)患兒中發(fā)病率約為 1∶2 000－3 000［1］。對于一些出生后已存在嚴重肺臟發(fā)育不良的患兒，手術治療仍很難存活。因此，有關研究人員希望拓寬該病的治療方向，通過產(chǎn)前干預促進肺臟發(fā)育［2］，為臨床治療提供新的思路。

目前，這一新思路的研究還集中在動物實驗階段。此前已有一些研究［3］顯示，先天性膈疝的肺臟發(fā)育不良與細胞內(nèi)的氧化反應有關，因此本研究通過建立先天性膈疝模型，應用具有抗氧化性質的維生素C作為產(chǎn)前干預藥物，研究其對胎鼠肺臟發(fā)育的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗對象

1)孕鼠:S－D雌鼠12只〔生產(chǎn)許可證號:SCXK(京)2005－0006，使用許可證號:SYXK(京)2005－0022〕，體質量250 g左右，初次妊娠，采用抽簽法隨機分為對照組(C)、維生素C組(W)膈疝組(N)及治療組(T)。

2)胎鼠:正常孕期為22 d，孕21 d時相同麻醉方法下剖腹取出胎鼠(對照組29只，維生素C組26只，膈疝組32只，治療組30只)。

3)肺臟標本:取出稱質量后立即投入Bouin液中固定。

1.2 實驗方法

1)體質量250 g左右的S－D雌鼠，夜間合籠交配，次日晨檢查，以見到孕栓記為妊娠第0天。

2)妊娠9.5 d時，對照組及維生素C組予1 mL食用油灌胃;膈疝組及治療組予100 mg除草醚(NITROFEN——2，4－二 氯 苯 基－P－硝 基 苯 醚，Sigma 公司);溶于1 mL食用油中灌胃。

3)妊娠16.5～20.5 d時，對照組及膈疝組每日腹腔注射1 mL 0.9%氯化鈉注射液，連續(xù)5 d;維生素C組及治療組每日腹腔注射1.5 mg維生素C(溶于1 mL 0.9%氯化鈉注射液中)，連續(xù)5 d。

4)為避免同類相食，于孕21 d時水合氯醛(300 mg/kg)腹腔注射麻醉孕鼠，剖腹取出胎鼠，分別記錄3組胎鼠的體質量，檢查各組胎鼠的膈疝發(fā)生率、發(fā)生部位及膈肌缺損程度。將胎鼠的肺臟取出稱質量。

5)取出肺臟標本在Bouin液中固定24 h，制備石蠟切片，免疫組織化學技術顯示ki－67的表達。試劑盒購自中杉公司，烤片后脫蠟入水，滅活內(nèi)源性過氧化物酶，抗原修復，標記一抗(經(jīng)預實驗確定抗體稀釋濃度為1∶200)、二抗，DBS顯色，蘇木精復染，脫水透明，加拿大樹膠封片。細胞核顯棕黃色者為增生的陽性細胞。每組采用抽簽法隨機選取2張切片，每張切片計算機隨機選取6個高倍(×40)視野記錄圖像并保存(LEICAQWin，LEICA Q5501W，顯微鏡 DM LB2)。雙人雙盲法計算每個視野的陽性細胞比例。

1.3 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 11.5統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)處理，計量數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差(±s)表示，行單因素方差分析及均數(shù)兩兩比較，計數(shù)數(shù)據(jù)用例數(shù)表示，行χ2檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 膈疝發(fā)生率

對照組及維生素C組胎鼠中無膈疝發(fā)生;膈疝組與治療組的膈疝發(fā)生率分別為53.13%和46.67%，兩組差異無統(tǒng)計學意義，詳見表1。

表1 膈疝發(fā)生情況Tab.1 Incidences of CDH (%)

2.2 胎鼠平均體質量

治療組胎鼠平均體質量高于另3組，結果差異有統(tǒng)計學意義，另3組組間差異無統(tǒng)計學意義(表2)。

2.3 平均胎肺質量

維生素C組及治療組的平均胎肺質量均高于對照組，對照組高于膈疝組，結果差異有統(tǒng)計學意義，詳見表2。

表2 各組胎鼠平均體質量、肺臟質量及增生細胞比例Tab.2 Mean body weight，lung weight and percentage of proliferation cells of fetal rat for each group

2.4 增生細胞比例

膈疝組增生細胞比例低于另3組，結果差異存在統(tǒng)計學意義，3組組間差異無統(tǒng)計學意義，詳見表2。

低倍視野(10×)下觀察4組胎鼠肺臟組織形態(tài)，細胞核顯棕黃色者為增生的陽性細胞(圖1)。

高倍視野(40×)下計算各組增生細胞比例，結果膈疝組增生細胞比例低于另3組(圖2)。

圖1 免疫組織化學技術顯示胎鼠肺組織ki-67的表達Fig.1 Immunohistochemical stain(Ki-67)of fetal lung(10×)

3 討論

Nitrofen最初曾被用作除草劑，又稱除草醚，在發(fā)現(xiàn)其有致膈疝畸形的作用后被淘汰。但這一發(fā)現(xiàn)卻為膈疝的研究者們所利用，作為建立膈疝模型的藥物。根據(jù)早期研究［4］，除草醚的致畸機制主要在于其化學結構與甲狀腺素(T4)極為相似，因此推斷除草醚可能是通過競爭T4受體，取代或部分取代母鼠和胎鼠T4的作用，從而導致肺臟等臟器發(fā)育不良。

雖然肺臟的發(fā)育不良與疝入臟器的機械壓迫有關，但動物CDH模型研究［5］顯示:某些與肺臟發(fā)育分化有關的蛋白因子、染色體以及基因的表達也出現(xiàn)異常。Beckman D L等［6］在研究中將暴露了除草醚但沒有發(fā)生CDH的標本也統(tǒng)計在內(nèi)，結果發(fā)現(xiàn)即使在沒有CDH的情況下，肺功能也顯著降低;賈煒等［7］對除草醚誘導的大鼠CDH模型進行了研究，結論是:無論是否發(fā)生了CDH，肺泡面積與對照組相比均顯著減少，肺泡間隔也都顯著增厚。由此提出，存在原發(fā)肺臟發(fā)育不良的可能。所以在本次實驗中，將膈疝組及治療組中未發(fā)生膈肌缺損的數(shù)據(jù)也一并統(tǒng)計在內(nèi)進行了分析，無論是肺臟質量還是細胞增生方面，所得到的結果與發(fā)生膈疝組基本相同，支持了上述肺臟存在原發(fā)發(fā)育不良的觀點。

現(xiàn)階段膈疝產(chǎn)前診斷的主要方法為B超，歐洲的產(chǎn)前診斷率達 59%，平均診斷時間為 24.2 周［8－9］，國內(nèi)的診斷時間基本在孕晚期——所以，本次實驗將給藥時間確定為孕晚期，希望對臨床工作起到一定的幫助作用。

圖2 免疫組織化學技術顯示胎鼠肺組織ki-67的表達Fig.2 Immunohistochemical stain(Ki-67)of fetal lung(40×)

維生素C作為眾所周知的抗氧化劑，具有獲取方便、價格便宜等優(yōu)勢，因此，本次實驗選取維生素C作為干預因素，實驗結果是孕晚期維生素C的干預沒有明顯改變胎鼠先天性膈疝的發(fā)生率。由于正常膈關閉的時間是孕17 d，膈肌缺損及臟器疝入有可能在此前已經(jīng)發(fā)生，而本次實驗維生素C的干預時間為孕16.5～20.5 d，因此考慮給藥時間較晚可能是影響維生素C作用的原因之一。由于此前相似方法的研究結論較少，可用來比較的結果有限，維生素C對于膈疝發(fā)生率及胎肺發(fā)育的作用究竟如何還有待今后更多大樣本實驗的證實。

［1］B?senberg A T，Brown R A.Management of congenital diaphragmatic hernia［J］.Curr Opin Anaesthesiol，2008，21(3):323－331.

［2］Kitano Y.Prenatal intervention for congenital diaphragmatic hernia［J］.Semin Pediatr Surg，2007，16(2):101－108.

［3］Kinane T B.Lung development and implications for hypoplasia found in congenital diaphragmatic hernia［J］.Am J Med Genet C Semin Med Genet，2007，145c(2):117－124.

［4］Yoshimura S，Masuzaki M K，Miura K，et al.Effect of epidermal growth factor on lung growth in experimental fetal pulmonary hypoplasia［J］.Early Hum Dev，2000，57(1):61－69.

［5］Muehlethaler V，Kunig A M，Seedorf G，et al.Impaired VEGF and nitric oxide signaling after nitrofen exposure in rat fetal lung explants［J］.Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol，2008，294(1):L110－L120.

［6］Beckman D L，Cummings J J，Katwa L C，et al.Can maternal vitamin C supplementation prevent lung hypoplasia in the nitrofen－induced rat model of congenital diaphragmatic hernia?［J］.Pediatr Res，2005，57(3):392－395.

［7］賈煒，余家康，鄒焱，等.成纖維細胞生長因子－7在除草醚誘導的先天性膈疝大鼠模型胎肺中的表達［J］.中華小兒外科雜志，2006，27(10):541－544.

［8］Gallot D，Boda C，Ughetto S，et al.Prenatal detection and outcome of congenital diaphragmatic hernia:a French registry－based study［J］.Ultrasound Obstet Gynecol，2007，29(3):276－283.

［9］Daskalakis G，Anastasakis E，Souka A，et al.First trimester ultrasound diagnosis of congenital diaphragmatic hernia［J］.J Obstet Gynaecol Res，2007，33(6):870－872.