李鐵純，侯冬巖，刁全平，孫 博，回瑞華

(鞍山師范學(xué)院化學(xué)系，遼寧 鞍山 114007)

兩種方法提取林蛙籽脂肪酸的氣-質(zhì)聯(lián)用分析

李鐵純，侯冬巖，刁全平，孫 博，回瑞華

(鞍山師范學(xué)院化學(xué)系，遼寧 鞍山 114007)

采用Bligh-Dyer提取法和Soxhlet提取法分別提取林蛙籽中的脂肪油，再進(jìn)行甲酯化處理，利用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀進(jìn)行分析。Bligh-Dyer法提取的脂肪油中檢測出27種脂肪酸，其中不飽和脂肪酸為16種，相對含量72.49%，二十碳四烯酸甲酯和二十碳五烯酸均為5.72%，二十二碳六烯酸為5.02%，亞油酸為8.89%，二十二碳六烯酸甲酯為5.72%。Soxhlet法提取的脂肪油中檢測出12種脂肪酸，其中不飽和脂肪酸6種，相對含量64.86%，油酸為21.99%，亞油酸為7.58%，二十碳五烯酸為5.22%。

林蛙籽；脂肪酸；氣相色譜-質(zhì)譜

林蛙(Rana chensinensis)俗稱田雞、哈士蟆等[1]，是一種經(jīng)濟(jì)價(jià)值極高的兩棲動物，廣泛分布于我國東北三省。林蛙屬于藥、食兩用的珍貴蛙種，林蛙的蛙籽具有很高的營養(yǎng)價(jià)值，可用于制藥和保健食品，具有調(diào)節(jié)免疫、延緩衰老、壯陽、明目、調(diào)節(jié)血脂和預(yù)防婦女更年期綜合癥的作用[2]。近年來，對林蛙籽營養(yǎng)成分中的甾類激素、氨基酸、微量元素[3-4]等有報(bào)道，而關(guān)于林蛙籽脂肪酸的研究少見報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)采用Bligh-Dyer提取方法和Soxhlet提取法分別對林蛙籽的脂肪油進(jìn)行提取[5-7]，進(jìn)行甲酯化處理，利用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法(gas chromatography-mass spectrometry，GCMS)對其進(jìn)行分析測定[8]，分離鑒定其中的脂肪酸成分，為更好地開發(fā)和利用林蛙籽提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

林蛙采自撫順林蛙養(yǎng)殖場。

石油醚、正己烷、甲醇、氫氧化鈉、氯仿均為分析純。

HP6890GC/5973MS型氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀 美國惠普公司；80-2B臺式離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠；RE-52C旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 上海亞榮盛華儀器廠。

1.2 方法

1.2.1 樣品前處理

將林蛙清洗后自然晾干，解剖取出蛙籽，干燥，研碎后備用。

1.2.2 Bligh-Dyer法提取脂肪油

稱取5.00g經(jīng)1.2.1節(jié)方法處理的蛙籽，放入250mL錐形瓶中，加入100mL甲醇，50mL氯仿，40mL蒸餾水，電磁攪拌10h放置過夜后，加入50mL氯仿，50mL蒸餾水，過濾后分液取下層有機(jī)相，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)回收氯仿，得油率為30.8%。

1.2.3 Soxhlet提取法提取脂肪油

稱取5.00g經(jīng)1.2.1節(jié)方法處理的蛙籽，放入濾紙筒中，再裝入索氏提取器中，加入100mL的石油醚，恒溫水浴70℃回流萃取5h，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)回收石油醚，得油率為32.4%。

1.2.4 脂肪油的甲酯化

分別將提取的脂肪油加入8.0mL正己烷，再加入4.0mL氫氧化鈉-甲醇溶液液(0.5mol/L)，置水浴上70℃回流20min，取出冷卻移至刻度試管中，再加水10mL，超聲提取、離心、取上層清液，待做GC-MC分析。

1.2.5 GC-MC條件

色譜條件：色譜柱為彈性石英毛細(xì)管HP-5(25m× 0.20mm，0.33μm)；進(jìn)樣口溫度：300℃；程序升溫：初始溫度100℃然后以10℃/min速率升溫至280℃(保持10min)；分流比：50:1；進(jìn)樣量：0.4μL；載氣流量：1mL/min。

質(zhì)譜條件：電子離子源、離子源溫度230℃、電離電壓70eV、電子倍增器電壓1988V、發(fā)射電流34.6μA、接口溫度150℃、質(zhì)量范圍為20～500m/z。

1.2.6 測定方法

取經(jīng)1.2.4節(jié)方法處理過的樣品0.4μL，用GC-MS進(jìn)行分析鑒定，通過G1701BA化學(xué)工作站數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)，檢索NIST 98譜圖庫，并分別與八峰索引及EPA/ NIH質(zhì)譜圖集的標(biāo)準(zhǔn)譜圖進(jìn)行對照[9]，確定樣品中各個(gè)化學(xué)成分。通過G1701BA化學(xué)工作站數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)，按峰面積歸一化法進(jìn)行定量分析，分別求得各化學(xué)成分的相對含量。

2 結(jié)果與分析

表1 林蛙籽脂肪酸甲酯的組成及相對百分含量Table 1 Fatty acid methyl esters and relative contents in eggs of R. chensinensis

樣品經(jīng)過GC-MS分析鑒定，得到林蛙籽脂肪酸甲酯的總離子流圖(圖1)。確認(rèn)的樣品中脂肪酸甲酯成分及相對含量見表1。

表1表明，Bligh-Dyer法提取的林蛙籽脂肪油中共檢測出27種脂肪酸，其中不飽和脂肪酸16種，相對含量72.49%，二十碳四烯酸甲酯和二十碳五烯酸均為5.72%，二十二碳六烯酸為5.02%，亞油酸為8.89%，還檢測出二十二碳六烯酸甲酯為5.72%。Soxhlet法提取的脂肪油中檢測出12種脂肪酸，其中不飽和脂肪酸6種，相對含量64.86%，油酸為21.99%，亞油酸為7.58%，二十碳五烯酸為5.22%。

圖1 Bligh-Dyer法(A)和索式提取法(B)處理林蛙籽脂肪酸甲酯總離子流圖Fig.1 TIC of fatty acid methyl ester in eggs of R. chensinensis by Bligh-Dyer (A) and soxhle (B)

3 討 論

Bligh-Dyer法提取脂肪油得油率為30.8%，Soxhlet提取法提取脂肪油得油率為32.4%，Soxhlet提取法略高于Bligh-Dyer法提取脂肪油的得油率。Bligh-Dyer法提取的林蛙籽脂肪油中共檢測出27種脂肪酸，不飽和脂肪酸16種；Soxhlet提取法提取的脂肪油中檢測出12種脂肪酸，不飽和脂肪酸6種。說明Bligh-Dyer法提取的林蛙籽脂肪油中所含有的脂肪酸不僅種類多于Soxhlet提取法，而且不飽和脂肪酸相對含量較高于Soxhlet提取法，其主要原因是：采用Soxhlet提取法，在加熱條件下不飽和脂肪酸特別是多不飽和脂肪酸化學(xué)性質(zhì)不穩(wěn)定，容易被氧化。采用Bligh-Dyer法，在室溫條件下進(jìn)行提取，避免了脂肪酸在提取過程中的損失。

Bligh-Dyer法提取的林蛙籽脂肪油中檢測出二十碳五烯酸(EPA)為5.72%，二十二碳六烯酸(DHA)為5.02%，Soxhlet提取法提取的林蛙籽脂肪油中只檢測出EPA為5.22%，而未檢測出DHA。EPA和DHA具有不同的生理活性，不同人對EPA和DHA的食用是有選擇性的，以健腦益智恢復(fù)視力為目的需要補(bǔ)充較多的DHA，以促進(jìn)心腦血管循環(huán)為目的需要補(bǔ)充較多的EPA。

兩種方法提取的林蛙籽脂肪油中不飽和脂肪酸含量均較高，研究表明，多不飽和脂肪酸具有降低膽固醇、降低血液黏稠度、改善血液微循環(huán)、提高腦細(xì)胞的活性、增強(qiáng)記憶力和思維能力，對心腦血管疾病起到預(yù)防作用[10-15]。本實(shí)驗(yàn)為林蛙籽的進(jìn)一步開發(fā)提供一定的科學(xué)依據(jù)。

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Analysis of Fatty Acids inRana chensinensisEggs by Two Different Extraction Methods Combined with GC-MS

LI Tie-chun，HOU Dong-yan，DIAO Quan-ping，SUN Bo，HUI Rui-hua
(Department of Chemistry, Anshan Normal University, Anshan 114007, China)

The egg oil ofRana chensinensiswas extracted by Bligh-Dyer method or Soxhlet extraction method, methyl esterfied, and then analyzed by gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS). A total of 27 fatty acids were identified in the egg oil obtained by Bligh-Dyer method, including 16 unsaturated fatty acids (72.49%), such as arachidonic acid methyl ester (5.72%), eicosapentaenoic acid (5.72%), docosahexaenoic acid (5.02%), 9,12-octadecadienoic acid (8.89%), and 5,8,11,14-eicosatetraenoic acid (5.72%). Twelve fatty acids were identified by Soxhlet extraction method combined with GC-MS, comprising 6 unsaturated fatty acids (64.86%), such as 9-octadecenoic acid (21.99%), 5,8,11,14,17-eicosapentaenoic acid (7.58%) and 9,12-octadecadienoic acid (5.22%).

Rana chensinensiseggs；fatty acid；gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS)

O657.63

A

1002-6630(2012)18-0195-03

2011-06-23

遼寧省教育廳科學(xué)技術(shù)基金項(xiàng)目(20331079)

李鐵純(1969—)，男，教授，博士，主要從事有機(jī)分析及天然產(chǎn)物化學(xué)研究。E-mail：tiechunli@163.com