胡 筱，李春陽(yáng)，周 濤，*

（1.南京師范大學(xué)金陵女子學(xué)院，江蘇南京210097; 2.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，江蘇南京 210014）

響應(yīng)面法優(yōu)化藍(lán)莓葉抑菌物質(zhì)的提取工藝

胡 筱1，李春陽(yáng)2，周 濤1，*

（1.南京師范大學(xué)金陵女子學(xué)院，江蘇南京210097; 2.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，江蘇南京 210014）

在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面法優(yōu)化藍(lán)莓葉抑菌物質(zhì)的最佳提取工藝，實(shí)驗(yàn)結(jié)果為:乙醇體積分?jǐn)?shù)85.00%、提取溫度66℃、液料比9.2∶1（mL/g），在此條件下藍(lán)莓葉提取物抑菌效果最好，抑菌圈直徑平均值達(dá)18.07mm。

響應(yīng)面法，藍(lán)莓葉，抑菌，提取工藝

藍(lán)莓，又稱越橘，屬杜鵑花科（Ericaceae）越橘屬（Vaccinium spp.）多年生落葉或常綠灌木［1］。分布于中國(guó)、俄羅斯、歐洲、北美、日本、朝鮮等北半球高緯度國(guó)家［2］。藍(lán)莓作為一種藥食兩用植物，以葉入藥，性溫、味苦，有利尿、消炎、解毒之功效，并可用于風(fēng)濕、痛風(fēng)的治療。藍(lán)莓葉中含有豐富的黃酮類、原花青素、花色苷類等多種多酚類生理活性成分，還富含多種微量元素［3］。植物多酚能與生物大分子如蛋白質(zhì)、多糖結(jié)合，并能與金屬離子發(fā)生絡(luò)合反應(yīng)，對(duì)微生物具有抑制作用［4］。對(duì)于藍(lán)莓的研究，大多局限于對(duì)其果實(shí)營(yíng)養(yǎng)成分、藥用成分的測(cè)定，而對(duì)藍(lán)莓葉的應(yīng)用和研究較少。目前國(guó)內(nèi)外對(duì)藍(lán)莓葉的研究主要集中在活性物質(zhì)的提取純化、黑色素的穩(wěn)定性及其生理功能［5－10］方面，對(duì)于藍(lán)莓葉提取物抑菌作用的研究較少。本實(shí)驗(yàn)采用響應(yīng)面法（RSM）［11］優(yōu)化藍(lán)莓葉抑菌物質(zhì)的提取工藝，旨在為藍(lán)莓葉資源的利用及天然抑菌劑的開(kāi)發(fā)提供一定的理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

藍(lán)莓葉 采自南京市溧水傅家邊農(nóng)業(yè)科技觀光園;大腸桿菌（Escherichia coli）、金黃色葡萄球菌（Staphyloccocus aureus） 南京師范大學(xué)食品微生物實(shí)驗(yàn)室;培養(yǎng)基 牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基;無(wú)水乙醇、氫氧化鈉、瓊脂、氯化鈉 均為分析純;牛肉膏、蛋白胨 均為生化試劑。

YXQ－LS－SII型高壓滅菌鍋 上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠;LD5－10型低速離心機(jī) 北京醫(yī)用離心機(jī)廠;N－1001型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海愛(ài)郎儀器有限公司;SW－CJ－IF型無(wú)菌超凈工作臺(tái) 蘇州凈化設(shè)備有限公司;DHG－9140型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司;CHA－S氣浴恒溫振蕩培養(yǎng)箱 蘇州江東精密儀器有限公司;722N可見(jiàn)分光光度計(jì) 上海精密科學(xué)儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 藍(lán)莓葉提取物的制備 藍(lán)莓葉經(jīng)60℃干燥后粉碎過(guò)篩，稱取藍(lán)莓葉粉末5g，加入提取劑，在一定溫度下冷凝回流，真空抽濾，4000r/min離心8min，取上清液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至5m L原液（此處原液指1m L提取液中含有1g原材料的提取物，即1g/m L），原液經(jīng)0.2μm微孔除菌膜過(guò)濾除菌后，4℃條件下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 菌懸液的制備 在無(wú)菌條件下，將供試菌種接種到牛肉膏蛋白胨斜面培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)24h，挑取菌落，用無(wú)菌生理鹽水稀釋，獲得6～7 lgCFU/m L的菌懸液，備用［12］。

1.2.3 提取物抑菌作用的測(cè)定 采用打孔法測(cè)定提取液抑菌作用。吸取適宜體積分?jǐn)?shù)的菌懸液0.1m L加入平皿中，倒入溫度冷卻至50℃左右的培養(yǎng)基約15m L后搖勻;待培養(yǎng)基凝固后，用打孔器在平板上打出三個(gè)直徑為6mm的圓孔，向圓孔中加入50μL提取液，每個(gè)菌種每種提取物做三組平行，另以試樣含同樣體積分?jǐn)?shù)的乙醇為空白對(duì)照。平皿放置于37℃下培養(yǎng)24h后，用游標(biāo)卡尺量取抑菌圈直徑，以抑菌圈直徑大小作為衡量提取液對(duì)金黃色葡萄球菌和大腸桿菌抑菌活性的指標(biāo)。

1.2.4 單因素實(shí)驗(yàn) 以兩種菌種抑菌圈直徑的平均值為指標(biāo)，研究乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取溫度、液料比和提取時(shí)間四個(gè)因素的影響規(guī)律。

1.2.5 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)方案 根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果設(shè)定因素水平，采用 Design Expert 7.0軟件的 Box－Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)原理［13］，選取影響抑菌物質(zhì)提取率的3個(gè)主要因素:乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取溫度和液料比進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化組合，因素水平設(shè)計(jì)見(jiàn)表1。

表1 Box－Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)因素水平及編碼Table 1 Factors and coded levels in the Box－Behnken experimental design

2 結(jié)果與討論

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)提取物抑菌效果的影響 在液料比10∶1（m L/g），溫度60℃，時(shí)間6h的提取條件下，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的提高，藍(lán)莓葉抑菌物質(zhì)的提取率也隨之增大。但當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)達(dá)到80%以上時(shí)，抑菌效果隨乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加而減弱（見(jiàn)圖1）。這可能是由于一些醇溶性雜質(zhì)、色素、親脂性強(qiáng)的成分增大溶出，干擾因素增大，從而導(dǎo)致抑菌物質(zhì)的提取率下降。

2.1.2 提取溫度對(duì)提取物抑菌效果的影響 在液料比10∶1（m L/g），乙醇體積分?jǐn)?shù)80%，時(shí)間6h的提取條件下，隨著提取溫度的升高，藍(lán)莓葉抑菌物質(zhì)的提取率先增后減（見(jiàn)圖2）。在溫度60℃時(shí)，提取物的抑菌活性達(dá)到最高值，繼續(xù)增加提取溫度，抑菌活性反而下降。溫度過(guò)高，活性物質(zhì)的結(jié)構(gòu)會(huì)遭到破壞;另一方面也會(huì)造成溶劑的損失和成本費(fèi)用增加。

圖1 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)抑菌效果的影響Fig.1 Effect of ethanol concentration on antibacterial activity of the extract

圖2 提取溫度對(duì)抑菌效果的影響Fig.2 Effect of extraction temperature on antibacterial activity of the extract

2.1.3 液料比對(duì)提取物抑菌效果的影響 在乙醇體積分?jǐn)?shù)80%，溫度60℃，時(shí)間6h的提取條件下，隨著液料比的升高，藍(lán)莓葉抑菌物質(zhì)的提取率也隨之增大（見(jiàn)圖3）。液料比10∶1（m L/g）時(shí)，藍(lán)莓葉提取物的抑菌活性最強(qiáng)。繼續(xù)增大液料比，抑菌活性變化不大。前期溶劑量大，可以增加物料與溶劑的接觸面積，有效成分浸出更加完全，當(dāng)液料比達(dá)到一定的比例時(shí)，提取劑中抑菌物質(zhì)的溶解度基本達(dá)到飽和，此時(shí)再增大液料比會(huì)造成溶劑和能源的浪費(fèi)，并使進(jìn)一步的濃縮時(shí)消耗更多的能量和時(shí)間。

圖3 液料比對(duì)抑菌效果的影響Fig.3 Effect ofmaterial－to－liquid ratio on antibacterial activity of the extract

2.1.4 提取時(shí)間對(duì)提取物抑菌效果的影響 在液料比10∶1（m L/g），乙醇體積分?jǐn)?shù)80%，溫度60℃的提取條件下，隨著提取時(shí)間的增加，藍(lán)莓葉抑菌物質(zhì)的提取率也隨著增大（見(jiàn)圖4）。但當(dāng)提取時(shí)間達(dá)到6h以上時(shí)，抑菌效果隨提取時(shí)間的增加而減弱。表明提取時(shí)間在1～6h時(shí)，物料與溶劑接觸越來(lái)越充分，體積分?jǐn)?shù)差也較大，擴(kuò)散速度快，加速了有效抑菌成分的浸出［14］。隨著時(shí)間延長(zhǎng)，增加了非抑菌成分的浸出，同時(shí)抑菌成分可能也受到了破壞。

表3 回歸模型方差分析表Table 3 ANOVA for response surface quadratic model

圖4 提取時(shí)間對(duì)抑菌效果的影響Fig.4 Effect of extraction time on antibacterial activity of the extract

2.2 響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)

2.2.1 響應(yīng)面設(shè)計(jì)結(jié)果與分析 按表1因素與水平設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)方案，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 響應(yīng)面法設(shè)計(jì)與實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 2 Experimental design and results of the Box－Benhnken test

2.2.2 回歸模型的建立及其顯著性檢驗(yàn) 利用Design－Expert 7.0軟件對(duì)表2數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合，得到乙醇體積分?jǐn)?shù)（X1）、提取溫度（X2）、液料比（X3）的二次多項(xiàng)回歸模型:

對(duì)該模型進(jìn)行方差分析，結(jié)果見(jiàn)表3，回歸模型系數(shù)顯著性檢驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表4。

從表3可見(jiàn)，對(duì)藍(lán)莓葉抑菌物質(zhì)提取所建立的回歸模型差異極顯著（P＜0.0001），說(shuō)明該回歸方程因變量和全體自變量的相關(guān)關(guān)系是顯著的，即這種實(shí)驗(yàn)方法是可靠的。失擬項(xiàng)P＞0.05，差異不顯著，說(shuō)明可以用該回歸方程對(duì)不同提取條件下的抑菌物質(zhì)的提取效果進(jìn)行檢測(cè)。復(fù)相關(guān)系數(shù)R2=0.9772，說(shuō)明該模型能解釋97.72%響應(yīng)者的變化，即該模型與實(shí)際實(shí)驗(yàn)擬合良好，實(shí)驗(yàn)誤差小。校正決定系數(shù)R2Adj=0.9478，說(shuō)明該回歸方程可以較好地描述各因素與響應(yīng)值之間的真實(shí)關(guān)系。另外，該模型的變異系數(shù)為1.50%，數(shù)值較低，說(shuō)明該實(shí)驗(yàn)重復(fù)性好［15］，可靠性強(qiáng)。該模型的RSN（信噪比）為17.568，遠(yuǎn)大于4，說(shuō)明用此模型可以得到足夠強(qiáng)的響應(yīng)信號(hào)。由此可知，回歸方程的擬合度和可信度均很高，能夠很好地對(duì)藍(lán)莓葉中抑菌物質(zhì)的提取進(jìn)行預(yù)測(cè)。

由表4可以看出，乙醇體積分?jǐn)?shù)和提取溫度的交互作用、提取溫度的二次項(xiàng)和液料比的二次項(xiàng)對(duì)抑菌效果有極顯著影響（P＜0.01）;乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取溫度和液料比的一次項(xiàng)以及提取溫度和液料比的交互作用對(duì)抑菌效果有顯著影響;乙醇體積分?jǐn)?shù)和提取溫度的交互作用、乙醇體積分?jǐn)?shù)的二次項(xiàng)影響不顯著。表明乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取溫度和液料比對(duì)藍(lán)莓葉抑菌物質(zhì)的提取影響顯著，并且乙醇體積分?jǐn)?shù)和提取溫度、提取溫度和液料比之間存在交互作用。由3個(gè)因素的F值大小可知，對(duì)藍(lán)莓葉抑菌物質(zhì)的提取效果影響的顯著性順序依次為液料比＞提取溫度＞乙醇體積分?jǐn)?shù)。

2.2.3 響應(yīng)面分析與優(yōu)化 根據(jù)回歸模型作出兩因素交互作用的響應(yīng)曲面及其等高線圖，結(jié)果見(jiàn)圖5～圖7。如果一個(gè)響應(yīng)曲面坡度非常陡峭，表示響應(yīng)值對(duì)于各實(shí)驗(yàn)表件改變很敏感［16］。

圖5顯示在液料比為10∶1條件下，提取溫度和乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)藍(lán)莓葉抑菌物質(zhì)提取的影響。提取溫度對(duì)抑菌物質(zhì)提取的影響顯著，曲面較陡，乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)抑菌物質(zhì)提取的影響不太顯著，曲面相對(duì)較緩和。圖6顯示在提取溫度為60℃條件下，液料比和乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)藍(lán)莓葉抑菌物質(zhì)提取的影響。液料比對(duì)抑菌物質(zhì)提取的影響顯著，曲面較陡，乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)抑菌物質(zhì)的影響不太顯著，曲面相對(duì)較緩和。圖7顯示在乙醇體積分?jǐn)?shù)為80%條件下，液料比和提取溫度對(duì)藍(lán)莓葉抑菌物質(zhì)提取的影響。液料比和提取溫度對(duì)抑菌物質(zhì)提取的影響均顯著，曲面都較陡。

表4 回歸模型系數(shù)的顯著性檢驗(yàn)結(jié)果Table 4 Test results of significance for regression coefficient

圖5 提取溫度和乙醇體積分?jǐn)?shù)交互作用對(duì)抑菌效果影響的響應(yīng)面圖Fig.5 Response surface graph indicating the effects of extraction temperature，ethanol concentration and their interactions on antibacterial activity of extract

圖6 液料比和乙醇體積分?jǐn)?shù)交互作用對(duì)抑菌效果影響的響應(yīng)面圖Fig.6 Response surface graph indicating the effects of material－to－liquid ratio，ethanol concentration and their interactions on antibacterial activity of extract

2.2.4 回歸方程及模型驗(yàn)證 對(duì)回歸方程取一階偏導(dǎo)數(shù)等于零，整理得如下:

由式（1）～式（3）聯(lián)立解方程組，換算成實(shí)驗(yàn)條件得到乙醇體積分?jǐn)?shù)X1=85.00%，提取溫度X2= 65.83℃，液料比X3=9.18∶1。在此條件下，金黃色葡萄球菌和大腸桿菌抑菌圈直徑可達(dá)18.13mm?？紤]實(shí)際情況將最佳工藝條件修正為乙醇體積分?jǐn)?shù)85.00%，提取溫度66℃，液料比9.2∶1，重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次，實(shí)際測(cè)得的抑菌圈直徑為18.07mm，與理論預(yù)測(cè)值相比，其相對(duì)誤差約為1%，說(shuō)明該模型準(zhǔn)確可靠，具有實(shí)用價(jià)值。

圖7 液料比和提取溫度交互作用對(duì)抑菌效果影響的響應(yīng)面圖Fig.7 Response surface graph indicating the effects of material－to－liquid ratio，extraction temperature and their interactions on antibacterial activity of extract

3 結(jié)論

藍(lán)莓葉抑菌物質(zhì)的最佳提取工藝參數(shù)為:乙醇體積分?jǐn)?shù)85.00%，提取溫度66℃，液料比9.2∶1，提取時(shí)間6h。此時(shí)，藍(lán)莓葉中抑菌物質(zhì)提取效果最佳，抑菌圈直徑可達(dá)18.07mm，與模型預(yù)測(cè)值接近。本研究為藍(lán)莓葉資源的綜合利用和天然抑菌劑的開(kāi)發(fā)奠定了基礎(chǔ)，具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。

［1］凌關(guān)庭.抗氧化食品與健康［M］.北京:化學(xué)工業(yè)出版社，2004:1－58.

［2］屠鵬飛，胡迎慶，劉江云.越桔屬植物的化學(xué)成分與開(kāi)發(fā)價(jià)值［J］.中草藥，1996，27（9）:565－568.

［3］馬田田.篤斯越桔葉營(yíng)養(yǎng)成分分析［J］.特產(chǎn)研究，2001，23 （1）:19－21.

［4］付婉霞，孫麗娟.植物多酚殺菌及軟化性能的探索研究［J］.給水排水，2006，32（1）:51－55.

［5］王作昭，劉靜波，林松毅，等.篤斯越桔黃酮類化合物提取技術(shù)的實(shí)驗(yàn)研究［J］.食品科學(xué)，2006，27（11）:391－394.

［6］李穎暢，孟憲軍，李小紅.大孔樹(shù)脂純化藍(lán)莓葉總黃酮的工藝研究［J］.食品與發(fā)酵工業(yè)，2008，34（1）:133－137.

［7］SKUPIEN K，OSZMIANSKI J，KOSTRZEWA N D，et al.In vitro antileukemic activity of extracts from berry leaves against sensitive and muctidrug resistant HL60 cells［J］.Cancer Letters，2006，236（2）:281－291.

［8］Naczk，Grant S，Zadernowski R，et al.Protein precipitating capacity of phenolics of wild blueberry leaves and fruits［J］.Food Chemistry，2006，96（4）:640－647.

［9］杜建明，張艷芬，周玉蘭，等.烏飯樹(shù)葉色素的提取技術(shù)及其穩(wěn)定性研究［J］.食品科學(xué)，1992（4）:14－16.

［10］魏國(guó)華，劉鐘棟，許新德，等.烏飯樹(shù)葉提取物的抗氧化能力探討［J］.食品與發(fā)酵工業(yè)，2006，32（12）:57－59.

［11］Box G P，Behnken DW.Some new three lever designs for the study of quantitative variables［J］.Technometrics，1962（2）: 455－476.

［12］周邦靖.常用中藥的抗菌作用及其測(cè)定方法［M］.重慶:科學(xué)技術(shù)出版社重慶分社，1987:302－303.

［13］慕運(yùn)動(dòng).響應(yīng)面方法及其在食品工業(yè)中的應(yīng)用［J］.鄭州工程學(xué)院學(xué)報(bào)，2001，22（3）:91－95.

［14］胡林子，蔣雨，馬永全，等.響應(yīng)面優(yōu)化超聲波提取山毛豆抑菌物質(zhì)條件研究［J］.食品科學(xué)，2010，31（22）:91－95.

［15］蔣雨，陳安均，于新，等.響應(yīng)面法優(yōu)化微波提取野菊花抑菌物質(zhì)工藝［J］.食品科學(xué)，2010，31（22）:59－63.

［16］楊佳，張國(guó)文，汪佳蓉，等.響應(yīng)面分析法優(yōu)化超聲提取贛南臍橙皮中黃酮類化合物的工藝研究［J］.食品科學(xué)，2009，30 （16）:94－97.

Optim ization of extraction technology of antim icrobial substances from blueberry leaves by response surface analysis

HU Xiao1，LIChun－yang2，ZHOU Tao1，*

（1.Ginling College，Nanjing Normal University，Nanjing 210097，China; 2.Institute of Agro－food Science and Technology，Jiangsu Academy of Agricultural Sciences，Nanjing 210014，China）

In order to ob tain op timum cond itions for extrac tion of antibac terial substance from b lueberry leaves，on the basis of sing le factor investigations，response surface methodology（RSM）was used to study effec ts of ethanol concentration，extrac tion tim e and solid－liquid ratio on the extraction rate of antim ic robial substances.Results showed that the op timum cond itions were as follows:ethanol concentration 85.00%，extraction temperature 66℃and liquid－to－material ratio 9.2∶1（m L/g）.Under the op tim ized cond itions，the maximum d iameter of inhibition zone was 18.07mm.

response surface m ethodology;b lueberry leaves;antibac terial;extraction p rocess

TS201.3

A

1002－0306（2012）06－0309－05

2011－06－15 *通訊聯(lián)系人

胡筱（1988－），女，碩士研究生，研究方向:食品安全。

2009年江蘇省國(guó)際科技合作項(xiàng)目（BZ2009025）。