田福亮，吳劍鋒，夏永祥△

（1.南京師范大學生命科學學院 210046；2.南京醫(yī)科大學附屬南京第一醫(yī)院 210006）

化膿性鏈球菌高毒力株特異基因文庫的構(gòu)建和分析＊

田福亮1，吳劍鋒2，夏永祥2△

（1.南京師范大學生命科學學院 210046；2.南京醫(yī)科大學附屬南京第一醫(yī)院 210006）

目的構(gòu)建化膿性鏈球菌高毒力株特異基因文庫，克隆和篩選化膿性鏈球菌高毒力株特異表達基因。方法采用抑制消減雜交技術(shù)（SSH），以從患者體內(nèi)所分離鏈球菌為毒力菌株，分離特異表達基因，將其與T載體進行T/A連接構(gòu)建文庫，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌TOP10進行文庫擴增后，轉(zhuǎn)化菌液涂布于LB固體平板，構(gòu)建化膿性鏈球菌毒力株特異基因消減文庫，用斑點雜交初步篩選消減文庫后，將獲得的陽性克隆進行測序和同源性分析。結(jié)果酶切產(chǎn)物為100～2 000bp，連接效率大于50%，消減組與非消減組差異明顯，成功構(gòu)建了化膿性鏈球菌毒力株特異基因消減文庫，所得陽性克隆經(jīng)斑點雜交篩選后測序，與Genebank數(shù)據(jù)庫進行同源性比對，5個未知序列可能為新基因，7個與已知基因有高度的同源性。結(jié)論用SSH及T/A克隆技術(shù)成功構(gòu)建了人源化膿性鏈球菌高毒力株基因文庫，5個未知的新序列有待于進一步的研究。

鏈球菌，化膿；抑制消減雜交；毒力基因；基因消減文庫

A群鏈球菌又稱化膿性鏈球菌［1］，主要引起化膿性炎癥，以上呼吸道感染為主。引起的主要疾病有扁桃體炎、咽炎、蜂窩組織炎、亞急性細菌性心內(nèi)膜炎及產(chǎn)褥感染等。因鏈球菌的M蛋白與心肌、腎小球基底膜有共同的抗原，可引起風濕熱和急性腎小球腎炎等超敏反應(yīng)性疾病；同時，可引起猩紅熱、毒性休克綜合征等中毒性疾病，嚴重威脅人類的健康［2］。Zhang等［3］研究認為一些菌株的毒性強于其他菌株可能與菌株的毒力變異有關(guān)。比較毒力株和標準菌株的基因組DNA，鑒別差異基因，有助于對感染性疾病分子發(fā)病機制進一步深入了解，并為臨床診斷和治療提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 化膿性鏈球菌取自南京市第一醫(yī)院化膿性鏈球菌感染患者（征得患者同意）；標準菌株采購于中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心（CICC），菌種編號為10373；抑制消減雜交試劑盒購自Cloth公司；細菌基因組提取試劑盒購自海門市碧云天公司；異丙基－β－D－硫代半乳糖苷（IPTG）、5－溴－4－氯－3－吲哚－β－D－半乳糖（X－GAL）購于Sigma公司；氨芐青霉素（AMP）購自Promega公司；感受態(tài)大腸桿菌TOP10購自Takara公司；PMD18T載體購自Takara公司；PCR產(chǎn)物純化試劑盒購自O(shè)－mega公司。

1.2 方法

1.2.1 細菌培養(yǎng) 在血瓊脂固體培養(yǎng)基上接種化膿性鏈球菌，放置于溫度培養(yǎng)箱里37℃、5%CO2培養(yǎng)過夜。

1.2.2 細菌基因組DNA的提取 根據(jù)細菌基因組提取試劑盒操作手冊，分別對毒力菌株和標準菌株提取基因組DNA，并用紫外分光光度計對所提取的基因組DNA進行濃度、純度測定。

1.2.3 抑制消減雜交技術(shù)（SSH） 應(yīng)用PCR－Select基因組消減試劑盒，并按其說明書進行。對毒力菌株和標準菌株進行基因組消減雜交，包括兩個菌株的基因組DNA酶切，接頭連接及其效率分析，兩輪消減雜交，兩輪選擇性PCR擴增，并且對比消減組和非消減組，以對消減效率進行檢測。

1.2.4 PCR產(chǎn)物的T－A克隆 應(yīng)用 Advantage PCR cloning試劑盒，并按其說明書進行。取2μL第2輪PCR產(chǎn)物與2μL線性化的PMD18－T載體混合，在1μL T4DNA連接酶的作用下，14℃連接16h，－20℃保存。取10μL連接反應(yīng)產(chǎn)物與100μL感受態(tài)細菌TOP10混勻于離心管中，用熱激法將連接產(chǎn)物導(dǎo)入感受態(tài)大腸桿菌TOP10，向離心管中加入890 μL LB培養(yǎng)基，混勻后置于搖床，37℃，150r/min培養(yǎng)45 min，涂布200μL菌液在含有100μg/mL氨芐青霉素 X－gal/IPTG瓊脂平板上，37℃培養(yǎng)18h。隨機挑選直徑大于1mm的白色克隆，點種于含100μg/mL氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基的96孔板中，37℃培養(yǎng)過夜，加15%甘油，－70℃保存。

1.2.5 菌液斑點雜交篩選 ?。?0℃保存菌株，點種于含100μg/mL氨芐青霉素LB培養(yǎng)基的96孔板中，37℃培養(yǎng)過夜。取1μL菌液接種于尼龍膜 （Roche），在含100μg/mL氨芐青霉素瓊脂平板上37℃培養(yǎng)18h，尼龍膜上的菌斑經(jīng)變性、中和、80℃固定2h后備用。取純化的正向和反向消減雜交第2輪PCR產(chǎn)物各80ng（3μL），用5μL［α－32p］d－ATP隨機引物法標記純化后備用。42℃預(yù)雜交1h、雜交18h后，洗膜（58℃，2×檸檬酸鈉緩沖液（SSC），0.5% 十二烷基磺酸鈉（SDS）、，20min 2次，58 ℃，0.2×SSC，0.5%SDS，20min 2次），－70℃放射自顯影12h。

1.2.6 陽性克隆的測序與同源性分析 取斑點雜交初步篩選的陽性克隆，用nested primer1和nested primer 2R為引物，進行PCR擴增，2%瓊脂糖凝膠電泳分析確認有插入片段后，以M13為正向引物，PE ABI PRISM 3700測序儀測序 （上海英駿生物技術(shù)有限公司代理）。測序結(jié)果用Primer5.0分析后，在 Genebank（http：//www.ncbi.nlm.gov/BLAST）中進行序列同源性檢索分析。

2 結(jié) 果

2.1 細菌基因組DNA的提取 經(jīng)過紫外分光光度計測定，濃度分別為120、160ng/μL，光密度值（OD）260/280分別為1.73，1.81，取5μL基因組DNA 2%瓊脂糖凝膠電泳。

圖1 細菌基因組DNA的提取

2.2 消減效率的分析 將消減和非消減的18、23、28、33個循環(huán)產(chǎn)物2%瓊脂糖凝膠電泳分析，結(jié)果如圖2，未消減過的產(chǎn)物在18cycles時就已出現(xiàn)清晰條帶，消減過的在28個循環(huán)時才出現(xiàn)條帶，表明消減效果理想。

2.3 消減雜交文庫 200μL轉(zhuǎn)化菌液涂布的平板上約有300多個白色菌落生長，菌落清晰飽滿，白色菌落占總菌落的60%以上，說明消減文庫構(gòu)建成功，隨機挑取100個白色菌落建成化膿性鏈球菌毒力株基因消減文庫。

2.4 消減雜交文庫的構(gòu)建篩選結(jié)果 100μg/mL氨芐青霉素/X－gal/IPTG瓊脂平板上，37℃培養(yǎng)18h后，平板可見254個白色及藍色菌落生長，以白色菌落為主（約占80%），菌落飽滿清晰，直徑1mm左右。隨機挑選175個白色菌落，保存。斑點雜交信號對比，獲得 A1、A2、A6、B5、C5、C7、D3、E4、E8、F5、G5、H2共12個差異基因片段，且這12個基因片段均表現(xiàn)為毒力株DNA片段標記的探針信號增強，結(jié)果如圖3。

2.5 DNA測序與同源性分析結(jié)果 對12個含有差異基因片段的陽性克隆進行M13雙向引物測序，與Genebank數(shù)據(jù)庫初步比對，結(jié)果顯示12個差異片段中有5個未檢索到同源序列，其余7個序列均與已知基因有高度的同源性，結(jié)果如表1。

圖2 消減效率分析

圖3 斑點雜交篩選結(jié)果

3 討 論

研究微生物致病機制的首要前提是識別和分離其毒力基因［4］。Diatehenko等［5］于1996年提出SSH，該技術(shù)最初用于腫瘤細胞與正常細胞基因組或cDNA差異的研究，后來被推廣到微生物領(lǐng)域。SSH已經(jīng)應(yīng)用于許多致病菌毒力基因的發(fā)現(xiàn)，SSH被用于嗜水氣單胞菌［3］、尿毒性大腸桿菌菌株536［6］、豬鏈球菌2型強毒株［7］、副豬嗜血桿菌［8］、海德爾堡沙門菌［9］、肺炎鏈球菌［10］、雞瘟沙門菌［11］毒力基因的發(fā)現(xiàn)，都得到了理想的效果。SSH 目前還被應(yīng)用于鑒定細菌［12］、鑒定毒力島［13］、發(fā)現(xiàn)插入序列及構(gòu)建檢測探針［14］等多方面，表明該技術(shù)是一個簡單且有效的鑒定細菌間遺傳差異的方法。

本研究首次將SSH技術(shù)應(yīng)用于化膿性鏈球菌毒力株特異基因的研究，以標準菌株作為對比材料，嚴格檢測基因組DNA提取質(zhì)量，基因組DNA酶切，接頭連接，兩輪消減雜交及兩次抑制PCR等反應(yīng)步驟，使Tester與Driver中共有的基因片段得到消減，存在于Tester中的特異基因得到特異性擴增。通過T/A克隆技術(shù)，將兩輪擴增PCR產(chǎn)物純化后直接與T載體連接，成功構(gòu)建化膿性鏈球菌毒力株特異基因文庫，并且通過M13雙向引物測序，與Genebank數(shù)據(jù)庫BLAST比對得到了12個差異基因片段，7個序列均與已知基因有高度的同源性，包括了鏈球菌激酶、鏈球菌補體抑制劑、C5a肽酶、致熱外毒素C、DNA促螺旋酶等，有5個未檢索到同源序列，這些未知的序列有待于進一步的研究，期望對治療化膿性鏈球菌感染有所幫助。

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Construction and analysis of virulence genes subtracted library of streptococcus pyogenes by suppression subtractive hybridization＊

TianFuliang1，WuJianfeng2，XiangYongxiang2△
（1.DepartmentofLifeSciences，NanjingNormalUniversity，Nanjing，Jiangsu210046，China；2.AffiliatedNanjingFristHospital，NanjingMedicalUniversity，Nanjing，Jiangsu210006，China）

ObjectiveTo construct the virulence genes subtracted library of streptococcus pyogenes and to lay the foundations for screening the virulent genes.MethodsSuppression subtractive hybridization was adopted to isolate the fragments of virulence genes in streptococcus pyogenes.Then these fragments were directly inserted into T/A cloning vector to set up subtractive library and amplication of the library was carried out with transformation of E.coil TOP10.Dot blot was used to screen the subtracted library，the differentially expressed cDNA fragments were sequenced and analyzed in Genebank with Blast search.ResultsA smear ranged from 100～2 000bp was observed.The ligation efficiency of tester DNA with adaptor was at least higher than 50percent.The difference between subtractive group and unsbtractive group was apparently significant.Partial positive clones in the library were randomly selected and successfully sequenced.5/12sequence showed no homology and presumably represent unknown genes，7/12had a high similarity to the known genes.ConclusionThe virulence genes subtracted library of streptococcus pyogenes is constructed successfully with SSH and T/A cloning techniques.The library is efficient and lays solid foundation for screening and cloning new and specific virulence genes of streptococcus pyogenes.

streptococcus pyogenes；suppression subtractive hybridization；virulence genes；subtracted library

10.3969/j.issn.1671－8348.2012.06.004

A

1671－8348（2012）06－0529－03

南京市衛(wèi)生局醫(yī)學科技發(fā)展基金資助項目 （YKK07047）?！?通訊作者，E－mail：18951670130＠189.cn。

2011－06－11

2011－11－07）