焦 巖，常 影

（1.齊齊哈爾大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，黑龍江齊齊哈爾 161006；2.齊齊哈爾大學(xué)農(nóng)產(chǎn)品加工黑龍江省普通高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江齊齊哈爾 161006）

超聲波輔助提取蘋(píng)果皮中總黃酮工藝條件的優(yōu)化

焦 巖1，2，常 影1，*

（1.齊齊哈爾大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，黑龍江齊齊哈爾 161006；2.齊齊哈爾大學(xué)農(nóng)產(chǎn)品加工黑龍江省普通高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江齊齊哈爾 161006）

采用超聲波輔助法對(duì)蘋(píng)果皮中的總黃酮進(jìn)行提取和條件優(yōu)化。在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，用響應(yīng)面研究了乙醇體積分?jǐn)?shù)、液固比、提取時(shí)間對(duì)黃酮得率的影響。并由此確定了超聲波輔助提取蘋(píng)果皮中總黃酮最佳提取工藝條件：乙醇體積分?jǐn)?shù)50.3%、液固比28.9∶1、時(shí)間49.1min，黃酮得率為19.32mg/g。

蘋(píng)果皮，黃酮，超聲波提取，響應(yīng)面法，工藝條件

黃酮化合物是廣泛存在于水果和蔬菜中的一類(lèi)次生代謝物質(zhì)，近來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，黃酮類(lèi)物質(zhì)對(duì)心腦血管疾病、新陳代謝及免疫系統(tǒng)有重要作用，對(duì)缺血性腦血管疾病有很好的防治及緩解作用[1-2]。此外，黃酮能夠有效地預(yù)防和治療癌癥、骨質(zhì)疏松、婦女更年期綜合征等多種疾病，黃酮在保健食品和醫(yī)藥領(lǐng)域有著廣闊的應(yīng)用前景[3-5]。黃酮是蘋(píng)果果實(shí)中的主要多酚類(lèi)物質(zhì)，是蘋(píng)果中的重要抗氧化物質(zhì)來(lái)源。蘋(píng)果果實(shí)中含有豐富的黃酮類(lèi)物質(zhì)，且主要集中在果皮部分，果皮中的黃酮含量遠(yuǎn)高于果肉和果心[6-7]。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外研究者對(duì)蘋(píng)果果實(shí)中的黃酮研究較多，而由于蘋(píng)果皮中含有較多營(yíng)養(yǎng)和功能成分，因此對(duì)蘋(píng)果皮中黃酮類(lèi)物質(zhì)的提取和功能研究也成為當(dāng)今國(guó)內(nèi)外研究的熱點(diǎn)[8-11]。例如美國(guó)康奈爾大學(xué)的研究者正在研究蘋(píng)果皮中的多酚和黃酮類(lèi)物質(zhì)的結(jié)構(gòu)和抗癌功能，并研究其提取物作為功能食品添加劑等。超聲波輔助提取法因具有提取時(shí)間短、效率高、提取液中雜質(zhì)少、對(duì)有效成分結(jié)構(gòu)破壞較小、提取溫度可控等優(yōu)點(diǎn)在天然植物活性成分的提取有較多應(yīng)用[12-13]。為了充分利用蘋(píng)果加工副產(chǎn)物，有效利用蘋(píng)果皮中的活性黃酮類(lèi)物質(zhì)，首先在比較了四種市售蘋(píng)果皮中的黃酮含量基礎(chǔ)上，篩選了黃酮含量比較高的蘋(píng)果皮種類(lèi)，采用單因素實(shí)驗(yàn)和響應(yīng)面法，得到了超聲波輔助提取蘋(píng)果皮中總黃酮的最佳工藝條件，為蘋(píng)果資源的開(kāi)發(fā)利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

新鮮富士蘋(píng)果、花牛蘋(píng)果、國(guó)光蘋(píng)果、黃元帥蘋(píng)果 市售，清洗后取皮，將蘋(píng)果皮真空干燥箱低溫干躁，粉碎至60目，于-20℃凍藏備用；蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品 美國(guó)Sigma公司；無(wú)水乙醇、硝酸鋁、亞硝酸鈉、氫氧化鈉等試劑 上?；瘜W(xué)試劑公司，分析純。

DHG-9240A型電熱真空干燥箱 上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；JA2003電子天平 上海良平儀器儀表有限公司；DK-98-1型電熱水浴鍋，F(xiàn)W 100型高速萬(wàn)能粉碎機(jī) 天津市泰斯特儀器有限公司；UV-2450型紫外—可見(jiàn)分光光度計(jì) 日本島津；PB-10型pH計(jì) 德國(guó)Sartorius公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 蘋(píng)果皮黃酮提取工藝流程 干燥恒重的蘋(píng)果皮→粉碎→過(guò)60目篩→超聲波輔助提取→測(cè)定黃酮得率

1.2.2 黃酮含量的測(cè)定 標(biāo)準(zhǔn)方程的建立：蘋(píng)果皮黃酮按NaNO2-Al（NO3）3比色法顯色法測(cè)定[14]（40%乙醇作溶劑），以蘆丁為標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照品，用紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)在510nm處比色，測(cè)定不同濃度蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品溶液吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到標(biāo)準(zhǔn)方程：A=0.0015x+ 0.0002（R2=0.9987），式中：A為吸光度；x為蘆丁含量，mg/m L。

樣品中黃酮含量的測(cè)定：取各組不同實(shí)驗(yàn)條件下所得的定容樣液依法顯色，按下式計(jì)算蘋(píng)果皮黃酮得率y（以蘆丁計(jì)），y=（A-0.0002）V/（0.0015m），式中：y為黃酮得率，mg/g；A為樣液的吸光度；m為各組實(shí)驗(yàn)樣品質(zhì)量，g；V為總體積數(shù)，m L。

1.2.3 不同種類(lèi)蘋(píng)果皮中黃酮含量的比較 分別取干燥后的富士蘋(píng)果、花牛蘋(píng)果、國(guó)光蘋(píng)果、黃元帥蘋(píng)果果皮粉末，以60%的乙醇為溶劑，以一定的液固比，在相同的提取條件下進(jìn)行三次超聲波提取，合并提取液定容，然后測(cè)定黃酮得率，比較不同種類(lèi)蘋(píng)果皮中黃酮的含量。

1.2.4 超聲波法提取蘋(píng)果皮黃酮單因素實(shí)驗(yàn)[15]選擇黃酮含量最高的蘋(píng)果皮為原料，研究超聲波輔助提取蘋(píng)果皮黃酮的工藝條件，考察不同乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取時(shí)間、提取溫度、液固比等單因素對(duì)黃酮得率的影響。

1.2.5 響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn) 在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，采用Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化蘋(píng)果皮黃酮提取工藝參數(shù)[16]。采用統(tǒng)計(jì)分析軟件SAS9.0進(jìn)行4因素3水平的響應(yīng)面分析實(shí)驗(yàn)[11]，實(shí)驗(yàn)因素水平見(jiàn)表1。

表1 Box-Behnken實(shí)驗(yàn)因素水平編碼表Table 1 Coded levels of variables of the Box-Behnken experimental design

2 結(jié)果與分析

2.1 不同種類(lèi)蘋(píng)果皮中黃酮含量的比較

圖1 不同種類(lèi)蘋(píng)果皮中黃酮含量的比較Fig.1 Comparison of flavonoid contentin differentkindsofapples

由圖1可以看出，四種蘋(píng)果皮中的黃酮含量差異很大，其中花牛蘋(píng)果皮中黃酮含量最高，國(guó)光蘋(píng)果皮黃酮含量最低，四種蘋(píng)果黃酮含量大小依次為花牛>紅富士>黃元帥>國(guó)光。

2.2 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)黃酮得率的影響 由圖2可知，在超聲溫度50℃、超聲功率300W、液固比50∶1、超聲時(shí)間30m in條件下，乙醇體積分?jǐn)?shù)為60%左右時(shí)，蘋(píng)果皮黃酮提取率較高。

圖2 不同乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)黃酮得率的影響Fig.2 Effectofdifferentethanolconcentrationson flavonoid yield

2.2.2 液固比對(duì)黃酮得率的影響 由圖3可知，在乙醇體積分?jǐn)?shù)60%，超聲溫度50℃，超聲功率300W，超聲時(shí)間30m in條件下，液固比為30∶1左右時(shí)，蘋(píng)果皮黃酮提取率較高。

圖3 不同液固比對(duì)黃酮得率的影響Fig.3 Effectof different ratio of solutions tomaterial on flavonoid yield

2.2.3 超聲提取時(shí)間對(duì)黃酮得率的影響 由圖4可知，在乙醇體積分?jǐn)?shù)60%，超聲溫度50℃，超聲功率300W，液固比30∶1條件下，提取時(shí)間為50min時(shí)黃酮得率較高。

圖4 不同提取時(shí)間對(duì)黃酮得率的影響Fig.4 Effectof differentextraction time on flavonoid yield

2.2.4 超聲溫度對(duì)黃酮得率的影響 由圖5可知，在乙醇體積分?jǐn)?shù)60%，超聲功率300W，液固比50∶1，超聲時(shí)間50m in條件下，蘋(píng)果皮黃酮得率隨溫度的升高而增大，當(dāng)溫度超過(guò)50℃時(shí)逐漸趨于平穩(wěn)，故超聲波提取蘋(píng)果皮黃酮的溫度控制在50℃為宜。

圖5 不同提取溫度對(duì)黃酮得率的影響Fig.5 Effectofdifferentextraction temperature on flavonoid yield

2.3 響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析

表2 Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Box-Behnken experimental design and its results

2.3.1 回歸模型的建立與分析 以乙醇體積分?jǐn)?shù)（X1）、液固比（X2）、溫度（X3）3因素為自變量，黃酮得率（Y）為響應(yīng)值，進(jìn)行響應(yīng)面分析實(shí)驗(yàn)，得出了不同實(shí)驗(yàn)條件下所提取的蘋(píng)果皮黃酮得率（表2）。

2.3.2 模型的建立及分析 利用SAS9.0對(duì)表2的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析、參數(shù)估計(jì)及顯著性檢測(cè)，具體結(jié)果分析見(jiàn)表3，并得到標(biāo)準(zhǔn)形式的三元二次回歸方程：

由表3可知，影響超聲波輔助提取蘋(píng)果皮中黃酮含量大小順序?yàn)閄1>X2>X3，即乙醇體積分?jǐn)?shù)>液固比>提取時(shí)間。從回歸分析結(jié)果來(lái)看，此模型的P＜0.01，響應(yīng)面回歸模型達(dá)到顯著水平，決定系數(shù)R2為0.950。逐項(xiàng)顯著性檢驗(yàn)結(jié)果表明，一次項(xiàng)、二次項(xiàng)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果有顯著性影響；交互項(xiàng)X1X3對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響顯著；殘差項(xiàng)各項(xiàng)數(shù)據(jù)分析表明，該模型失擬P=0.0718>0.05不具有高顯著性；因此該二次方程能夠較好地?cái)M合真實(shí)的響應(yīng)面。

2.3.3 響應(yīng)曲面分析與優(yōu)化 為了考察三因素間的交互作用情況，采用design exper7.0軟件對(duì)回歸模型進(jìn)行降維分析，并得到任意兩因素響應(yīng)曲面圖和等高線圖，如圖6～圖8所示。

由圖6～圖8可以看出，乙醇體積分?jǐn)?shù)和液固比之間、乙醇體積分?jǐn)?shù)和提取時(shí)間之間的交互作用顯著，相比較而言，提取時(shí)間和液固比之間的交互作用較小。從圖6可以看出，乙醇體積分?jǐn)?shù)、液固比對(duì)蘋(píng)果皮黃酮提取率的影響最大，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)和液固比的增加，蘋(píng)果皮黃酮提取率呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，兩個(gè)因素與黃酮得率之間的變化符合所建立的響應(yīng)面模型方程。

2.3.4 最佳工藝參數(shù)的確定和驗(yàn)證 利用SAS9.0RSREG Procedure分析數(shù)據(jù)軟件得到表4。從特征值分析結(jié)果可以看出，其特征值均為負(fù)值，因此在曲面內(nèi)有最大響應(yīng)值（點(diǎn)），這種情況都可直接從曲面找出最優(yōu)工藝參數(shù)，且無(wú)需用嶺脊回歸尋優(yōu)分析，所得到的該穩(wěn)定點(diǎn)即為理論上的最佳點(diǎn)[14]。

表3 二次響應(yīng)面回歸模型方差分析及參數(shù)估計(jì)Table 3 Analysis of variance and parameter estimate of the regressionmodel of quadratic response

進(jìn)一步驗(yàn)證模型分析結(jié)果，在乙醇體積分?jǐn)?shù)50.3%、液固比值28.9、時(shí)間49.1m in條件下進(jìn)行重復(fù)提取工藝實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次，得到蘋(píng)果皮黃酮得率為（19.32±0.16）mg/g（n=3），與本研究中所建立的響應(yīng)面模型分析結(jié)果中的預(yù)測(cè)值19.495686mg/g比較接近。按實(shí)際提取工藝情況，可將乙醇體積分?jǐn)?shù)50.3%、液固比28.9∶1、時(shí)間49.1m in作為超聲波輔助法提取花牛蘋(píng)果皮黃酮的最佳工藝參數(shù)。

表4 典型相關(guān)和特征值分析結(jié)果Table 4 Canonical and eigenvalues analysis of test results

圖6 Y=f（X1，X2）響應(yīng)曲面圖及其等高線Fig.6 Response curved surface figure and its equal-height line of Y=f（X1，X2）

圖7 Y=f（X1，X3）響應(yīng)曲面圖及其等高線Fig.7 Response curved surface figure and its equal-height line of Y=f（X1，X3）

圖8 Y=f（X2，X3）響應(yīng)曲面圖及其等高線Fig.8 Response curved surface figure and its equal-height line of Y=f（X2，X3）

3 結(jié)論

采用超聲波輔助法提取蘋(píng)果皮黃酮，首次篩選出花牛蘋(píng)果皮中的黃酮含量最高。在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上采用響應(yīng)面法對(duì)提取過(guò)程中的各因素進(jìn)行了優(yōu)化，得出其最佳工藝條件為：乙醇體積分?jǐn)?shù)50.3%、液固比28.9∶1、時(shí)間49.1min，黃酮得率為19.32mg/g。

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Optim ization of ultrasonic wave-assisted extraction process of flavonoids from app le peels

JIAO Yan1，2，CHANG Ying1，*

（1.College of Food and Biological Engineering，Qiqihar University，Qiqihar 161006，China；2.Key Laboratory of Processing Agricultural Products of Heilongjiang Province，Qiqihar University，Qiqihar 161006，China）

The extraction p rocess of flavonoids from app le peels by the ultrasonic assisted technique was stud ied.Based on sing le factor test，response surface methodology（RSM）was used to study effec t of the ethanol concentrations，ratio of solutions to material，extraction time on extraction rate of flavonoids.The best extraction conditions were determ ined as follows：ethanol concentrations 50.3%，ratio of solutions to material 28.9∶1，time 49.1m in，the flavonoids yield was 19.32mg/g.

app le peels；flavonoids；ultrasonic wave extrac tion；response surface method；p rocess cond itions

TS255.1

B

1002-0306（2012）09-0283-04

2011－08－23 *通訊聯(lián)系人

焦巖（1981－），男，博士，講師，研究方向：生物活性物質(zhì)與功能食品。