韓道財(cái)，楊 萍，洪鵬志

（廣東海洋大學(xué)食品科技學(xué)院，廣東湛江 524088）

三氯乙酸沉淀羅非魚(yú)肉蛋白酶解液的液相色譜分析

韓道財(cái)，楊 萍*，洪鵬志

（廣東海洋大學(xué)食品科技學(xué)院，廣東湛江 524088）

用不同濃度三氯乙酸（TCA）溶液沉淀羅非魚(yú)肉Alcalase 2.4L酶解液，采用高效體積排阻色譜法對(duì)酶解液及沉淀后所得上清液的分子量分布進(jìn)行分析，研究TCA對(duì)酶解液中蛋白或肽的沉淀效果。結(jié)果表明，1、2、5h酶解液的不同分子量肽段在1%、3%、5%、7%、10%TCA中都有沉淀作用，大于9.5ku組分的沉淀百分比在47.86%～59.28%之間，2.5～1.4ku的在38.41%～65.49%之間，1.0ku的在21.32%～78.89%之間。隨TCA濃度的增加，沉淀百分比增加或減少。

三氯乙酸，沉淀，酶解液，肽

在生物化學(xué)、食品科學(xué)及其他研究領(lǐng)域中，人們經(jīng)常用到蛋白或多肽的沉淀劑，其中三氯乙酸（trichloroacetic acid，TCA）應(yīng)用最為廣泛?？茖W(xué)研究中，不同濃度的TCA經(jīng)常被用來(lái)從蛋白中分離出肽，并且一般認(rèn)為T(mén)CA濃度越高，能夠溶解在TCA溶液中的肽的量就越少。三氯乙酸對(duì)蛋白的沉淀主要?dú)w功于三個(gè)氯原子的獨(dú)特作用[1]。有報(bào)道[2]認(rèn)為，當(dāng)多肽的氨基酸殘基數(shù)為10時(shí)，在質(zhì)量分?jǐn)?shù)為13.6%的TCA溶液中溶解度大約為40%。Greenberg[3]等認(rèn)為，在10%的TCA溶液中能夠溶解的肽段的平均分子量在330～380u之間。多年來(lái)，利用酶工程技術(shù)制備生物活性肽的研究越來(lái)越多[4－6]，其中，肽含量的測(cè)定是一個(gè)必需的手段[6－9]。肽含量的測(cè)定方法之一是將其中的大分子蛋白或多肽用三氯乙酸沉淀掉，然后對(duì)上清液中肽的含量進(jìn)行測(cè)定[6－7]。然而，關(guān)于三氯乙酸沉淀蛋白酶解液特性的研究報(bào)道很少。本文采用不同濃度TCA溶液沉淀羅非魚(yú)肉的A lcalase 2.4L酶解液，通過(guò)高效體積排阻色譜分析來(lái)考察酶解液中不同分子量組分在TCA溶液中的沉淀情況，旨在對(duì)三氯乙酸沉淀多肽的效果進(jìn)行探討。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

奧尼羅非魚(yú) 購(gòu)于廣東湛江霞山水產(chǎn)品市場(chǎng)，將羅非魚(yú)去頭、去鱗、去鰭、去內(nèi)臟，洗凈，于采肉機(jī)中采肉，－18℃凍藏；A lcalase 2.4L（2.4AU/g） 諾維信公司；TCA、Tris 分析純，天津市大茂化學(xué)試劑廠；其余試劑 均為分析純。

DK－98－1型電熱恒溫水浴鍋 天津市泰斯特儀器有限公司；JJ－1精密增力電動(dòng)攪拌器 常州澳華儀器有限公司；XW－80A漩渦混合器 海門(mén)市其林貝爾儀器制造有限公司；CR22GⅡ高速冷凍離心機(jī) 日本日立公司；UV－8000紫外分光光度計(jì) 上海元析儀器有限公司；Waters 600半制備高效液相色譜（Waters 600E泵，Waters 2487雙波長(zhǎng)紫外檢測(cè)器） 美國(guó)Waters公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 酶解液的制備 取鮮凍魚(yú)肉30g勻漿打碎后置于燒杯中，按1∶1（W∶V）比例加水，于55℃恒溫水浴鍋中預(yù)熱30m in，按740u/g魚(yú)肉加入A lcalase 2.4L酶，自然pH下分別酶解1、2、5h。沸水滅酶10min，8000r/min離心20m in，得酶解液。

1.2.2 TCA溶液的配制 2%TCA溶液的配制：稱取2.00g TCA晶體，于100m L容量瓶中定容。同樣的方法配制6%、10%、14%、20%的TCA溶液。

1.2.3 TCA沉淀上清液的制備 取酶解液5m L與等體積TCA溶液混合，漩渦混合20s，靜置10m in，4℃、8000r/min離心15min。將上清液轉(zhuǎn)移，定容至50m L，以下簡(jiǎn)稱上清液。

1.2.4 水解度的測(cè)定 電位滴定法[10]。

1.2.5 色譜條件 色譜柱：Waters Protein－Pak 60柱（7.8mm×300mm，球形10μm）；柱溫：25℃；流動(dòng)相：Tris－HCl緩沖液（pH7.2，50mmol/L），等度洗脫0.7m L/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：214nm；進(jìn)樣量：10μL。

1.2.6 分子量標(biāo)準(zhǔn)曲線 所用標(biāo)準(zhǔn)品為：Triosephosphate isomerase（磷酸丙糖異構(gòu)酶）、Myoglobin（肌紅蛋白）、Aprotinin（抑肽酶）、Oxidized insulin b chain（胰島素B鏈）、Bacitracin（桿菌肽）、HHL（馬尿酰組氨酰亮氨酸）。

回歸方程為：LgM=－0.1992x+6.3107（R2=0.9751）。

式中：M－分子量，u；x－保留時(shí)間，m in。

2 結(jié)果與分析

2.1 酶解液的水解度

由表1可知，隨時(shí)間的增加，被裂解的肽鍵數(shù)越來(lái)越多，1h和2h水解度差別不大，到5h時(shí)水解度增加較多。

表1 酶解液的水解度Table 1 DH of hydrolysate

2.2 不同濃度TCA沉淀上清液的液相色譜圖比較

圖1A為1%TCA溶液稀釋10倍后的高效液相色譜圖?？梢钥闯?，TCA在214nm波長(zhǎng)下具有很強(qiáng)的吸收，其保留時(shí)間為12.36m in。圖1B～圖1G為1h酶解液及其1%、3%、5%、7%、10%TCA沉淀上清液10倍稀釋后的液相色譜圖。由圖可知，TCA吸收峰的大小隨濃度的增大而增大。上清液色譜圖中第四峰的出峰時(shí)間從圖1C～圖1G依次為12.425、12.367、12.336、12.371、12.323m in，即為T(mén)CA峰，其峰面積太大導(dǎo)致其后的2個(gè)峰被淹沒(méi)，TCA濃度越大，這種現(xiàn)象越嚴(yán)重。實(shí)驗(yàn)中沒(méi)有將上清液中的TCA除掉，因而圖1C～圖1G中TCA峰之后的2個(gè)或3個(gè)峰的峰面積無(wú)法與圖1B比較。除此之外，圖1B～圖1G中其他相應(yīng)峰的保留時(shí)間基本一致，這說(shuō)明TCA沉淀并未對(duì)酶解液中蛋白或肽的分子量造成影響。表2對(duì)1h酶解液中各峰的保留時(shí)間、分子量和峰面積進(jìn)行了匯總，同時(shí)匯總了上清液色譜圖中峰與酶解液色譜圖中對(duì)應(yīng)峰的峰面積百分?jǐn)?shù)。2h及5h酶解液、上清液色譜圖未給出，表3和表4對(duì)其結(jié)果進(jìn)行了描述。

圖1 1h酶解液及其不同濃度TCA沉淀上清液的液相色譜圖Fig.1 Liquid chromatogram of 1h hydrolysate and its supernatant precipitated by different concentration TCA

由表2～表4可以看出，1h、2h及5h酶解液的峰面積總和是增加的，5h酶解液峰面積總和是1h、2h酶解液的1.2及1.1倍。隨著酶解反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)，大分子肽段所占比例減少，小分子肽段所占比增加。酶解液中含量較高的均是9.5ku和2.5ku的肽，1h、2h和5h酶解液中大于9.5ku的分別占22.29%、19.00%及17.89%，小于2.5ku的分別各占7.11%、8.14%及24.03%，3～5.5ku部分約分別為70.60%、72.86%和58.08%，1.5ku以下肽的比例分別是7.10%、8.14%和10.48%。這反映了酶解的進(jìn)程，也與酶及底物的性質(zhì)有關(guān)。

由表2～表4可以看出，1%、3%、5%、7%、10%TCA對(duì)1h、2h及5h酶解液中不同分子量組分都有沉淀作用，19ku與9.5ku的沉淀百分比隨TCA濃度的增加而升高，約在52%～59%與57%～63%之間；1.5ku的沉淀百分比隨TCA濃度的增加而略有下降，約為65%～38%之間；2.5～2.6ku的沉淀百分比隨TCA濃度的增加先增加后略下降，在46%～58%之間；而2.5～1.4ku的沉淀百分比隨TCA濃度的增加而下降，在65%～38%之間；1.0ku的沉淀百分比隨TCA濃度的增加而下降，在78%～21%之間。可見(jiàn)，不同分子量組分在1%、3%、5%、7%、10%TCA中都有沉淀作用，而且，對(duì)不同分子量組分來(lái)說(shuō)，并不一定有隨TCA濃度的增加沉淀百分比也增加的結(jié)果，相反地，TCA濃度大于5%，隨TCA濃度的增加，沉淀百分比呈現(xiàn)減少的趨勢(shì)。值得注意的是，相比于1h酶解液，1%、3%、5%、7%、10%TCA對(duì)2h及5h酶解液中1.5ku以下肽的沉淀百分比要高得多，最高達(dá)到78%，這也是不同分子量組分中的最高沉淀率。

Mireille[11]等在研究不同長(zhǎng)度的肽與其在TCA中的溶解性時(shí)發(fā)現(xiàn)，在12%的TCA中可以溶解的肽的殘基數(shù)在2～20之間，不溶的則在10～65之間；在研究不同的肽在TCA中溶解特性時(shí)發(fā)現(xiàn)，39種肽在各種TCA濃度中均可溶，有6種肽在各種TCA濃度中均不可溶，30種肽的溶解性隨TCA濃度的增加而下降。

Sivaraman[1]在研究不同蛋白在不同TCA中的沉淀時(shí)，發(fā)現(xiàn)所研究的蛋白在TCA中的溶解特性是隨TCA濃度由小到大呈U型曲線，TCA濃度增加到50%時(shí)，沉淀的蛋白又開(kāi)始重新溶解。

可見(jiàn)，蛋白或肽在TCA溶液中的沉淀（溶解）特性很復(fù)雜。M ireille[11]等研究認(rèn)為，三氯乙酸對(duì)肽的沉淀作用受到分子量、氨基酸組成、疏水性、肽的濃度及三氯乙酸濃度等方面的影響。

3 結(jié)論與討論

結(jié)果表明，1%、3%、5%、7%、10%TCA對(duì)羅非魚(yú)肉A lcalase 2.4L的1h、2h及5h酶解液中不同分子量組分都有沉淀作用，9.5ku以上組分的沉淀百分比在47.86%～59.28%之間，2.5～1.4ku的在38.41%～65.49%之間，1.0ku的在21.32%～78.89%之間；TCA濃度大于5%，隨TCA濃度增加，沉淀百分比大多呈現(xiàn)減少的趨勢(shì)。TCA對(duì)其他蛋白酶解液的沉淀情況如何有待進(jìn)一步的研究。采用三氯乙酸沉淀蛋白酶解液中的大分子肽段，然后測(cè)定上清液中肽的含量定義為短肽的方法，其準(zhǔn)確性也有待深入研究。

表2 1h酶解液與其TCA沉淀上清液峰面積比較Table 2 Peak area compare of 1h hydrolysate to its supernatants precipitated by TCA

表3 2h酶解液與其TCA沉淀上清液峰面積比較Table 3 Peak area compare of 2h hydrolysate to its supernatants precipitated by TCA

表4 5h酶解液與其TCA沉淀上清液峰面積比較Table 4 Peak area compare of 5h hydrolysate to its supernatants precipitated by TCA

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Study on precipitating action of enzymatic hydrolysate of tilapia flesh protein by trichloroacetic acid through HPLC

HAN Dao-cai，YANG Ping*，HONG Peng-zhi
（Food Science and Technology College of Guangdong Ocean University，Zhanjiang 524088，China）

In order to research the effectof TCA p recipitating to p roteins or pep tides in the enzymatic hyd rolysates of tilap ia flesh，the molecular weight d istributions of hyd rolysates by Alcalase 2.4L and the supernatants of hyd rolysates p recip itating by TCA in different concentrations were studied by HPLC.The results ind icated that various pep tides com ing from 1，2，5h hyd roltsate were p recip itated to varying deg rees in 1%，3%，5%，7%，and 10%TCA，while 47.86%～59.28%of the＞9.5ku，38.41%～65.49%of the 2.5～1.4ku，and 21.32%～78.89%of the 1.0ku removed.The p recipitating percentage rised or fellw ith the inereasing of TCA concentrations.

TCA；p recipitating action；enzymatic hyd rolysate；pep tide

TS201.2

A

1002－0306（2012）09－0092－04

2011－08－11 *通訊聯(lián)系人

韓道財(cái)（1988－），男，在讀碩士研究生，研究方向：水產(chǎn)品高值化加工與利用。

廣東省粵港關(guān)鍵領(lǐng)域重點(diǎn)突破項(xiàng)目（2009A020700004）；廣東省海洋漁業(yè)科技推廣專項(xiàng)項(xiàng)目（A2009002－01（a））。