鐘國成，李小紅 綜述，朱 波校審

（第三軍醫(yī)大學(xué)新橋醫(yī)院全軍腫瘤研究所，重慶 400037）

隨著現(xiàn)代免疫學(xué)向分子水平的研究不斷深入，T淋巴細胞（T－lymphocyte，簡稱T細胞）在免疫系統(tǒng)中發(fā)揮的作用也越來越受到重視。T細胞是淋巴細胞的主要組分，在抗感染、抗腫瘤及自身免疫應(yīng)答中均發(fā)揮著關(guān)鍵作用。T細胞的發(fā)育成熟是一個反復(fù)篩選與淘汰的復(fù)雜過程，受到多種因素的精細調(diào)控。近年來，微RNA（microRNA，miRNA）的功能和作用正逐漸成為學(xué)者們關(guān)注的重點。借助對miRNA基因水平的研究，將有力地促進闡明T細胞發(fā)育的調(diào)控機制［1］。本文就miRNA調(diào)控T細胞發(fā)育的相關(guān)研究進展做一綜述，并探討miRNA對T細胞發(fā)育調(diào)控的特點和應(yīng)用前景。

1 T細胞發(fā)育概述

T細胞源于骨髓造血干細胞（hematopoietic stem cells，HSCs）。HSCs首先分化為多能祖細胞，然后經(jīng)淋巴途徑向淋巴祖細胞分化。淋巴祖細胞中T細胞祖細胞（Pro－T）經(jīng)血循環(huán)進入胸腺發(fā)育成T細胞前體細胞（Pre－T），隨后發(fā)育成胸腺細胞。胸腺是T細胞主要的發(fā)育器官，摘除胸腺將導(dǎo)致嚴重的免疫缺陷。T細胞發(fā)育的胸腺依賴性提示胸腺為T細胞提供了適宜的微環(huán)境和發(fā)育信號［2］。

胸腺細胞始于CD4－CD8－雙陰性T細胞（double negative，DN），此時細胞表面已表達CD3和T細胞受體（T cell receptor，TCR），然后經(jīng)CD4＋CD8＋雙陽性細胞（double positive，DP）發(fā)育為成熟的 CD4＋或 CD8＋單陽性（single－positive，SP）細胞。發(fā)育過程中不能與自身主要組織細胞相容性復(fù)合體（major histocompatibility complex，MHC）結(jié)石的T細胞將被誘導(dǎo)凋亡，即陽性選擇，它賦予T細胞MHC限制性（識別由自身MHC呈遞的抗原而不識別其他MHC呈遞的抗原）；而與自身MHC或自身抗原結(jié)合過強的T細胞也會被誘導(dǎo)凋亡，即陰性選擇，它賦予T細胞對自身抗原的耐受性［3］。胸腺每天能產(chǎn)生約1×107個胸腺細胞，最終僅有1%～3%的胸腺細胞能發(fā)育成SP細胞。

由此可見，T細胞發(fā)育是一個十分復(fù)雜的過程，需要一個龐大的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)參與，以確保成熟T細胞在數(shù)量上保持動態(tài)平衡，同時正確執(zhí)行免疫功能，不會忽視抗原或是攻擊自身組織，維持適宜的免疫強度。miRNA是調(diào)控T細胞發(fā)育的一個重要因素，其調(diào)控作用已引起了研究者的濃厚興趣。

2 miRNA概述

miRNA是一組進化保守的調(diào)控性小分子RNA，無編碼蛋白質(zhì)作用，能通過干擾靶向信使RNA（messenger RNA，mRNA）的穩(wěn)定或翻譯而調(diào)節(jié)基因表達。miRNA先由RNA聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄成含帽子結(jié)構(gòu)和多聚腺苷酸尾巴的初始RNA（primiRNA）。pri－miRNA經(jīng)胞核內(nèi) RNA聚合酶Ⅲ（RNaseⅢ）Drosha在雙鏈RNA－結(jié)合蛋白DGCR8／Paha的作用下加工成長約70核苷酸（nt）的pre－miRNA。轉(zhuǎn)運蛋白Exportin5依賴Ran－GTP將pre－miRNA從細胞核轉(zhuǎn)運至細胞質(zhì)，RNaseⅢ酶Dicer將pre－miRNA剪切成約22nt的雙鏈miRNA。兩條鏈迅速解螺旋，其中一條很快降解，而另一條鏈作為成熟miRNA形成RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合物（RNA－induced silencing complex，RISC）而發(fā)揮調(diào)節(jié)作用。當miRNA與靶向mRNA的3′UTR完全互補時，RISC中的Argonaute2會降解mRNA而起到調(diào)節(jié)作用；如果部分互補將通過抑制mRNA翻譯來發(fā)揮調(diào)節(jié)功能［4］。

近年來，通過基因芯片和深度測序技術(shù)對T細胞成熟過程中不同階段miRNA的鑒定表明:確實有部分miRNA在T細胞發(fā)育過程中出現(xiàn)顯著的變化，這種特定miRNA豐度的動態(tài)變化可以作為界定各個發(fā)育階段的特異性指標。

3 miRNA對T細胞發(fā)育過程的調(diào)控

miRNA對T細胞發(fā)育的調(diào)控可大致分為胸腺內(nèi)調(diào)控和胸腺外調(diào)控，其中前者是主要調(diào)控場所，是調(diào)控的上游，決定T細胞發(fā)育的命運。在胸腺內(nèi)，參與T細胞發(fā)育調(diào)控的miRNA構(gòu)成了一個復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，彼此調(diào)節(jié)與制約，與胸腺內(nèi)環(huán)境形成緊密聯(lián)系，在適當?shù)臅r間精確控制T細胞的發(fā)育過程。miRNA在胸腺內(nèi)的調(diào)控將參與產(chǎn)生SP細胞的數(shù)目，T細胞的MHC限制性、自身抗原耐受性、對抗原的親和力、存活時間以及增殖和應(yīng)答潛能；而miRNA在胸腺外的調(diào)控相對于胸腺內(nèi)簡單，影響因素較少，可視為對胸腺內(nèi)調(diào)控的補充或細化，主要參與調(diào)控外周T細胞的增殖、分化方向以及執(zhí)行免疫功能的強弱。

3.1 Dicer酶 Dicer酶是一種類似RNaseⅢ的生成關(guān)鍵酶，它對于小分子干擾RNA和miRNA的產(chǎn)生是不可或缺的，Dicer酶能將miRNA前體（發(fā)夾RNA）加工為成熟的miRNA。缺乏Dicer酶將導(dǎo)致miRNA銳減（包括miRNA－150、miRNA－21、miRNA－103、miRNA－29、miRNA－155等）。研究發(fā)現(xiàn) T 細胞特異性Dicer酶的缺乏會顯著減少T細胞數(shù)量，盡管CD4＋與CD8＋T細胞的比例變化不大；Muljo等［5］發(fā)現(xiàn)，在小鼠的胸腺組織中去掉Dicer酶，將導(dǎo)致外周血T細胞發(fā)育嚴重障礙，細胞內(nèi)miRNA加工缺陷，面對抗原的刺激難以正常增殖，而且會迅速凋亡。缺乏Dicer酶的Th細胞會偏向分泌IFN－γ，傾向Th1方向分化，這提示Dicer對于抑制Th1細胞的分化是必需的。Dicer酶能夠有效誘導(dǎo)Foxp3（forkhead box P3）轉(zhuǎn)錄因子的生成，對于胸腺中調(diào)節(jié)性T細胞（regulatory T cells，Treg）的發(fā)育具有重要作用。缺乏Dicer酶將因為無法正常產(chǎn)生Foxp3而抑制轉(zhuǎn)化生長因子（transforming growth factor，TGF）－β介導(dǎo)的Treg的產(chǎn)生，喪失抑制性調(diào)控功能，促使Treg高表達效應(yīng)性T細胞的表面分子，最終誘發(fā)致死性的自身免疫［6］。在這個過程中，具體有哪些miRNA參與的機制還不清楚，但可以明確miRNA－155和miRNA－27b在其中發(fā)揮了主要作用。此外，缺乏Dicer酶還會導(dǎo)致Th17（一種不同于Th1、Th2和Treg的CD4＋亞群細胞，主要分泌IL－17，參與自身免疫性腦脊髓炎的發(fā)生）無法誘導(dǎo)產(chǎn)生［7］。

3.2 miRNA－17～92簇 miRNA－17～92簇由一組多順反子性miRNA組成，位于人類染色體13q31，包括 miRNA－17，miRNA－18a、miRNA－19a、miRNA－20a、miRNA－196－1和 miRNA－92這6個miRNA，在組織結(jié)構(gòu)中高度保守。miRNA－17～92已被證實在腫瘤發(fā)生中發(fā)揮重要作用。在淋巴細胞系中，miRNA－17～92于前體T細胞高表達，成熟之后表達減少。實驗發(fā)現(xiàn)，miRNA－17～92轉(zhuǎn)基因小鼠外周幾乎所有的淋巴細胞亞群都有擴增，其中以CD4＋T細胞增生最為顯著［8］。miRNA－17～92高表達轉(zhuǎn)基因小鼠的T細胞在體外的增殖和存活能力都明顯提高，敲除miRNA－17～92將導(dǎo)致嚴重的T細胞發(fā)育障礙和迅速凋亡。進一步研究發(fā)現(xiàn)，miRNA－17～92作用的靶點（負調(diào)控）可能是PTEN（一種腫瘤抑制基因）和Bim（促凋亡因子），在miRNA－17～92高表達的T細胞中Bim明顯下調(diào)，但是聯(lián)合PTEN和Bim還不足以完全模擬miRNA－17～92過表達的實驗?zāi)Ｐ?，因此分析在調(diào)控T細胞發(fā)育過程中可能有其他不同的靶位參與［9］。另外，miRNA－17～92對CD8T細胞的具體調(diào)控機制目前尚不清楚。

3.3 miRNA－142和 miRNA－223 miRNA－142定位于17號染色體中一個和侵襲性B淋巴細胞白血病相關(guān)的位點。Ramkissoon等［10］研究發(fā)現(xiàn)，miRNA－142在胸腺、脾臟及骨髓中高表達，而在其他組織中表達很低，其調(diào)控作用似乎僅限于造血細胞。目前研究認為，miRNA－142對T細胞發(fā)育的調(diào)控主要發(fā)生在SP階段向初始T細胞發(fā)育的過程中，而在其他階段未發(fā)現(xiàn)有調(diào)控作用。過量表達的miRNA－142能顯著改變T細胞的分化發(fā)育，促進初始T細胞增殖30%～40%以上，而對B淋巴細胞則無明顯影響［11］。miRNA－223主要表達于骨髓，單核細胞、粒細胞，在T細胞中低表達，它主要參與調(diào)控粒細胞的發(fā)育，但過表達的miRNA－223也能促進T細胞的發(fā)育和增殖［12］。

3.4 miRNA－181a miRNA－181a在調(diào)控B淋巴細胞方面發(fā)揮重要作用，同時也參與T細胞的發(fā)育。研究發(fā)現(xiàn)，miRNA－181a在骨髓、胸腺以及富含T細胞的一級淋巴組織中高表達。如果造血干細胞和祖細胞中高表達miRNA－181a，將導(dǎo)致外周CD8＋T細胞的明顯下降。在小鼠移植模型中，高表達的miRNA－181a將導(dǎo)致外周T細胞減少50%以上，其中CD8＋T細胞減少88%，這提示miRNA－181a對T細胞發(fā)育發(fā)揮重要作用。

Neilson等［13］系統(tǒng)研究了 T 細胞在 DN1、DN2、DN3、DN4、DP、SP等不同發(fā)育階段miRNA－181a的表達情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)miRNA－181a在DN和DP階段表達量最高，而在之后其他階段逐漸下調(diào)。miRNA－181a在胸腺細胞DP階段的豐度，是成熟T細胞中的10倍以上。高表達的miRNA－181a能增強TCR的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，促進DN，DP階段不成熟T細胞與胸腺MHC分子結(jié)合，保證陽性選擇和陰性選擇的順利完成。熒光素酶實驗顯示，在DP階段，miRNA－181a能夠抑制一些淋巴細胞成熟過程中參與陽性選擇的基因表達，比如bcl－2、CD69和TCR。Li等［14］發(fā)現(xiàn)，在成熟T細胞高表達 miRNA－181a會提高TCR與抗原的親和力，如果抑制未成熟T細胞miRNA－181a的表達將降低T細胞對抗原肽的敏感性，并破壞T細胞陽性選擇和陰性選擇，這與miRNA－181a在DN和DP高表達，而在T細胞成熟過程中下調(diào)一致。事實上，miRNA－181a對TCR與抗原的親和力具有重要的調(diào)節(jié)作用，它能調(diào)控多個靶標，主要包括抑制TCR信號通路中在下游起負性調(diào)節(jié)作用中的酪氨酸蛋白磷酸酯酶（如SHP－2，PTPN22，DUSP5和DUSP6），通過磷酸化作用激活兩個TCR信號通路分子，即淋巴細胞特異性蛋白酪氨酸激酶（lymphocyte－specific tyrosine kinase，LCK）和細胞外信號調(diào)控激酶（extracellular signal regulated kinase，ERK）進而增強TCR的信號強度。另一方面，TCR的信號通路能負反饋抑制miRNA－181a的表達，TCR與抗原結(jié)合后1h內(nèi)，miRNA－181a的表達會迅速下調(diào)。通過miRNA－181a對胸腺T細胞發(fā)育的這種精細調(diào)控機制，使成熟初始T細胞的TCR針對不同抗原具有適宜的親和力［15］。

3.5 miRNA－155 miRNA－155具有類似癌基因的特性，與腫瘤發(fā)生關(guān)系密切，是目前人類淋巴瘤中發(fā)現(xiàn)的惟一獨立致癌miRNA，最初被命名為B細胞整合簇。Georgantas等［16］發(fā)現(xiàn)，miRNA－155在造血干細胞中有一定的表達，而成熟造血細胞的miRNA－155卻明顯下降，但在一些血液系統(tǒng)惡性腫瘤中高表達。研究證實，miRNA－155高表達能使T細胞在小鼠骨髓內(nèi)的增殖紊亂，而敲除miRNA－155的CD4＋T細胞雖然在增殖方面沒有明顯變化，但發(fā)育的T細胞識別抗原后無法分泌正常的IL－2和IFN－γ，而且容易發(fā)生凋亡，嚴重削弱Treg維持自身動態(tài)平衡的能力和增殖潛能。FOXP3是Treg發(fā)育和功能所必需的轉(zhuǎn)錄因子，可以直接控制miRNA－155的表達。miRNA－155在Treg中的表達水平要高于其他T細胞亞群，一般認為，miRNA－155對于維持Treg存活、分泌抑制性細胞因子是非常重要的，它通過作用靶點細胞因子信號抑制物1（suppressor of cytokine signalling 1，SOCS1。該通路能通過IL－2、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、轉(zhuǎn)尿激活因子5，STAT5信號傳導(dǎo)通路促進細胞增殖）發(fā)揮作用［17－18］。

3.6 其他miRNA的調(diào)控作用 與miRNA－181a相似，miRNA－350在T細胞發(fā)育的DP階段高表達，而在之后的發(fā)育過程中急劇下降。miRNA－16在單核細胞、中性粒細胞和CD8＋T、CD4＋T等多數(shù)細胞和組織中高表達，推測其在調(diào)控細胞周期上具有重要的作用。miRNA－150可能通過作用靶位轉(zhuǎn)錄因子c－Myb，而參與調(diào)控 T細胞發(fā)育。另外，miRNA－669c和miRNA－297在CD4＋T細胞階段特異性高表達；miRNA－15b、miRNA－150、miRNA－24和 miRNA－27在 CD8＋T 細胞特異性高表達［19］；而 miRNA－223和 miRNA－146在 Treg高表達［20］，考慮這些miRNA更多地參與T細胞分化的調(diào)控，其具體的作用機制尚需要進一步探討。

4 miRNA在對T細胞發(fā)育調(diào)控的特點和應(yīng)用前景

miRNA對T細胞發(fā)育過程的調(diào)控機制非常復(fù)雜。每一種miRNA具有多個潛在的作用靶點（如miRNA－17～92可以達到上百種），在適宜的時間發(fā)揮不同的作用；同時miRNA還受到其他多種分子的調(diào)控和反饋，在完成某一階段的調(diào)控任務(wù)后會及時停止。T細胞的發(fā)育需要多種miRNA在不同時間共同作用，單一miRNA很難與T細胞發(fā)育的特定階段嚴格對應(yīng)，參與調(diào)控的miRNA之間并非獨立工作，而是互相影響，既可以發(fā)揮疊加作用，也可以彼此拮抗。正是由于這種多元化調(diào)控機制，才能實現(xiàn)T細胞發(fā)育的精細與準確，保證發(fā)育成熟的T細胞不會攻擊自身組織，而是正確識別感染和腫瘤抗原后予以消滅，并在清除抗原后及時控制免疫強度，避免免疫升級而傷害自身組織，最終保持整個免疫系統(tǒng)的穩(wěn)定和平衡。

T細胞發(fā)育過程中獲得的MHC限制性與自身耐受、自身免疫疾病、過敏性疾病、免疫缺陷病以及腫瘤發(fā)生密切相關(guān)，深入研究miRNA對于T細胞發(fā)育的調(diào)控并進行干預(yù)將為這些疾病的防治提供良好的應(yīng)用前景，如改變miRNA－181a的表達而調(diào)控TCR的親和力，將有助于加強T細胞對自身抗原的耐受，有利于自身免疫病的治療。當前，針對miRNA的研究需要人們了解其確切的信號通路，找到特定miRNA具體作用的上下游靶分子，包括不同組織不同階段的多個靶位，各自的生物學(xué)功能并加以證實［21］。此外，鑒于miRNA網(wǎng)絡(luò)調(diào)控的特點，嘗試有效進行多個miRNA基因操作，并建立進行體內(nèi)實驗的技術(shù)方法也是今后研究的重點。

5 展 望

目前，miRNA的研究還處于理論和基礎(chǔ)水平上，迄今所知miRNA對T細胞發(fā)育的調(diào)控很可能只是miRNA網(wǎng)絡(luò)中的滄海一粟，而miRNA在調(diào)控過程中的具體分子作用機制，也有待于進一步探索［22］。這些miRNA的研究將是對T細胞發(fā)育調(diào)控理論的創(chuàng)新，也將為與T細胞發(fā)育有關(guān)的臨床疾病提供新的治療方向。

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