馬 龍，周先漢，許 暉

（1.蚌埠學(xué)院生物與食品工程系，安徽蚌埠 233030；2.合肥工業(yè)大學(xué)生物與食品工程學(xué)院，安徽合肥 230009）

大孔樹(shù)脂分離純化杜仲翅果中桃葉珊瑚甙的研究

馬 龍1，周先漢2，許 暉1

（1.蚌埠學(xué)院生物與食品工程系，安徽蚌埠 233030；2.合肥工業(yè)大學(xué)生物與食品工程學(xué)院，安徽合肥 230009）

為獲得較高純度的桃葉珊瑚甙，采用大孔樹(shù)脂吸附法對(duì)杜仲翅果中桃葉珊瑚甙粗提液進(jìn)行純化研究。比較5種大孔吸附樹(shù)脂對(duì)桃葉珊瑚甙的靜態(tài)吸附-解吸效果，從中篩選出適合桃葉珊瑚甙分離純化的樹(shù)脂，并對(duì)其動(dòng)態(tài)吸附和解吸性能進(jìn)行研究。結(jié)果表明：D4020樹(shù)脂最適合桃葉珊瑚甙的純化；當(dāng)上樣液濃度為3mg/mL、pH7、上樣速率2mL/min、上樣液體積40mL時(shí)，樹(shù)脂達(dá)到動(dòng)態(tài)吸附飽和；再用120mL 50%（v/v）乙醇溶液，以2mL/min的流速可以洗脫完全。經(jīng)過(guò)D4020樹(shù)脂的純化，桃葉珊瑚甙精制品純度達(dá)到62.54%。

大孔樹(shù)脂，吸附，純化，杜仲翅果，桃葉珊瑚甙

杜仲（Eucomm ia ulmoides Oilv.）多年生落葉喬木植物，被稱(chēng)為“神奇之樹(shù)”，其神奇之處在于杜仲葉、花、果實(shí)同杜仲皮一樣都含有人體必不可少的藥用活性成分，具有十分獨(dú)特的醫(yī)療保健功能[1]。桃葉珊瑚甙（aucubin）是杜仲中一種含量豐富的生物活性成分，分布于杜仲各部位，研究表明其在杜仲果實(shí)中含量最高[2]。桃葉珊瑚甙為環(huán)烯醚萜甙類(lèi)化合物，具有護(hù)肝解毒、消炎、抗氧化、抗衰老、抗骨質(zhì)疏松及營(yíng)養(yǎng)神經(jīng)元細(xì)胞等眾多藥理活性[3-4]。大孔吸附樹(shù)脂是一類(lèi)不溶于酸、堿及各種有機(jī)溶劑且有較好吸附性能的有機(jī)高聚物吸附劑，大孔樹(shù)脂吸附分離技術(shù)是近些年發(fā)展起來(lái)的一種新型分離純化技術(shù)，具有吸附容量大、吸附速度快、分離效果好、再生簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)，已被廣泛應(yīng)用于植物天然活性成分（如皂苷、黃酮、內(nèi)酯、生物堿等）的分離和純化[5]。本研究以大孔樹(shù)脂吸附法對(duì)杜仲翅果中桃葉珊瑚甙粗提物的純化進(jìn)行探討，旨在為杜仲翅果資源的深度開(kāi)發(fā)利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

杜仲翅果 購(gòu)自陜西省略陽(yáng)縣杜仲開(kāi)發(fā)中心；桃葉珊瑚甙對(duì)照品 購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品鑒定所；桃葉珊瑚甙標(biāo)準(zhǔn)品 購(gòu)自SIGMA公司；Epstahl試劑（對(duì)二甲氨基苯甲醛0.25g，冰醋酸50g，35%磷酸5g，水20m L）、鹽酸、氫氧化鈉等 均為市售，分析純；大孔樹(shù)脂 南開(kāi)大學(xué)化工廠，種類(lèi)和技術(shù)參數(shù)見(jiàn)表1。

AR1140電子天平 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；752紫外可見(jiàn)分光光度計(jì) 上海菁華科技儀器有限公司；20×280mm樹(shù)脂柱 安徽天長(zhǎng)市千秋玻璃儀器廠；BT1－100恒流泵 上海琪特分析儀器有限公司；CT/DW 60E冷凍干燥機(jī) Heto－Holten公司；ACQUITY UPLC－LCT超高效液相色譜－飛行時(shí)間質(zhì)譜聯(lián)用儀 PremierTM XEWaters公司。

表1 大孔樹(shù)脂的技術(shù)參數(shù)Table 1 Characteristic parameter of themacroporous adsorption resin

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 大孔樹(shù)脂預(yù)處理 依照廠家說(shuō)明書(shū)及相關(guān)文獻(xiàn)[6]進(jìn)行處理。

1.2.2 上樣液制備 稱(chēng)取10g杜仲翅果干粉（石油醚脫脂脫膠處理，60℃烘干至恒重）置于圓底燒瓶中，加入120m L 72%（v/v）乙醇溶液，在超聲波萃取器中以300W功率提取21m in，抽濾，減壓濃縮，加水轉(zhuǎn)溶，以4000r/m in轉(zhuǎn)速離心10m in去除雜質(zhì)，上清液即為上樣液。

1.2.3 靜態(tài)吸附－解吸實(shí)驗(yàn)

1.2.3.1 靜態(tài)吸附實(shí)驗(yàn) 稱(chēng)取經(jīng)預(yù)處理并吸干表面水分的不同型號(hào)濕樹(shù)脂2g置于磨口錐形瓶中，精密加入過(guò)量已知濃度的桃葉珊瑚甙提取液，搖勻，密封，于4℃冰箱中放置24h[7]，進(jìn)行吸附，吸取上清液，測(cè)定桃葉珊瑚甙濃度，計(jì)算出各型號(hào)樹(shù)脂對(duì)桃葉珊瑚甙的最大吸附容量，計(jì)算公式如下：

式中，C0為吸附前提取液中桃葉珊瑚甙濃度（mg/m L）；C1吸附平衡時(shí)提取液中桃葉珊瑚甙濃度（mg/m L）；V1為提取液體積（m L）；W為濕樹(shù)脂質(zhì)量（g）。

1.2.3.2 靜態(tài)解吸實(shí)驗(yàn) 分別將上述充分吸附了桃葉珊瑚甙的樹(shù)脂進(jìn)行過(guò)濾，再各加入70%（v/v）的乙醇溶液50m L，密封，于4℃冰箱中放置24h，進(jìn)行解吸，吸取解吸液，測(cè)定桃葉珊瑚甙的濃度，計(jì)算出各型號(hào)樹(shù)脂對(duì)桃葉珊瑚甙的解吸率，計(jì)算公式如下：

式中，C0為吸附前提取液中桃葉珊瑚甙濃度（mg/m L）；C1吸附平衡時(shí)提取液中桃葉珊瑚甙濃度（mg/m L）；C2解析后解析液中桃葉珊瑚甙濃度（mg/m L）；V1為提取液體積（m L）；V2為解吸液體積（m L）。

1.2.4 動(dòng)態(tài)吸附－解吸實(shí)驗(yàn)

1.2.4.1 動(dòng)態(tài)吸附實(shí)驗(yàn) 量取經(jīng)預(yù)處理樹(shù)脂20m L濕法裝柱，吸取濃度4.57mg/m L的桃葉珊瑚甙粗提液上樣，pH為5.3（原液pH），以2m L/m in的流速通過(guò)樹(shù)脂柱，分部收集流出液（每管收集1BV），測(cè)定其中桃葉珊瑚甙濃度，繪制泄漏曲線，確定上樣液用量。

濕法裝柱，吸取5份40m L濃度4.57mg/m L的桃葉珊瑚甙粗提液，分別稀釋至0.5、1、2、3、4mg/m L上樣，pH為5.3（原液pH），流速2m L/min，用80m L蒸餾水水洗，混合液定容至250m L，測(cè)定桃葉珊瑚甙濃度，計(jì)算吸附率，考察不同上樣液濃度對(duì)吸附效果的影響。

濕法裝柱，吸取5份60m L濃度3mg/m L的桃葉珊瑚甙粗提液，pH為5.3（原液pH），分別以流速1、2、3、4、5m L/m in上樣，用80m L蒸餾水水洗，混合液定容至250m L，測(cè)定桃葉珊瑚甙濃度，計(jì)算吸附率，考察不同上樣速率對(duì)吸附效果的影響。

濕法裝柱，吸取5份60m L濃度3mg/m L的桃葉珊瑚甙粗提液，分別調(diào)節(jié)pH至3、4、5、6、7、8上樣，流速2m L/m in，用80m L蒸餾水水洗，混合液定容至250m L，測(cè)定桃葉珊瑚甙濃度，計(jì)算吸附率，考察不同上樣液pH對(duì)吸附效果的影響。

式中，C1－上樣液中桃葉珊瑚甙濃度（mg/m L）；C2－混合液中桃葉珊瑚甙濃度（mg/m L）；V1－為上樣液體積（m L）；V2－為混合液體積（m L）。

1.2.4.2 動(dòng)態(tài)解吸實(shí)驗(yàn) 取按最佳動(dòng)態(tài)吸附條件吸附的樹(shù)脂柱，用70%（v/v）的乙醇溶液以流速2m L/m in洗脫，分部收集洗脫液（每管收集1BV），測(cè)定其中桃葉珊瑚甙濃度，繪制洗脫曲線，確定洗脫劑液體用量。

取完成吸附的樹(shù)脂柱，用濃度分別為40%、50%、60%、70%、80%（v/v）的乙醇溶液各120m L以流速2m L/m in洗脫，洗脫液定容至250m L，測(cè)定桃葉珊瑚甙濃度，計(jì)算洗脫率，考察不同洗脫劑濃度對(duì)解吸效果的影響。

取完成吸附的樹(shù)脂柱，用50%（v/v）的乙醇溶液120m L分別以流速1、2、3、4、5m L/m in洗脫，洗脫液定容至250m L，測(cè)定桃葉珊瑚甙濃度，計(jì)算洗脫率，考察不同洗脫速率對(duì)解吸效果的影響。

式中，C1－上樣液中桃葉珊瑚甙濃度（mg/m L）；C2－混合液中桃葉珊瑚甙濃度（mg/m L）；C3－洗脫液中桃葉珊瑚甙濃度（mg/m L）；V1－為上樣液體積（m L）；V2－為混合液體積（m L）；V3－為洗脫液體積（m L）。

1.2.5 桃葉珊瑚甙含量測(cè)定 參考文獻(xiàn)[8]采用“對(duì)二甲氨基苯甲醛法”。

1.2.6 桃葉珊瑚甙定性分析 使用超高效液相色譜－飛行時(shí)間質(zhì)譜聯(lián)用儀以桃葉珊瑚甙標(biāo)準(zhǔn)品（SIGMA公司）定性。

1.2.6.1 色譜條件 色譜柱：ACQUITY UPLC BEH Shield RP18（100×2.1mm，1.7μm）；檢測(cè)器：質(zhì)譜檢測(cè)器；流動(dòng)相：乙腈∶水（10mmol/L乙酸銨+0.1%氨水）= 10∶90；柱溫：40℃；樣品室溫度：10℃；流速：0.3m L/m in；進(jìn)樣體積：1μL。

1.2.6.2 質(zhì)譜條件 離子源：ESI；掃描方式：負(fù)離子V模式；掃描范圍：m/z100～1000；毛細(xì)管電壓：2500kV；錐孔電壓：10V；毛細(xì)管溫度：350℃；源溫度：110℃；干燥氣流速：600L/h；輔助氣流速：40L/h。

1.2.7 精制品純度計(jì)算 洗脫液旋蒸濃縮后冷凍干燥至恒重得桃葉珊瑚甙精制品，準(zhǔn)確稱(chēng)取一定質(zhì)量（m1）樣品，用適量甲醇溶解定容后按1.2.5方法測(cè)定桃葉珊瑚甙含量（m2），計(jì)算樣品純度：

純度（%）=m1/m2×100%

2 結(jié)果與討論

2.1 大孔樹(shù)脂對(duì)桃葉珊瑚甙的靜態(tài)吸附和解吸效果

要取得較好的分離純化效果，必須正確有效地選用樹(shù)脂。從表2可以看出，相同條件下NKA-9、AB-8、DM 130、NKA、D4020等五種大孔樹(shù)脂對(duì)桃葉珊瑚甙都有一定的吸附能力，其中NKA的最大吸附容量最大，但其解吸率較低，最終獲得的桃葉珊瑚甙較少；D4020的最大吸附容量雖然不是最大的，但是其解吸率很高，最終獲得的桃葉珊瑚甙最多。因此D4020對(duì)桃葉珊瑚甙具有良好的吸附與解吸能力，故確定D4020為桃葉珊瑚甙的分離純化樹(shù)脂。

表2 樹(shù)脂篩選實(shí)驗(yàn)的結(jié)果Table 2 Results of resin choice test

2.2 大孔樹(shù)脂對(duì)桃葉珊瑚甙的動(dòng)態(tài)吸附效果

2.2.1 泄漏曲線結(jié)果 由圖1可知，隨上樣液用量的增加，流出液中桃葉珊瑚甙濃度逐漸增加，當(dāng)上樣液用量在2BV時(shí)，流出液中桃葉珊瑚甙濃度接近上樣液濃度的1/10，即達(dá)到泄漏點(diǎn)，當(dāng)上樣液用量達(dá)到7BV時(shí)，流出液中桃葉珊瑚甙濃度已接近上樣液濃度并不再增加，說(shuō)明此時(shí)樹(shù)脂對(duì)桃葉珊瑚甙的吸附已接近飽和。故濃度4.57mg/m L的上樣液取2BV即40m L上樣為宜。

圖1 吸附泄漏曲線Fig.1 The curve of adsorption leak

2.2.2 上樣液濃度對(duì)吸附效果的影響 由圖2可知，隨著上樣液濃度的提高，樹(shù)脂吸附率逐漸升高，在達(dá)到3mg/m L后又略有下降。當(dāng)濃度較高時(shí)，大孔樹(shù)脂的吸附容量增加，但同時(shí)泄漏較多，造成了產(chǎn)品的浪費(fèi)。故選擇上樣液濃度為3mg/m L，此濃度下上樣液用量為60m L。

2.2.3 上樣速率對(duì)吸附效果的影響 由圖3可知，上樣速率越低，樹(shù)脂對(duì)桃葉珊瑚甙的吸附效果越好，吸附率越高，這是因?yàn)榱魉龠^(guò)快，部分產(chǎn)品與樹(shù)脂的接觸時(shí)間較短，來(lái)不及被樹(shù)脂吸附便隨上樣液一同流出樹(shù)脂柱。上樣速率從2m L/min到1m L/min吸附率升高趨勢(shì)不明顯，雖然較低流速可以提高吸附率，但同時(shí)也會(huì)延長(zhǎng)生產(chǎn)周期，故綜合考慮吸附率和生產(chǎn)周期，選擇上樣速率為2m L/m in。

圖2 上樣液濃度對(duì)吸附率的影響Fig.2 Effectof sample concentration on adsorption percent

圖3 上樣速率對(duì)吸附率的影響Fig.3 Effectof velocity on adsorption percent

2.2.4 上樣液pH對(duì)吸附效果影響 由圖4可知，在中性環(huán)境中樹(shù)脂對(duì)桃葉珊瑚甙的吸附率最大，酸性環(huán)境和堿性環(huán)境都使得樹(shù)脂對(duì)桃葉珊瑚甙的吸附率急劇下降。這是由于桃葉珊瑚甙為一種糖苷，在酸性和堿性環(huán)境下均容易發(fā)生水解和結(jié)構(gòu)的變化，其水解產(chǎn)物苷元具有縮醛結(jié)構(gòu)，性質(zhì)非?；顫姡菀走M(jìn)一步分解或聚合，使其在溶液中的濃度降低，從而影響大孔吸附樹(shù)脂的吸附[7]。故選擇上樣液pH為7。

圖4 pH對(duì)吸附率的影響Fig.4 Effectof pH on adsorption percent

2.3 大孔樹(shù)脂對(duì)桃葉珊瑚甙的動(dòng)態(tài)解吸效果

2.3.1 洗脫劑用量的確定 由圖5可知，隨著洗脫劑乙醇溶液用量的增加，桃葉珊瑚甙不斷從樹(shù)脂中洗脫下來(lái)。當(dāng)洗脫劑的用量為6BV時(shí)，洗脫液中已基本不存在桃葉珊瑚甙。故從經(jīng)濟(jì)成本和操作時(shí)間考慮，選擇6BV即120m L為洗脫劑用量。

2.3.2 洗脫劑濃度對(duì)洗脫效果的影響 由圖6可知，洗脫劑濃度對(duì)樹(shù)脂洗脫率的影響很大，根據(jù)“相似相溶”原理，不同濃度的乙醇溶液其極性不同，影響桃葉珊瑚甙與樹(shù)脂之間的吸附作用使桃葉珊瑚甙從樹(shù)脂上分離下來(lái)。根據(jù)圖6所示，50%（v/v）的乙醇溶液的洗脫率最大，故選擇洗脫劑乙醇的濃度為50%（v/v）。

2.3.3 洗脫速率對(duì)洗脫效果的影響 由圖7可知，洗脫速率越慢，桃葉珊瑚甙的洗脫效果越好，洗脫率越高；洗脫速率快不利于桃葉珊瑚甙的洗脫，因?yàn)橄疵搫┎荒艹浞峙c被吸附的桃葉珊瑚甙發(fā)生作用而將其從樹(shù)脂上洗脫出來(lái)。但是洗脫速率過(guò)低，將導(dǎo)致整個(gè)生產(chǎn)周期的延長(zhǎng)，生產(chǎn)效率下降，綜合考慮生產(chǎn)效率和產(chǎn)品產(chǎn)量，選擇洗脫速率為2m L/m in。

圖5 洗脫曲線Fig.5 The curve of elution

圖6 洗脫劑濃度對(duì)洗脫率的影響Fig.6 Effectof eluent concentration on desorption percent

圖7 洗脫速率對(duì)洗脫率的影響Fig.7 Effectofmoving velocity on desorption percent

2.4 定性分析結(jié)果

針對(duì)桃葉珊瑚甙的分子量將345.11的[M-H]-分子離子峰在質(zhì)譜總離子流圖中提取出來(lái)得到桃葉珊瑚甙精制品和桃葉珊瑚甙標(biāo)準(zhǔn)品的LC-MS譜圖，見(jiàn)圖8、圖9。桃葉珊瑚甙精制品為D4020型大孔吸附樹(shù)脂在上述最佳動(dòng)態(tài)吸附-解吸條件下獲得洗脫液減壓濃縮并經(jīng)凍干得到。保留時(shí)間tR=1.03m in的峰即為桃葉珊瑚甙。

2.5 純度檢測(cè)結(jié)果

桃葉珊瑚甙粗提液經(jīng)D4020樹(shù)脂純化后，測(cè)得精制品純度為62.54%，較純化前的純度19.71%有了較大的提高，說(shuō)明D4020樹(shù)脂對(duì)桃葉珊瑚甙的純化效果較好，能大幅度提高提取物中的桃葉珊瑚甙含量。

圖8 桃葉珊瑚甙精制品LC-MS譜圖Fig.8 LC-MS chromatogram for refined sample

圖9 桃葉珊瑚甙標(biāo)準(zhǔn)品LC-MS譜圖Fig.9 LC-MS chromatogram for standard substance

3 結(jié)論

D4020樹(shù)脂為最佳的分離純化杜仲翅果桃葉珊瑚甙的樹(shù)脂，其靜態(tài)最大飽和吸附量為25.25mg/m L，靜態(tài)解吸率為83.11%。D4020樹(shù)脂分離純化桃葉珊瑚甙的最佳工藝條件為：上樣液濃度3mg/m L、上樣液pH為7、上樣速率2m L/min、洗脫劑選用50%（v/v）的乙醇溶液、用量120m L、洗脫速率2m L/m in。按照這一最佳工藝條件分離純化，桃葉珊瑚甙精制品純度由原來(lái)的19.71%提高到62.54%，取得了較好的效果。

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Study on separation and purification process of aucubin from Eucomm ia seeds by macroporous resins

MA Long1，ZHOU Xian-han2，XU Hui1
（1.Department of Biology and Food Engineering，Bengbu College，Bengbu 233030，China；2.Institute of Biology and Food Engineering，Hefei University of Technology，Hefei230009，China）

In order to obtain aucubin w ith high purity from Eucomm ia seeds，macroporous resin was used for purification.The adsorp tion and desorp tion rates of 5 types of macroporous resins towards aucubin were investigated.Among the mac roporous resins，D4020 resin was the most suitab le to purify aucubin.When 40m L of 3mg/m L and pH 7 sam p le was flowed through D4020 resin column at a speed of 2m L/m in，the adsorp tion reached dynam ic equilibrium.The adsorbed aucubin could be com p letely eluted w ith 120m L of 50%（v/v）ethanolat2m L/m in.The purity of aucubin could be 62.54%by refinement of the D4020 resin.

macroporous resin；adsorp tion；purification；Eucomm ia seeds；aucubin

TS201.1

B

1002-0306（2012）09-0249-04

2011－08－01

馬龍（1979-），男，碩士，講師，研究方向：農(nóng)產(chǎn)品加工與貯藏工程。

安徽省高等學(xué)校省級(jí)食品科學(xué)與工程特色專(zhuān)業(yè)建設(shè)點(diǎn)資助項(xiàng)目（20101091）；安徽省食品科學(xué)與工程教學(xué)團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目（20101094）。