曲春陽，潘磊慶，屠 康，楊立之

(南京農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，農(nóng)業(yè)部農(nóng)畜產(chǎn)品加工與質(zhì)量控制重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室，江蘇南京210095)

復(fù)合精油對黃曲霉聯(lián)合抑菌作用研究

曲春陽，潘磊慶，屠 康*，楊立之

(南京農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，農(nóng)業(yè)部農(nóng)畜產(chǎn)品加工與質(zhì)量控制重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室，江蘇南京210095)

采用聯(lián)合抑菌評價(jià)方法，通過測定植物精油抑菌圈直徑、最低抑菌濃度(Minimum Inhibition Concentration，MIC)、最低生長下降濃度(Reduction Concentration，RC)、聯(lián)合抑菌指數(shù)(Fractional Inhibitory Concentration，F(xiàn)IC)，對植物精油單獨(dú)及聯(lián)合使用后的抑菌效果進(jìn)行評價(jià)，篩選最佳抑制黃曲霉活性作用的復(fù)合精油種類及配比。結(jié)果表明:大蒜、肉桂、丁香、薄荷精油單獨(dú)或復(fù)合使用均有較強(qiáng)抑制黃曲霉活性的作用。大蒜與肉桂精油聯(lián)合抑菌評價(jià)為相加作用。當(dāng)大蒜精油與肉桂精油復(fù)合體積比為1∶3時(shí)，復(fù)合精油具有最佳抑制黃曲霉活性的效果。因此，復(fù)合精油作為有效防霉保鮮成分具有良好的研發(fā)與應(yīng)用前景。

復(fù)合精油，黃曲霉，聯(lián)合抑菌，效果

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

表1 十二種植物精油對黃曲霉的固相抑菌圈直徑Table 1 The antibacterial circle diameter of twelve kinds of essential oil

植物精油(大蒜、丁香、肉桂、薄荷等)100%純度，鄭州雪麥龍香精香料有限公司;黃曲霉(Aspergillus flavus) 中國工業(yè)微生物菌種保藏中心;大米 水分含量為15.5%，江蘇農(nóng)墾米業(yè)集團(tuán)三河米廠;其它試劑 均為分析純，南京試劑廠;查氏 自制。

BD－HWS－150型恒溫恒濕培養(yǎng)箱 南京貝帝實(shí)驗(yàn)儀器有限公司;SW－CJ型超凈工作臺 上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司;CX21型生物顯微鏡OLYMPUS(日本);立式壓力蒸汽滅菌器 上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠;HH－6型數(shù)碼恒溫水浴鍋國華電器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 菌懸液制備 用接種環(huán)挑取3～4環(huán)培養(yǎng)5d左右的黃曲霉菌孢子置于10mL帶無菌玻璃珠的無菌水中，采用活菌計(jì)數(shù)法測定菌數(shù)，制成菌體濃度為106～107CFU/mL的均勻菌懸液。

1.2.2 抑菌圈實(shí)驗(yàn) 平板擴(kuò)散法(氣相)［9］:取菌懸液0.1mL滴入查氏培養(yǎng)基，涂布均勻即成含菌平板。在無菌條件下，于無菌平皿中倒入20mL培養(yǎng)基，待培養(yǎng)基凝固后，用平板涂布法將黃曲霉涂于平皿培養(yǎng)基上，然后將滅菌濾紙片(d=6mm)貼于含菌平板的皿蓋中央，取精油試樣20μL滴到貼好的無菌濾紙片上，培養(yǎng)皿用保鮮膜密封。將培養(yǎng)皿置于28℃培養(yǎng)5d，測量抑菌圈大小。用無菌水做對照，重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次。

濾紙片法(固相)［10］:取菌懸液0.1mL滴入培養(yǎng)基中，涂布均勻即成含菌平板。取精油試樣20μL滴到無菌6mm直徑的圓濾紙片上，在無菌條件下將濾紙片貼在含菌平板瓊脂表面中央，將接種好的培養(yǎng)皿用保鮮膜密封，于28℃倒置培養(yǎng)5d，測量抑菌圈大小。用無菌水代替精油做對照，重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次。

抑菌圈實(shí)驗(yàn)判定標(biāo)準(zhǔn):抑菌圈直徑＞15mm為最敏感，10～15mm為中度敏感，7～9mm為低度敏感［11］。

1.2.3 最低抑菌濃度(MIC)實(shí)驗(yàn)［9］將菌懸液0.1mL滴入已滅菌冷卻凝固的培養(yǎng)基，涂布均勻即成含菌平板。精油用0.22μm的微孔過濾器過濾，并用Tween－80稀釋。吸取各稀釋液1mL于無菌條件下加入到含菌平板的皿蓋中央，倒置培養(yǎng)，使培養(yǎng)皿內(nèi)空氣中精油濃度分別達(dá)到1～180mg/L空氣系列濃度，于28℃培養(yǎng)5d，以不生長菌的樣品的最低濃度為精油的MIC。

氣相抑菌實(shí)驗(yàn)中精油的濃度表示為:培養(yǎng)皿內(nèi)單位體積空氣中含有的精油體積，即mg/L(空氣)。

1.2.4 最低生長下降濃度(RC) 使微生物出現(xiàn)明顯生長下降的最低濃度。

1.2.5 植物精油聯(lián)合抑菌效果評價(jià) 以分級抑菌濃度指數(shù)(FIC)作為聯(lián)合抗菌實(shí)驗(yàn)效果的判定依據(jù)。

FIC指數(shù)的計(jì)算［9］:

FIC指數(shù)判定標(biāo)準(zhǔn)為:

FIC指數(shù)≤0.5時(shí)為協(xié)同作用;0.5＜FIC指數(shù)≤1為相加作用;1＜FIC指數(shù)≤2為無關(guān);FIC指數(shù)＞2時(shí)為拮抗作用。

2 結(jié)果與分析

2.1 十二種植物精油對黃曲霉固相抑菌圈的測定

參照抑菌圈實(shí)驗(yàn)判定標(biāo)準(zhǔn)，表1的結(jié)果顯示，大蒜精油與薄荷精油在實(shí)驗(yàn)期內(nèi)能夠完全抑制黃曲霉的生長，其供試平板幾乎完全不長菌，屬于最敏感范疇;肉桂精油、丁香精油和香茅精油也對黃曲霉有較強(qiáng)的抑制作用，但抑制效果依次降低，但也屬于最敏感范疇;花椒精油對黃曲霉也有一定的抑制作用，屬于中度敏感范疇;香柏木精油、八角茴香精油、桉樹(尤加利)精油對黃曲霉抑制作用較弱;孜然精油、生姜精油和迷迭香精油對黃曲霉沒有抑制作用。大蒜精油和薄荷精油抑菌范圍廣但程度淺，肉桂和丁香精油抑菌圈輪廓分明，且抑菌程度較深。劉曉莉等［12］用丁香精油和肉桂精油對黃曲霉等霉菌進(jìn)行氣相與固相抑菌圈的測定，其中丁香精油的抑菌圈直徑為28.3mm，肉桂精油抑菌圈直徑為38.5mm，與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果相似，屬于同一敏感范疇。綜上所述，大蒜精油、薄荷精油、肉桂精油和丁香精油具有較好抑制黃曲霉活性的效果。

2.2 單一及復(fù)合精油對黃曲霉抑菌的效果

根據(jù)大蒜與薄荷精油和肉桂與丁香精油對黃曲霉不同的抑菌特點(diǎn)，進(jìn)一步探究其單一與復(fù)配精油對抑制黃曲霉活性效果的變化。將該四種精油進(jìn)行等體積濃度互配與單一精油對黃曲霉氣相與固相抑菌圈直徑進(jìn)行測定，結(jié)果如表2所示。

表2 單一及復(fù)合精油對黃曲霉的抑菌圈直徑Table 2 The antibacterial circle diameter of single and combined essential oil

由表2可知，大蒜精油單用和大蒜與肉桂精油等體積混用，它們的氣相和固相抑菌圈直徑均為最大(＞90mm)，屬于最敏感范疇，其次是薄荷精油單用、大蒜與薄荷精油和大蒜與丁香精油等體積混用，均有較大的氣相和固相抑菌圈直徑;其他單一與混合精油對黃曲霉也均有較好的作用效果，除了丁香精油氣相抑菌圈為中度敏感，其他均為最敏感范疇。不僅再次驗(yàn)證該四種植物精油對黃曲霉有較強(qiáng)的抑制作用，并且其混合使用效果又優(yōu)于單一使用效果的趨勢;大蒜精油與肉桂精油等體積混用的效果與大蒜精油單一使用的效果一致，均有最強(qiáng)抑制黃曲霉活性的效果。

2.3 大蒜、肉桂及其復(fù)合精油對黃曲霉抑制的效果

為了科學(xué)評價(jià)大蒜精油與肉桂精油及其復(fù)合精油對黃曲霉活性抑制情況，對它們進(jìn)行氣相最低抑菌濃度(MIC)，最低生長下降濃度(RC)和聯(lián)合抑菌評價(jià)(FIC)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果如表3所示。

表3 大蒜、肉桂精油及復(fù)合精油對黃曲霉氣相的MIC、RC和FICTable 3 The MIC、RC and FIC of garlic，cinnamon，and combined essential oil

由表3可知，大蒜與肉桂等體積復(fù)合精油的MIC、RC最小，分別為25.6mg/L和19.3mg/L，說明該復(fù)合精油比單一精油使用有較好的抑菌效果。大蒜精油比肉桂精油的MIC和RC小，說明大蒜精油比肉桂精油抑制黃曲霉效果好。并且從其實(shí)驗(yàn)效果可知，大蒜精油具有明顯的抑菌乃至殺菌的效果，但其有效作用時(shí)間較短，由閆淼淼［13］研究可知，大蒜獨(dú)特的辛辣氣味來源于一類性質(zhì)穩(wěn)定、無色無味的風(fēng)味前體物質(zhì)類物質(zhì)S－烴基－半胱氨酸亞砜(cysteine sulphoxides，CSOs)，再經(jīng)過一系列的氧化還原反應(yīng)形成揮發(fā)性的含硫化合物。當(dāng)大蒜受到物理破碎后，細(xì)胞膜破裂，細(xì)胞質(zhì)中的CSOs(主要是蒜氨酸)被液泡中的蒜氨酸酶催化分解成2－烯丙基次磺酸和氨基丙酮酸，而2－烯丙基次磺酸很不穩(wěn)定，易發(fā)生聚合反應(yīng)生成具有強(qiáng)烈辛辣味的揮發(fā)性物質(zhì)——硫代亞磺酸酯類(主要是大蒜素)。大蒜素又會迅速降解為揮發(fā)性的含硫化合物DAS，DADS，DATS，Ajoene，Vinyl dithiins等。由于大蒜素易揮發(fā)擴(kuò)散至空氣中，因此大蒜精油會產(chǎn)生作用范圍廣時(shí)間短的抑菌特點(diǎn)。

肉桂精油主要抑菌成分為肉桂醛(cinnamaldehyde)，國內(nèi)外已有多項(xiàng)研究成果報(bào)道［14－15］肉桂醛具有較強(qiáng)的抑制霉菌的作用，它不僅能抑制霉菌孢子萌發(fā)，還能抑制菌絲體生長和孢子的產(chǎn)生。由于肉桂醛是醛類物質(zhì)，其在精油中存在狀態(tài)為液態(tài)，揮發(fā)性比大蒜素要低，因此會顯示比較穩(wěn)定持久的抑菌特點(diǎn)。此外，選擇氣態(tài)抑菌實(shí)驗(yàn)的原因是抑菌物質(zhì)的抑菌性主要是基于霉菌孢子對抑菌物質(zhì)的吸收而起作用，氣態(tài)抑菌狀態(tài)更有利于孢子對抑菌物質(zhì)的吸收，因此主要抑菌物質(zhì)為氣態(tài)的植物精油對霉菌的抑制效果更好［16］。

抑菌劑的聯(lián)合抑菌效果可以通過FIC指數(shù)的計(jì)算，判定各抑菌物質(zhì)間是否有協(xié)同、相加、無關(guān)和拮抗作用。相加作用是指混合抑菌劑的抑菌效果等于各抑菌劑單獨(dú)使用的效果之和;協(xié)同作用是指混合抑菌劑的抑菌效果優(yōu)于各抑菌劑單獨(dú)使用的效果之和;拮抗作用是指混合抑菌劑的抑菌效果低于其中某一種或幾種抑菌物質(zhì)劑單獨(dú)使用的效果［17］。由表3的FIC指數(shù)計(jì)算結(jié)果可以得出，大蒜精油單獨(dú)使用的FIC值為0.52，肉桂精油單獨(dú)使用的 FIC值為0.47，復(fù)合精油的FIC值為0.99＜1，說明大蒜和肉桂復(fù)合精油對黃曲霉的抑菌效果表現(xiàn)為相加作用，該實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明大蒜與肉桂精油(1∶1)復(fù)合使用比單獨(dú)使用的抑菌效果好。

2.4 不同濃度復(fù)合精油對黃曲霉抑菌活性的測定

由以上實(shí)驗(yàn)效果可知，肉桂精油和大蒜精油的復(fù)合精油抑菌效果比單獨(dú)使用好，但不同的配比濃度的復(fù)合精油有不同的抑菌效果，因此，為進(jìn)一步確定最佳復(fù)合精油配比濃度，進(jìn)行體積比為大蒜精油∶肉桂精油=1∶7、1∶5、1∶3、1∶1、3∶1、5∶1、7∶1的復(fù)合精油對黃曲霉氣相與固相抑菌圈的測定，結(jié)果如表4所示。

表4 不同配比濃度復(fù)合精油對黃曲霉的抑菌圈直徑Table 4 The antibacterial circle diameter of combined essential oil with different volume ratio

由表4可知，大蒜精油與肉桂精油體積比為1∶3的復(fù)合精油具有最大的氣相和固相抑菌圈直徑，說明該濃度的復(fù)合精油具有最強(qiáng)的抑制黃曲霉活性效果。此外，由表4中還可看出，復(fù)合精油中大蒜精油濃度大于肉桂精油濃度時(shí)，氣相抑菌圈幾乎消失，固相抑菌圈直徑隨著大蒜精油濃度的增加而逐漸減小;當(dāng)復(fù)合精油中的肉桂精油濃度大于大蒜精油濃度時(shí)，均有較明顯的抑菌圈出現(xiàn)，并且隨著肉桂精油濃度增加，氣相抑菌圈直徑減小，固相抑菌圈直徑也有減小的趨勢。因此可推測，肉桂精油有效作用成分(肉桂醛)在復(fù)合精油對黃曲霉抑菌過程中起主要作用。綜上所述，大蒜精油與肉桂精油體積比為1∶3的復(fù)合精油具有較好地抑制黃曲霉活性效果及防霉保鮮應(yīng)用前景。

3 結(jié)論

實(shí)驗(yàn)研究從12種植物精油中通過氣相、固相抑菌圈直徑和最低抑菌濃度(MIC)的測定方法篩選得出大蒜精油和肉桂精油具有較強(qiáng)的抑制黃曲霉活性的作用。參照抗菌素聯(lián)合作用常用的FIC指數(shù)聯(lián)合抑菌評價(jià)方法，證實(shí)大蒜與肉桂精油復(fù)合抑菌性具有相加作用，且對其最佳配比濃度進(jìn)行篩選實(shí)驗(yàn)，得出大蒜精油與肉桂精油體積比為1∶3的復(fù)合精油具有最佳抑制黃曲霉活性得效果。

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Research of the inhibition activities effect of complex essential oil on Aspergillus flavus

QU Chun－yang，PAN Lei－qing，TU Kang*，YANG Li－zhi
(College of Food Science and Technology，Key Lab of Agri－food quality and processing，MOA，Nanjing Agricultural University，Nanjing 210095，China)

The Diameter of Antibiotic Circle，Minimum Inhibition Concentration(MIC)，Reduction Concentration(RC) and Fractional Inhibitory Concentration(FIC)of plant essential oils which used in single or combined were tested，and the fungicidal activities were evaluated by combined antiseptic evaluation method in order to find the best types and ratio of essential oils for inhibiting activities on Aspergillus flavus.The results indicated that garlic，cinnamon，clove and mint essential oils had strong inhibition activities on Aspergillus flavus.Combination of garlic and cinnamon essential oil showed surperimposed inhibition effects on Aspergillus flavus.The combined essential oil of garlic and cinnamon essential oil had the best inhibition effect on Aspergillus flavus when the volume ratio of them was 1∶3.Therefore，this type of combined essential oil had a potential for the further applications as effective fungicidal components.

complex essential oil;Aspergillus flavus;combined inhibition;effect

TS225.1+9

A

1002－0306(2012)10－0128－04

植物精油(essential oil)或香精油(ethereal oil)，是一類植物源次生代謝物質(zhì)，分子量較小、可隨水蒸氣蒸出、具有一定氣味的揮發(fā)性油狀液體物質(zhì)［1］。植物精油具有抑菌、殺蟲、抗氧化等活性，在醫(yī)藥、農(nóng)藥、飼料添加劑、食品防腐保鮮等方面有廣泛應(yīng)用［2－3］。植物精油具有來源于天然、對人體相對安全、與環(huán)境友好、生物活性多樣等特點(diǎn)，越來越引起人們的關(guān)注［4］。黃曲霉(Aspergillus flavus)，是真菌中一類半知菌(Fungi inperfecti)，能夠分泌B1、B2、G1、G2等10余種毒素，其中B1是已知毒性最強(qiáng)的一類有機(jī)化合物，是該曲霉類中產(chǎn)毒菌株主要的次生代謝產(chǎn)物。黃曲霉最易著生于花生、玉米、大米等糧油或其制品上，其所含毒素狀況是農(nóng)產(chǎn)品進(jìn)出口常規(guī)檢測項(xiàng)目。黃曲霉毒素是一種毒性極強(qiáng)的劇毒物質(zhì)，它的毒性比氰化鉀大10倍，比砒霜大68倍［5］。1993年黃曲霉毒素被世界衛(wèi)生組織(WTO)的癌癥研究機(jī)構(gòu)劃定為已知最強(qiáng)致癌化學(xué)物質(zhì)之一［6］。世界上已有大約100個(gè)國家對食品中黃曲霉毒素的含量做了嚴(yán)格限量要求［7］。我國花生及其制品、食用油、油料餅粕及飼料和玉米、大米等農(nóng)產(chǎn)品和食品的黃曲霉毒素污染比較嚴(yán)重，并已引發(fā)多起因黃曲霉毒素超標(biāo)而導(dǎo)致的農(nóng)產(chǎn)品國際貿(mào)易糾紛［8］。因此，采取有效的控制和預(yù)防措施，通過利用天然植物精油的抑菌防霉作用，防止農(nóng)產(chǎn)品被黃曲霉及其毒素污染，特別是聯(lián)合抑菌法篩選研究具有最佳抑制黃曲霉活性的單方或復(fù)合植物精油作為防霉保鮮劑的主要抑菌成分，對保證大米安全和減少經(jīng)濟(jì)損失，從而實(shí)現(xiàn)綠色儲糧具有重要意義。

2011－09－05 *通訊聯(lián)系人

曲春陽(1985－)，女，碩士研究生，主要從事食品儲藏與保鮮方面的研究工作。

農(nóng)業(yè)部948項(xiàng)目(2011－S10);中央高校基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)南京農(nóng)業(yè)大學(xué)項(xiàng)目(KYZ201120);江蘇省高校優(yōu)勢學(xué)科建設(shè)工程。