殷帥文，劉麗萍，王安萍，毛愷俊，熊 欣

15種植物不同溶劑萃取物乙酰膽堿酯酶抑制活性的初步研究

*殷帥文1,2，劉麗萍1，王安萍1,2，毛愷俊1，熊 欣1

（1.井岡山大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，江西，吉安343009；2.江西省生物多樣性與生態(tài)工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西，吉安343009）

采用乙酰膽堿酯酶抑制活性篩選模型，對(duì)采自井岡山及周邊地區(qū)的15種植物（22個(gè)部位）乙醇提取物的不同溶劑萃取物進(jìn)行乙酰膽堿酯酶抑制活性研究。結(jié)果表明：在乙酸乙酯萃取物中，供試質(zhì)量濃度在1 mg/mL時(shí)，大部分植物均表現(xiàn)出一定的乙酰膽堿酯酶抑制活性，其中鐵掃帚、龍爪槐莖、金銀花和女貞葉表現(xiàn)出較強(qiáng)的抑制活性，抑制率均大于70%，其余大部分植物的抑制率均小于40%。在供試質(zhì)量濃度在0.025 mg/mL時(shí)，只有接骨木和南方莢蒾的抑制率大于60%，其余大部分植物的抑制活性均小于 30%；在正丁醇萃取物中，供試質(zhì)量濃度在 1 mg/mL時(shí)，15種植物均具有明顯的乙酰膽堿酯酶抑制活性，其中鐵掃帚、龍爪槐葉、龍爪槐莖和金銀花莖的抑制率均大于85%，其余大部分植物的抑制率均大于40%。供試質(zhì)量濃度在0.025 mg/mL時(shí)，夾竹桃的抑制率大于80%。其余大部分植物的抑制率均小于40%；在石油醚萃取物中，供試質(zhì)量濃度在 1 mg/mL時(shí)，15種植物均具有明顯的乙酰膽堿酯酶抑制活性，其中菜豆、爬山虎葉、南方莢蒾和女貞葉的抑制率均大于90%。供試質(zhì)量濃度在 0.025 mg/mL時(shí)，仍有部分植物表現(xiàn)出較高的乙酰膽堿酯酶抑制活性，其中抑制率大于80%的分別有爬山虎葉、雞眼草、金銀花莖、迎春花莖和葉。另外，有些植物萃取物不僅對(duì)乙酰膽堿酯酶沒有抑制活性，反而表現(xiàn)出一定的增強(qiáng)作用。

植物提取物；乙酰膽堿酯酶；抑制劑；活性評(píng)價(jià)

早老性癡呆癥（又稱阿爾茨海默氏病，Alzheimer’s Disease, AD）是發(fā)生于老年和老年前期以進(jìn)行性神經(jīng)退化為特征的大腦退行性病變，是中樞神經(jīng)系統(tǒng)變行性疾病，其主要臨床表現(xiàn)為進(jìn)行性認(rèn)知功能減退并伴有行為障礙和情緒異常等，嚴(yán)重者直至失去生活自理能力[1-2]。目前的研究認(rèn)為AD是一種多病因疾病，膽堿能假說是目前最為被廣泛接受的病理理論[3-5]。因此，乙酰膽堿酯酶抑制劑（Acetylcholinesterase Inhibitor, AChEI）藥物是目前研究最多、最為活躍的抗早老性癡呆癥藥物[3-7]。其中最具代表性的中樞神經(jīng)性可逆AChEI有第一代的Tacrine(商品名：cognex)，Donepezil (商品名：Acricept), Rivastigmine(商品名：Exelon)，以及第二代的石杉?jí)A甲(HupA)等[3]。

自然界具有豐富的生物資源多樣性，大量研究表明：天然植物藥用成分具有療效好，副作用小，作用面廣，適宜長期服用等優(yōu)點(diǎn)。因而，從藥用植物中尋找具有抗老年性癡呆的乙酰膽堿酯酶抑制劑，已成為當(dāng)今醫(yī)藥研究方面的熱點(diǎn)課題[7-8]。為此，本研究對(duì)采自江西井岡山地區(qū)的15種植物乙醇提取物的不同溶劑萃取物進(jìn)行了乙酰膽堿酯酶抑制活性研究，旨在為發(fā)現(xiàn)天然乙酰膽堿酯酶抑制劑提供線索。

1 　材料與方法

1.1 　植物提取物樣品的制備

本實(shí)驗(yàn)所用的植物樣品均采自江西井岡山地區(qū)，由井岡山大學(xué)周兵老師鑒定，模式標(biāo)本保存于井岡山大學(xué)標(biāo)本館。新鮮的植物材料陰干，磨碎，取上述每種磨碎的植物樣品10 g , 用95％乙醇100 mL浸泡，超聲波提取30 min，過濾，反復(fù)提取3次，合并提取液，減壓濃縮后得乙醇提取物浸膏，將浸膏用分別加入20 mL蒸餾水,再依次加入約30 mL石油醚、乙酸乙酯和正丁醇萃取3次,合并3次萃取液濃縮,分別得石油醚、乙酸乙酯和正丁醇萃取物，稱重,使用前用50％乙醇分別配成40 mg/mL和1 mg/mL濃度(最終測試濃度分別為1 mg/mL和0.025 mg/mL)，備用。

1.2 　儀器

UV2550紫外可見分光光度計(jì)(日本Shimadzu公司)，SC215 超級(jí)數(shù)控恒溫槽(寧波天恒儀器廠) ，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(瑞士BüCHI 公司) 。

1.3 　藥品與試劑

乙酰膽堿酯酶(AChE，Sigma 公司)，50 mmol/ L、pH 8. 0 的磷酸緩沖鹽溶液( PBS)，15 mmol/ L 二硫二硝基苯甲酸(Dithiobisnitrobenzoic acid，DTNB) 溶液(Sigma 公司) (用50 mmol/ L，pH 8.0 PBS配制)，15 mmol/ L 硫代乙酰膽堿(Acetylthiocholine，ATch，Sigma 公司，用50 mmol/ L，pH 8. 0 PBS 配制)，4 %十二烷基硫酸鈉( SDS，Sigma 公司) ，陽性對(duì)照tacrine (Sigma 公司)，其余化學(xué)試劑均為分析純。

1.4 　實(shí)驗(yàn)方法

實(shí)驗(yàn)采用改良的Ellman方法[9]進(jìn)行，簡單介紹如下：2.65 mL PBS(pH 8.0)，50 μL AChE (0.85 U/mL，buffer pH 8.0)，100 μL 15mM DTNB 和樣品溶液 100 μL加入試管，37 ℃預(yù)熱 2 min，然后加入100 μL 15 mM ATch，在 37 ℃保溫 20 min后立即加入1 mL 0.4％SDS 終止反應(yīng)，將所得溶液立即在412 nm下測量吸光值并根據(jù)下式計(jì)算抑制率，

抑制率(％) = [A對(duì)照-(A樣品-A樣品空白)]/ A對(duì)照×100

A對(duì)照是指樣品溶液為沒有添加樣品的50％乙醇溶液時(shí)的吸光值，A樣品是指添加樣品溶液的吸光值，而A樣品空白則表示添加樣品溶液但沒有添加底物ATch 時(shí)的吸光值。所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次并計(jì)算平均值和標(biāo)準(zhǔn)差，陽性對(duì)照為他克林。

2 　結(jié)果

2.1 乙酸乙酯萃取物的乙酰膽堿酯酶抑制活性的研究

對(duì)15種植物乙醇提取物的乙酸乙酯萃取物乙酰膽堿酯酶抑制活性的研究表明(表1)：在供試質(zhì)量濃度在1 g/mL時(shí)，部分植物的乙酸乙酯萃取物均表現(xiàn)出一定的乙酰膽堿酯酶抑制活性，中鐵掃帚、龍爪槐莖、金銀花和女貞葉表現(xiàn)出較強(qiáng)的抑制活性,抑制率均大于70%,其余大部分植物的抑制率均小于40%。在供試質(zhì)量濃度在0.025 mg/mL時(shí)，有接骨木和南方莢蒾的抑制率大于60%，其余大部分植物的抑制活性均小于 30%，至有些植物不僅對(duì)乙酰膽堿酯酶沒有抑制活性，反而表現(xiàn)出一定的增強(qiáng)作用。

表1 15種植物乙酸乙酯萃取物抑制 AChE活性

2.2 正丁醇萃取物的乙酰膽堿酯酶抑制活性的研究

對(duì)15種植物乙醇提取物的正丁醇萃取物乙酰膽堿酯酶抑制活性的研究表明 (表2)：供試質(zhì)量濃度在 1 mg/mL時(shí)，15種植物的正丁醇萃取物均具有明顯的乙酰膽堿酯酶抑制活性，其中鐵掃帚、龍爪槐葉、龍爪槐莖和金銀花莖的抑制率均大于85%，其余大部分植物的抑制率均大于40%。供試質(zhì)量濃度在0.025 mg/mL時(shí)，夾竹桃的抑制率大于80%。其余大部分植物的抑制率均小于40%。

表2 15種植物正丁醇萃取物抑制 AChE活性

2.3 石油醚萃取物的乙酰膽堿酯酶抑制活性的研究

對(duì)15種植物乙醇提取物的石油醚萃取物乙酰膽堿酯酶抑制活性的研究表明(表3)：在供試質(zhì)量濃度在 1 mg/mL時(shí)，15種植物的石油醚萃取物均具有明顯的乙酰膽堿酯酶抑制活性，其中菜豆、爬山虎葉、南方莢蒾和女貞葉的抑制率均大于90%。供試質(zhì)量濃度在 0.025 mg/mL時(shí)，仍有部分植物表現(xiàn)出較高的乙酰膽堿酯酶抑制活性，其中抑制率大于80%的分別有爬山虎葉、雞眼草、金銀花莖、迎春花莖和葉。

表3 15種植物石油醚萃取物抑制 AChE活性

3 　討論

隨著社會(huì)人口的老化，老齡人口不斷增加，老年性癡呆癥發(fā)病率相對(duì)上升，目前,全世界約有 1700~2500萬的人患有此病[10]，癡呆癥與心血管疾病、惡性腫瘤一起已成為老年人致殘、致死的三大疾病[11]。然而，從植物中篩選并開發(fā)出的抗老年性癡呆癥的藥物并不多，系統(tǒng)的進(jìn)行植物乙酰膽堿酯酶抑制活性研究的報(bào)道也很少[12]，本實(shí)驗(yàn)對(duì)采集到的15種植物乙醇提取物的三種溶劑萃取物進(jìn)行了乙酰膽堿酯酶抑制活性研究，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示部分溶劑萃取物具有較高的的抑制乙酰膽堿酯酶活性。例如0.25 mg/mL時(shí), 接骨木和南方莢蒾乙酸乙酯萃取物的抑制率大于60%，夾竹桃的正丁醇萃取物抑制率大于80%，爬山虎葉、雞眼草、金銀花莖、迎春花莖和葉石油醚萃取物的抑制率大于80%。另外，在對(duì)不同溶劑萃取物的比較中，由正丁醇相和石油醚相抑制率比乙酸乙酯相要高，顯示抑制乙酰膽堿酯酶活性成分或許更多的在這兩相溶劑中，極性偏小或偏大，而在中等極性溶劑中則較少。表明這些植物萃取物極有可能含有強(qiáng)抑制乙酰膽堿酯酶活性的成分，對(duì)這些植物進(jìn)行系統(tǒng)深入的化學(xué)成分研究，很有可能從中發(fā)現(xiàn)活性更強(qiáng)的有效成分，從而為防治早老性癡呆癥的藥物研究提供有價(jià)值的活性先導(dǎo)結(jié)構(gòu)。這些植物的進(jìn)一步的活性追蹤、化學(xué)成分分離與結(jié)構(gòu)鑒定工作仍在進(jìn)行中。另外，在乙酰膽堿酯酶抑制活性的研究中，我們研究發(fā)現(xiàn)，部分低濃度提取物對(duì)乙酰膽堿酯酶活性不但沒有抑制作用，反而有一定的增強(qiáng)作用，這種現(xiàn)象在海藻組分[12]和蕨類植物[13]中亦被觀察到，我們的研究進(jìn)一步證明了這種現(xiàn)象的存在。

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PRIMARY STUDY ON THE ACETYLCHOLINESTERASE INHIBITORY ACTIVITY OF DIFFERENT PLANT EXTRACTS

*YIN Shuai-wen1,2, LIU Li-ping1, WANG An-ping1,2, MAO Kai-jun1, XIONG Xin1

(1. School of Life Sciences, Jinggangshan University, Ji’an, Jiangxi 343009, China;2. Key Laboratory for Biodiversity Science and Ecological Engineering of Jiangxi Province, Ji’an, Jiangxi 343009, China)

To research of acetylcholinesterase (AChE) inhibitory activity of 15 plant extracts which collected from Jinggangshan, Jiangxi Province, model of acetylcholinesterase inhibitory activity were used. The results showed that,as ethyl acetate soluble fractions, most of the 15 plants had high inhibitory activity to AChE under the concentration of 1 mg/mL, in which more than 70% inhibiting rates were for,,and, more than 40% for the other plants. However, under the concentration of 0.025mg/mL, the extracts of the most plants had low inhibition rate less than 30%, except thatandhad more than 60% inhibiting rates. As-butyl alcohol soluble fractions, most 15 plants had high inhibitory activity to AChE under the concentration of 1 mg/mL, more than 85% inhibiting rates for,and, and onlyhad more than 80% inhibiting rates under the concentration of 0.025 mg/mL. As petroleum ether soluble fractions, most 15 plants also had high inhibitory activity to AChE under the concentration of 1 mg/mL, 4 plants such as,andhad more than 90% inhibiting rates, 4 plants. still had more than 80% inhibiting rates under the concentration of 0.025 mg/mL. On the contrary, some plant extracts even enhanced this enzyme.

plant extracts; acetylcholinesterase (AChE); inhibiting rates

R931.77/R282.71

A

10.3969/j.issn.1674-8085.2012.04.012

1674-8085(2012)04-0052-05

2012-03-24；

2012-06-06

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（30760031）；江西省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（20114BAB204025）；江西省生物學(xué)高水平學(xué)科項(xiàng)目

*殷帥文(1978-)，男，湖南寧鄉(xiāng)人，副教授，博士，主要從事天然產(chǎn)物研究與開發(fā)(E-mail: shwyin@126.com);

劉麗萍(1988-)，女，江西吉安人，井岡山大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院本科生(E-mail: llp@126.com);

王安萍(1971-)，女，江西吉安人，實(shí)驗(yàn)師，碩士，主要從事天然產(chǎn)物研究與開發(fā)(E-mail: jgkwangap@hotmail.com);

毛愷俊(1990-)，男，江西吉安人，井岡山大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院本科生(E-mail: mkj@126.com);

熊 欣(1990-)，男，江西吉安人，井岡山大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院本科生(E-mail: xx@126.com).