劉紅梅，李 丹，郭冠亞，李可意

（北京聯(lián)合大學生物化學工程學院，北京 100023）

灰樹花Grifola frondosa為擔子菌亞門、多孔菌科，又名栗子蘑、蓮花菌、千佛菌等，其主要活性成分是灰樹花多糖，因其有β-(1→6)分支，具有顯著的生理活性，具有抑制腫瘤生長、防止腫瘤細胞轉移、防止正常細胞癌變等作用［1-7］。灰樹花多糖多采用子實體的水提醇沉或菌絲體發(fā)酵工藝獲得的，多糖純度低，含色素量高，產(chǎn)品呈深褐色，這不僅影響灰樹花多糖的純度和品質(zhì)，也影響其生物活性，同時也影響對多糖的進一步純化和構效關系的研究。因此，非常有必要對多糖進行脫色處理。

目前常用的脫色方法包括活性炭吸附脫色和雙氧水氧化脫色［8-10］，但采用活性炭吸附脫色，脫色時間較長，多糖損失較多，多糖中存在活性炭殘留；采用雙氧水氧化脫色，易導致多糖結構因氧化而破壞，從而影響其生物活性。大孔樹脂主要利用范德華力對分子進行吸附，具有物理化學穩(wěn)定性高，吸附選擇性強，富集效果好，解吸條件溫和，再生簡便，使用周期長等諸多優(yōu)點［11-18］。

本實驗選擇6種樹脂，比較其對灰樹花子實體酶解液中色素的吸附性能，篩選出較優(yōu)的3種樹脂，通過研究其靜態(tài)吸附動力學特性以及樹脂用量對色素脫除率和多糖保留率的影響，篩選出脫除灰樹花子實體酶解液色素的理想樹脂，并考察料液pH值、料液初始濃度、吸附溫度及洗脫劑體積分數(shù)等因素對色素吸附和解吸效果的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗材料與儀器

1.1.1 實驗材料 灰樹花子實體干品 (20090718)，浙江慶元食用菌研究所。纖維素酶和木瓜蛋白酶，國藥集團化學試劑有限公司；果膠酶，杰輝生物技術有限公司；其他均為國產(chǎn)分析純。HPD 400，AB-8，S-8，D3520，D201，DA201-C吸附樹脂，天津市光復精細化工研究所。

1.1.2 實驗儀器與設備 UV757CRT型紫外分光光度儀，上海精密儀器有限公司；低溫低速離心機，美國Beckman公司；RE-52A/52AA旋轉蒸發(fā)儀，上海亞榮生化儀器廠；FA2004精密電子天平，上海恒平科學儀器有限公司；真空干燥箱，上海精密儀器儀表有限公司；恒溫水浴振蕩器LTA2-SHA-2，上海浦東物理化學儀器廠。

1.2 實驗方法

1.2.1 分析方法 多糖含有量的測定:苯酚-硫酸法［19］測多糖含有量，以葡萄糖為對照品，線性回歸方程為:A=0.5582C+0.1895，R2=0.9997，式中A為吸光度；C為以葡萄糖計的多糖質(zhì)量濃度 (mg/mL)，多糖質(zhì)量濃度在0.0～1.2 mg/mL的范圍內(nèi)線性關系良好。

多糖保留率按式 (1)計算。

式中:M前、M后分別是樹脂脫色前后料液中多糖的總量(mg)。

脫色率的測定:調(diào)節(jié)待測溶液至中性，420 nm處測吸光度，按式 (2)計算脫色率。

式中:A脫色前、A脫色后分別為脫色前后溶液的吸光度。

1.2.2 復合酶-微波輔助萃取提取灰樹花多糖 灰樹花子實體清水洗凈，真空干燥箱60℃干燥6 h，粉碎機粉碎，分別過5目和20目篩，取顆粒度在5～20目之間的灰樹花顆粒，裝入清潔干燥的容器中，置于真空干燥箱中備用。

按質(zhì)量比為2∶2∶1的比例稱取木瓜蛋白酶、纖維素酶和果膠酶，混合均勻，超純水溶解，得復合酶溶液，備用。

稱5～20目灰樹花粉200 g，加10倍超純水，室溫浸泡100 min，按復合酶與灰樹花粉質(zhì)量比0.4%的比例加入復合酶溶液，調(diào)pH為6.0，50℃酶解90 min。酶提取液100℃條件下滅酶10 min，冷卻至室溫，過濾，取濾液，得酶提多糖溶液，備用。苯酚-硫酸法測多糖質(zhì)量分數(shù)＞30%。

1.2.3 大孔樹脂的預處理 大孔樹脂用約2倍樹脂體積的5%鹽酸溶液浸泡6 h，使樹脂充分溶脹，蒸餾水洗至中性，然后用約2倍樹脂體積的5%氫氧化鈉溶液浸泡6 h，蒸餾水洗至中性，再用95%乙醇浸泡6 h，蒸餾水洗至無醇味，備用。

1.2.4 樹脂的初選 精確稱取4.0 g經(jīng)預處理的樹脂于具塞磨口三角瓶中，加入100 mL初始多糖質(zhì)量濃度為1.5 mg/mL的灰樹花子實體酶解液，鹽酸調(diào)pH值為5.0，于恒溫水浴振蕩器中，180 r/min振蕩120 min，4000 r/min離心，過濾，收集濾液，按1.2.2項測多糖濃度和吸光度，計算多糖保留率和脫色率。

1.2.5 吸附動力學特性測定 精確稱取初步篩選出的經(jīng)預處理的濕樹脂各4.0 g于具塞磨口三角瓶中，加入一定質(zhì)量濃度的灰樹花子實體酶解液，于25℃恒溫水浴振蕩器中，180 r/min振蕩，每隔一定時間取樣，測溶液吸光度和多糖含有量，繪制靜態(tài)吸附動力學曲線。

1.2.6 樹脂的靜態(tài)吸附 精確稱取篩選出的經(jīng)預處理的濕樹脂4.0 g于具塞磨口三角瓶中，加入一定體積的灰樹花子實體酶解液，鹽酸調(diào)pH值為5.0，于恒溫水浴振蕩器中，180 r/min振蕩，分別考察樹脂濃度、溶液初始濃度、溶液pH值等條件對脫色率和多糖保留率的影響。

1.2.7 樹脂的靜態(tài)解吸 精確稱取4.0 g篩選出的經(jīng)預處理的樹脂6份，分別置于具塞磨口三角瓶中，加入一定體積的灰樹花子實體酶解液，鹽酸調(diào)pH值為5.0，于恒溫水浴振蕩器中，180 r/min振蕩8 h至吸附平衡 (預實驗表明已達到吸附平衡)；過濾，蒸餾水洗滌樹脂，除去樹脂表面吸附的酶解液，濾紙吸干樹脂表面的水分；加入一定體積分數(shù)分別為0、20%、40%、60%、80%和95%的乙醇溶液，25℃條件下180 r/min振蕩解吸8 h，測多糖和色素含量，按式 (3)計算樹脂對多糖吸附量，按式 (4)和(5)計算解吸量和解吸率。

式中:Q為多糖吸附量，mg/g；C0為料液的初始多糖質(zhì)量濃度 (mg/mL)；Ce為多糖的平衡吸附濃度 (mg/mL)；m為樹脂質(zhì)量 (g)；V為被吸附溶液的體積 (mL)；QD為多糖解吸量 (mg/g)；Cd解吸液濃度 (mg/mL)；Vd解吸液體積 (mL)；η為樹脂對多糖的解吸率。

樹脂對色素的解吸率按式 (6)計算:

式中:A前、A后分別為吸附前、后料液的吸光度；A解為解析后料液的吸光度。

2 結果與討論

2.1 大孔吸附樹脂的篩選 影響大孔樹脂吸附性能的因素很多，包括樹脂的結構、極性、比表面積、粒徑、孔徑及被吸附分子的極性、分子大小等。一般來說，樹脂的極性與被吸附分子的極性相同或相近時吸附效果更好；樹脂有較大比表面積時吸附量更大；樹脂孔徑是被吸附分子大小的5～6倍時吸附性能最好［16］?；覙浠ǘ嗵菍儆谥行缘娜鯓O性分子，酶解液中的色素具有較強的極性。我們選擇了6種樹脂，對灰樹花子實體酶解液中的色素和多糖進行吸附，結果見表1。

表1 6種樹脂對灰樹花子實體酶解液的脫色效果

從樹脂的極性來看，AB-8、S-8、DA201-C 3種樹脂是極性大孔吸附樹脂，具有一定的親水結構，一般用于從非極性溶劑中吸附極性溶質(zhì)?；覙浠ǘ嗵翘崛∫褐械纳貥O性較強，因此S-8、AB-8、DA201-C型樹脂脫色率比較高，這3種樹脂對色素的脫出率分別為77.80%、68.01%和64.99%，多糖保留率分別為89.39%、78.49%和86.09%，而HPD400屬于弱極性樹脂，對色素的吸附率較低，但對多糖的吸附較強，因此多糖保留率較低，只有48.28%；D3520屬于非極性樹脂，對色素和多糖的吸附能力均較差。另外，從比表面積來看，DA201-C、HPD400、AB-8、D3520這4種樹脂比表面積都比較大，但HPD400和D3520的孔徑較小，只能吸附分子較小的色素分子，而對分子較大的色素分子的吸附能力卻較弱，S-8雖然比表面積較小，但卻因具有較大的孔徑，因而對色素分子的吸附能力較強。

根據(jù)以上結果進行綜合考慮，初步選用AB-8、S-8、DA201-C這3種樹脂進行吸附試驗，對樹脂進行進一步篩選。

2.2 靜態(tài)吸附動力學曲線 僅用吸附量來評價一種樹脂的分離特性并不客觀，因為在吸附時間充裕的情況下，一些樹脂可能具有較大的吸附量，但達到吸附平衡的時間很長，這在工業(yè)上并不適合。因此對初選的3種樹脂進行靜態(tài)吸附實驗，結果見圖1。

圖1 篩選的3種樹脂的靜態(tài)吸附動力學(n=2)

由圖1可見，色素在3種樹脂上的靜態(tài)吸附動力學相似，均屬于快速平衡型。在吸附初始階段，色素在樹脂上的吸附量隨吸附時間的延長而快速增加，色素脫除率快速上升，但在125 min左右，樹脂對色素吸附量增加緩慢，150 min時3種樹脂對色素的吸附都基本達到動態(tài)平衡。而在吸附量上，S-8明顯高于其它兩種樹脂。故選擇150 min為3種樹脂對灰樹花多糖色素的最佳吸附時間。

2.3 樹脂用量對樹脂吸附效果的影響 樹脂用量對灰樹花子實體酶解液中色素的脫除率和多糖保留率的影響結果見圖2、圖3。

圖2 樹脂用量對灰樹花多糖脫色率的影響(n=2)

由圖2可知，對于初選的3種樹脂，隨著樹脂用量的增加，色素脫除效果增強，但多糖保留率下降。當樹脂用量大于40 g/L料液時，再繼續(xù)增加樹脂用量，色素脫除率幾乎不再變化。從圖3可以看出，隨著樹脂用量的增加，多糖損失增加，多糖保留率逐漸下降。在樹脂用量相同的情況下，相對于其它兩種樹脂而言，S-8樹脂的色素脫除率和多糖保留率都明顯高于其它兩種樹脂，在樹脂用量為40 g/L時，S-8樹脂的脫色率在80%左右，多糖保留率在86%以上。

圖3 樹脂用量對多糖保留率的影響(n=2)

綜合考慮樹脂對灰樹花子實體酶解液脫色率、多糖保留率的影響以及樹脂的吸附動力學，選擇S-8型樹脂為灰樹花子實體酶解液的脫色樹脂，樹脂用量為40 g濕樹脂/L酶解液，最佳的吸附時間為150 min。

2.4 吸附溫度對S-8樹脂吸附效果的影響 吸附溫度對S-8樹脂吸附效果的影響見圖4。由圖4可以看出，S-8樹脂對色素的脫除有一個最適溫度，即40℃時脫色效果最好。因為隨著溫度的升高，色素分子的擴散速度加快，多糖溶液黏度下降，有利于色素的吸附。但樹脂對色素的吸附過程是一個放熱過程，溫度過高，色素的解吸速度也加快，當色素解吸速率大于樹脂對色素的吸附速率時，會導致色素吸附量下降，脫色率降低。同時，溫度的升高有利于灰樹花多糖中的醇羥基電離，使灰樹花多糖溶液的酸度增加，從而有利于弱堿性樹脂對其進行吸附，因此，隨著溫度的升高，多糖保留率逐漸降低。綜合考慮脫色率和多糖損失率，控制吸附溫度為40℃。

圖4 溫度對S-8型樹脂脫色率、多糖保留的影響(n=2)

2.5 灰樹花子實體酶解液的pH對S-8樹脂吸附效果的影響 灰樹花子實體酶解液的pH值對S-8樹脂的脫色率和多糖保留率的影響見圖5。由圖5可以看出，pH值對多糖的脫色效果和多糖保留率的影響都較大。在中性和弱堿性條件下，樹脂對色素的吸附效果要好于酸性條件，在pH為7～8時，色素脫除率在70%以上。說明在中性或弱堿性條件，更有利于色素的脫除，這是因為灰樹花子實體酶解液中的大部分色素為弱堿性物質(zhì)，隨著pH增加，色素被釋放出來，游離的分子數(shù)增加，從而加快了樹脂對色素的吸附。而多糖保留率隨著pH的增大而降低，但在pH為7.0～8.0時，多糖保留率也在80%左右。因此，S-8型樹脂對灰樹花子實體酶解液中色素脫除的最佳使用pH值為7.0～8.0。

圖5 pH值對灰樹花子實體酶解液的脫色率、多糖保留率的影響(n=2)

2.6 灰樹花子實體酶解液的初始多糖濃度對S-8樹脂吸附效果的影響 灰樹花子實體酶解液的初始多糖質(zhì)量濃度對S-8樹脂吸附效果的影響見圖6。從圖6可以看出，在料液質(zhì)量濃度為2.0～6.0 mg/mL的范圍內(nèi)，隨著料液濃度的增大，在同樣條件下，樹脂對色素的吸附會逐漸達到動態(tài)平衡，當料液質(zhì)量濃度達到4.0 mg/mL時，再繼續(xù)增大料液質(zhì)量濃度，脫色率基本保持在70%左右；而當料液初始質(zhì)量濃度在2.5～4.0 mg/mL時，多糖保留率基本保持在85%左右。因此綜合考慮脫色率和多糖保留率的結果，選擇初始多糖質(zhì)量濃度為4.0 mg/mL。

圖6 料液的初始質(zhì)量濃度對多糖保留率、脫色率影響(n=2)

綜合上述單因素試驗結果，S-8樹脂用于灰樹花子實體酶解液中色素脫除的較佳工藝參數(shù)為:樹脂用量為40 g濕樹脂/L酶解液，料液初始多糖質(zhì)量濃度控制在4.0 mg/mL，pH 7.0～8.0，吸附溫度40℃，180 r/min振蕩150 min。

2.7 優(yōu)化條件的驗證試驗 取100 mL初始多糖質(zhì)量濃度為4.0 mg/mL的灰樹花子實體酶解液，按照上述優(yōu)化結果，進行驗證性實驗，實驗重復3次，測定脫色前后多糖含量和溶液吸光度，得到3次實驗的平均色素脫除率為89.5%，RSD為1.97%，平均多糖保留率達到87.9%，RSD為2.36%。

2.8 樹脂的再生 在利用樹脂進行吸附脫色工藝中，樹脂的再生至關重要。洗脫劑可以使大孔樹脂溶脹，消弱被吸附物質(zhì)與樹脂間的吸附力，從而使被吸附物質(zhì)脫附、溶解。常用的洗脫劑通常包括低級醇、酮或其水溶液，如甲醇、乙醇、丙醇和丙酮等，考慮食品生產(chǎn)安全性方面的要求，本試驗采用乙醇作為洗脫劑，解吸液用量和質(zhì)量濃度對色素和多糖解吸率的影響結果見圖7和表3。由圖7可知，隨著乙醇溶液質(zhì)量濃度的增加，乙醇溶液對色素和多糖的解吸能力均逐漸增強，色素和多糖的解吸率增大，當乙醇量達到30%時，乙醇對色素和多糖的解吸能力達到60%以上，隨著乙醇質(zhì)量濃度的進一步增大，解吸率繼續(xù)增大，當乙醇體積分數(shù)達到80%時，解吸率達到70%以上。由表3可見，隨著解吸液用量的增加，色素和多糖解吸率都呈上升趨勢，當解吸液用量達到10.0 mL/g濕樹脂時，色素和多糖的解吸率都在90%以上，大部分被吸附色素和多糖都從樹脂中游離出來，當樹脂用量增加到12.5 mL/g濕樹脂時，色素和多糖解吸率增加不多。綜合以上實驗結果，采用濃度為30%、用量為10 mL/g濕樹脂作為解吸液，對樹脂進行再生。

圖7 乙醇質(zhì)量濃度對多糖和色素解吸率的影響(n=2)

表3 解吸液的用量對色素和多糖解吸率的影響(n=2)

3 結論

3.1 在篩選的6種大孔樹脂中，S-8樹脂對灰樹花子實體酶解液中色素的吸附速率快，色素脫出率高，而對多糖的吸附較小，多糖保留率較高，是一種較理想的色素吸附劑，可用于脫除灰樹花子實體酶解液中的色素。

3.2 S-8樹脂用于灰樹花子實體酶解液中色素的脫除的較佳工藝參數(shù)為:樹脂用量為40 g濕樹脂/L酶解液，料液初始多糖質(zhì)量濃度控制在4.0 mg/mL，pH 7.0～8.0，吸附溫度40℃，180 r/min振蕩150 min。驗證實驗結果表明，根據(jù)優(yōu)化工藝進行實驗，色素脫除率達到89.5%，RSD為1.97%，多糖保留率達到87.9%，RSD為2.36%。

3.3 采用質(zhì)量濃度為30%、用量為10 mL/g濕樹脂的乙醇作為解吸液，對樹脂進行再生，色素和多糖解吸率都在90%以上。

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