劉彩琴，趙 丹，朱 敏

(浙江樹人大學(xué)生物與環(huán)境工程學(xué)院，浙江杭州310015)

姜黃素微波提取工藝及其抗氧化活性研究

劉彩琴，趙 丹，朱 敏

(浙江樹人大學(xué)生物與環(huán)境工程學(xué)院，浙江杭州310015)

姜黃素是國內(nèi)外食品行業(yè)允許使用的重要天然色素之一，具有很大的市場潛力。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用微波輔助提取技術(shù)提取姜黃中的姜黃素，通過單因素實(shí)驗(yàn)和響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)，以對DPPH自由基的清除能力為指標(biāo)，考察了提取時(shí)料液比、處理時(shí)間、微波功率、乙醇濃度等影響因素。結(jié)果表明，微波提取的最佳工藝參數(shù)是:料液比1∶43.81、微波功率540W，處理時(shí)間30s，溶劑為71.21%乙醇溶液，在此參數(shù)下，姜黃素對DPPH自由基的清除率達(dá)50.69%。

姜黃素，微波輔助提取，抗氧化活性，響應(yīng)面法

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

姜黃 杭州回春堂藥店;姜黃素標(biāo)準(zhǔn)品 上海三愛思試劑有限公司;1，1－二苯基苦基苯肼(DPPH)美國sigma公司;其他試劑 均為國產(chǎn)分析純。

微波爐 格蘭仕WD900BS;臺(tái)式高速冷凍離心機(jī) Biofuge Primo R;FW100型高速萬能粉碎機(jī) 天津市泰斯特儀器有限公司;UV－124型紫外－可見分光光度計(jì) 日本島津;PL303型電子分析天平 梅特勒－托利多儀器(上海)有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 提取方法 姜黃片磨粉過80目篩，準(zhǔn)確稱取1.000g姜黃粉末于100mL燒杯中，加入乙醇溶液，在不同微波功率下輻射，提取，再將提取液3000r/min離心10min，取上清液定容至50mL，吸取2mL稀釋至10mL，用紫外－分光光度計(jì)測定在一定波長處的吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算提取液姜黃素含量。

1.2.2 姜黃素含量及提取率測定方法

1.2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 精確稱量分析純姜黃素1.000g，用無水乙醇溶于100mL容量瓶中，定容，即為標(biāo)準(zhǔn)溶液。取標(biāo)準(zhǔn)溶液做全波長掃描，然后分別取標(biāo)準(zhǔn)溶液0.10、0.20、0.30、0.40、0.50mL，加75%乙醇定容至100mL，在最大波長處測其紫外吸光度。以吸光度為橫坐標(biāo)，濃度為縱坐標(biāo)，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線方程。

1.2.2.2 姜黃素提取率計(jì)算方法 按照1.2.1所述的方法得到待測液，以75%乙醇作參比，在一定的波長下測定樣品溶液的吸光度，利用回歸方程得出樣品溶液姜黃素的濃度，按以下公式計(jì)算提取物中的姜黃素含量及提取率。

姜黃素含量(mg)=樣品溶液姜黃素的濃度(mg/mL)×浸提液的稀釋倍數(shù)×浸提液總體積(mL)

姜黃素提取率(%)=姜黃素含量(g)/藥材質(zhì)量(g)×100%

1.2.3 姜黃素的抗氧化活性測定方法［12］

1.2.3.1 DPPH溶液的配制 準(zhǔn)確稱取DPPH試劑0.1288g，用95%乙醇溶解定容至500mL容量瓶中，得濃度為257.7mg/L的DPPH貯備液。搖勻置于冰箱中冷藏備用。

1.2.3.2 清除DPPH自由基能力的測定步驟 a.在10mL比色管中依次加入 4.0mL DPPH貯備液和1.0mL 95%乙醇，混勻反應(yīng)穩(wěn)定后，以95%乙醇液為參比，在517nm處測吸光值，記為A1。

b.在10mL比色管中依次加入4.0mL DPPH貯備液的溶劑(95%的乙醇溶液)和1.0mL待測試樣溶液，混勻反應(yīng)穩(wěn)定后，以 95%乙醇液為參比，在517nm處測吸光值，記為A2。

c.在10mL比色管中依次加入4.0mL DPPH貯備液和1.0mL待測試液，混勻反應(yīng)穩(wěn)定后，以95%乙醇液為參比，在517nm處測吸光值，記為A3。

d.計(jì)算DPPH自由基清除率(Y1，%)=(1－(A3－A2)/A1)×100%。

1.2.4 提取工藝優(yōu)化方法

1.2.4.1 單因素實(shí)驗(yàn) 考察料液比、微波功率、溶劑濃度、微波時(shí)間四個(gè)因素對姜黃素提取率及抗氧化活性的影響。

1.2.4.2 響應(yīng)面法實(shí)驗(yàn) 在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，根據(jù)Box－Behnken的中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，選取料液比、微波功率、溶劑濃度、微波時(shí)間為實(shí)驗(yàn)因素，以姜黃素對DPPH自由基清除率為實(shí)驗(yàn)指標(biāo)，設(shè)計(jì)了部分因子實(shí)驗(yàn)和中心組合實(shí)驗(yàn)，其水平編碼表見表1和表2。

1.2.5 數(shù)據(jù)處理 所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均為三個(gè)重復(fù)的平均值，數(shù)據(jù)經(jīng)Origin6.0和SAS8.0分析和處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 姜黃素標(biāo)準(zhǔn)曲線

以吸光度A為橫坐標(biāo)，姜黃素濃度C(mg/mL)為縱坐標(biāo)，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線方程見圖1。其標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=0.0592x+0.0006(R2=0.9999)，表明在該濃度范圍內(nèi)濃度和吸光度有良好線性關(guān)系。

表1 部分因子設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)因子及編碼值Table 1 The coded and uncoded values of factors in FFD

表2 中心組合實(shí)驗(yàn)因子及編碼值Table 2 Levels of variables used in the central composite design

圖1 姜黃素標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 The curve of curcumin standard solution

2.2 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 料液比對姜黃素提取率及抗氧化活性的影響 不同料液比對姜黃素提取率存在一定影響，初步將微波功率確定為360W，提取時(shí)間為30s，乙醇濃度為75%，料液比則選擇1∶20，1∶30，1∶40三個(gè)水平，考查不同料液比對姜黃素提取率及對DPPH自由基清除率的影響，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖2。

圖2 料液比對姜黃素提取率及抗氧化活性的影響Fig.2 Effect of solid－liquid ratio on curcumin yield and antioxidant activity

由圖2可見，在1∶20、1∶30、1∶40的料液比情況下，姜黃素的提取率波動(dòng)在 0.178%～0.196%，對DPPH自由基的清除率為47.6%～48.6%，而以料液比為1∶40時(shí)姜黃素的提取率及對DPPH自由基的清除率最大，故下面的實(shí)驗(yàn)選取料液比為1∶40。

2.2.2 微波功率對姜黃素提取率及抗氧化活性的影響 鑒于所用微波爐只有180、360、540W三個(gè)功率，故本實(shí)驗(yàn)以料液比1∶40，乙醇濃度75%，提取時(shí)間30s條件下考查了這三個(gè)微波功率下姜黃素的提取率及對 DPPH自由基清除率的影響，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖3。

圖3 微波功率對姜黃素提取率及抗氧化活性的影響Fig.3 Effect of microwave power on curcumin yield and antioxidant activity

由圖3可見，在這三個(gè)功率的影響下，姜黃素的提取率波動(dòng)在0.1990%～0.2030%，對DPPH自由基的清除率為49.3%～49.6%，而以540W時(shí)姜黃素的提取率及對DPPH自由基的清除率最大，故下面的實(shí)驗(yàn)中微波功率選擇540W。

2.2.3 溶劑濃度對姜黃素提取率及抗氧化活性的影響 料液比確定為1∶40，微波功率為540W，提取時(shí)間初步定為30s，溶劑乙醇濃度選擇65%、75%、85%三個(gè)水平，考查不同溶劑濃度對姜黃素提取率及對DPPH自由基清除率的影響，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖4。

由圖4可見，并不是提取溶劑乙醇濃度越高，提取效果越好，當(dāng)濃度達(dá)到85%時(shí)，姜黃素提取率和對DPPH自由基的清除率反而降低，當(dāng)乙醇濃度為75%時(shí)姜黃素的提取率和對DPPH自由基的清除率最大，分別達(dá)到0.2042%和49.98%。從實(shí)驗(yàn)中也發(fā)現(xiàn)，乙醇濃度高時(shí)，微波過程中容易出現(xiàn)乙醇溢出燒杯的現(xiàn)象，導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)出現(xiàn)很大的誤差，這也是本實(shí)驗(yàn)中沒有選取更高乙醇濃度的原因。

綜合上述結(jié)果，提取溶劑乙醇濃度以75%的提取效果較好。

圖4 乙醇濃度對姜黃素提取率及抗氧化活性的影響Fig.4 Effect of ethanol concentration on curcumin yield and antioxidant activity

2.2.4 提取時(shí)間對姜黃素提取率及抗氧化活性的影響 料液比為1∶40，微波功率為540W，溶劑濃度為75%，提取時(shí)間設(shè)定為20、30、40s三個(gè)水平，考查提取時(shí)間對姜黃素提取率及對DPPH自由基清除率的影響，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖5。

由圖5可知，提取時(shí)間為30s時(shí)姜黃素的提取率和對DPPH自由基的清除率最大，分別達(dá)到0.204%和49.71%。在實(shí)驗(yàn)過程中，提取時(shí)間過長，微波過程中溶劑會(huì)溢出燒杯，導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)結(jié)果誤差很大。綜合上述結(jié)果，將提取時(shí)間初步定為30s。

綜合單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果可見，微波提取時(shí)姜黃素的提取率和姜黃素對DPPH自由基的清除率之間呈正相關(guān)關(guān)系。

圖5 微波時(shí)間對姜黃素提取率及抗氧化活性的影響Fig.5 Effect of microwave treatment time on curcumin yield and antioxidant activity

2.3 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.3.1 部分因子實(shí)驗(yàn) 本實(shí)驗(yàn)以單因素實(shí)驗(yàn)中獲得的最適提取條件為基礎(chǔ)，將其值確定為中心值，并進(jìn)行適當(dāng)?shù)臄U(kuò)充而成為自變量的取值范圍，以姜黃素對DPPH自由基的清除率為指標(biāo)，以期找到微波輔助提取時(shí)影響顯著的因素。

選取部分因子實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，各因子編碼值見表1，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和結(jié)果見表3。

表3 部分因子實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及實(shí)驗(yàn)結(jié)果*Table 3 The design and results of FFD

對部分因子實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行回歸分析表明:料液比(X1)和乙醇濃度(X4)對DPPH自由基的清除率影響顯著(95%的水平)，而微波時(shí)間(X2)和微波功率(X3)對DPPH自由基的清除率影響不顯著(90%的水平)，各因子間沒有交互作用。由回歸分析結(jié)果可得姜黃素對DPPH自由基的清除率一次擬合線性回歸方程:

對式(1)進(jìn)行方差分析，F(xiàn)=4.04，P=0.0188，說明模型在概率α=0.05水平上足夠擬合實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

從分析結(jié)果還可以看出:料液比(X1)就姜黃素對DPPH自由基的清除率的影響是正面的，乙醇濃度(X4)就姜黃素對DPPH自由基的清除率的影響是負(fù)面的，因此，將微波時(shí)間(X2)和微波功率(X4)確定在中心點(diǎn)，對料液比和乙醇濃度作為進(jìn)一步優(yōu)化的因素。

對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)平均值與中心點(diǎn)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的平均值進(jìn)行t－檢驗(yàn)，T統(tǒng)計(jì)量檢驗(yàn)結(jié)果表明，在方差相等和方差不等的條件下，中心實(shí)驗(yàn)點(diǎn)姜黃素對DPPH自由基的平均清除率(49.35%)和部分重復(fù)實(shí)驗(yàn)姜黃素對DPPH自由基的平均清除率(51.44%)差異極顯著(P＜0.01)，說明實(shí)驗(yàn)的最優(yōu)點(diǎn)(姜黃素對DPPH自由基的清除率最大)在當(dāng)前實(shí)驗(yàn)的設(shè)計(jì)范圍之內(nèi)。

2.3.2 響應(yīng)面優(yōu)化 以姜黃素對DPPH自由基的清除率為指標(biāo)，利用中心組合設(shè)計(jì)對影響顯著的這兩個(gè)獨(dú)立的過程變量的濃度進(jìn)行優(yōu)化，即對料液比(X1)和乙醇濃度(X4)濃度進(jìn)行中心組合設(shè)計(jì)，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及實(shí)驗(yàn)結(jié)果分別見表2和表4。

表4 中心組合設(shè)計(jì)及實(shí)驗(yàn)結(jié)果*Table 4 Experimental designs and the results of central composite design(CCD)

從表5和表6分析結(jié)果可知，該模型在96.04%概率水平上回歸顯著，因而模型是充分的。表明該模型能解釋96.04%的DPPH自由基清除率的變化。用多項(xiàng)式回歸技術(shù)對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)擬合所得二次多項(xiàng)式(2)為:

表5 中心組合實(shí)驗(yàn)響應(yīng)面分析結(jié)果Table 5 Regression coefficients and their significances from the results of CCD

表6 中心組合實(shí)驗(yàn)方差分析結(jié)果Table 6 Analysis of varia nce(ANOVA)for the model

從分析結(jié)果還可以看出，料液比和料液比與乙醇濃度的交互作用就姜黃素對DPPH自由基清除率的影響為正，而乙醇濃度、料液比的平方和乙醇濃度的平方就姜黃素對DPPH自由基清除率的影響為負(fù)。該二次多項(xiàng)式方程的三維響應(yīng)面圖見圖6。

圖6 料液比和乙醇濃度對DPPH自由基清除率的響應(yīng)面圖Fig.6 The response surface plot of solid－liquid ratio and ethanol concentration to scavenging abilities of DPPH·

對式(2)求導(dǎo)，可以得到模型的極大值處，當(dāng)x1=0.254160，x4=－0.252761，即料液比為1∶43.81，乙醇濃度為71.21%。此時(shí)模型預(yù)測的姜黃素對DPPH自由基的清除率最大響應(yīng)為49.99%。為了證實(shí)模型的預(yù)測值與實(shí)測值之間的擬合程度，在上述兩因子的取值處進(jìn)行搖瓶驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，其響應(yīng)量結(jié)果為50.69%(N=3)，預(yù)測值與實(shí)驗(yàn)值之間具有良好的擬合性，表明了模型的有效性。

綜上實(shí)驗(yàn)可見，采用微波輔助提取技術(shù)提取的姜黃中姜黃素對DPPH自由基的清除率在50%左右，比有些技術(shù)所提取的姜黃素對DPPH自由基的清除率低，已有資料表明帶酚羥基的姜黃素類似物對DPPH自由基有一定的清除能力，而沒有酚羥基的姜黃素類似物則沒有清除DPPH自由基的能力［13－14］。由此看來，所涉技術(shù)問題還有待深入研究，

3 結(jié)論

以姜黃素對DPPH自由基清除率為指標(biāo)，經(jīng)單因素實(shí)驗(yàn)和響應(yīng)面法得到微波輔助提取姜黃素的最佳條件為:料液比為1∶43.81，微波時(shí)間30s，微波功率540W，乙醇濃度為71.21%，在此條件下，姜黃素對DPPH自由基的清除率達(dá)50.69%。

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Study on extraction technology of curcumin from turmeric and its antioxidant activity

LIU Cai－qin，ZHAO Dan，ZHU Min
(College of Biology and Environment Engineering，Zhejiang Shuren University，Hangzhou 310015，China)

Curcumin is one of the important natural pigments used in food industry at home and abroad，showing great market potential.The optimization of extraction technology of curcumin from turmeric by microwave－assisted method was examined by scavenging abilities of DPPH·，using ethanol as extracting solvent based on single factor level test and response surface methodology optimization tests.Results showed that the optimum microwave extraction parameters were:solid－liquid ratio of 1∶43.81，microwave power for 540W，microwave treatment time for 30s and solvent 71.21%ethanol solution.Under these conditions，the clearance of DPPH·was 50.69%.

curcumin;microwave－assisted extraction;antioxidantl activity;response surface methodology(RSM)

TS201.1

A

1002－0306(2012)10－0302－05

姜黃素(curcumin)是從姜科植物的根莖中提取的一種具有抗氧化作用的天然化合物，廣泛添加于食品、化妝品和藥品中［1－2］。因其無毒、著色力強(qiáng)、分散性好等特點(diǎn)，是一種較理想的天然色素，可以添加到肉類食品、飲料和糖果中起到增色和抗氧化的作用，也可以添加到動(dòng)物飼料中提高動(dòng)物的免疫力和生產(chǎn)能力［3－5］;因其獨(dú)特的生物保護(hù)功能抑制了表面皮膚上的自由基，從而延緩衰老和抗紫外線損傷而應(yīng)用于化妝品中［6］;因其對生物膜脂質(zhì)和DNA的氧化性損傷有保護(hù)作用，具有抗炎癥、抗HIV病毒、抗癌、抗血栓和抗阿爾茨海默病，所以添加于藥物中［6］。已有研究表明:姜黃素對油脂過氧化反應(yīng)的抗氧化活性強(qiáng)于其他調(diào)味料，是維生素E抗氧化活性的8倍［7］;與合成的抗氧化劑BHT、BHA相比，姜黃素能強(qiáng)有力的阻斷脂質(zhì)過氧化物的合成［8］，也有姜黃用于艾滋病治療的報(bào)道［9－10］，但是姜黃素在高溫、強(qiáng)酸、強(qiáng)堿或強(qiáng)光環(huán)境中穩(wěn)定性較差［11］，因此，從姜黃中提取并分離出活性較高、較為純凈的姜黃素組分，有著重大的研究意義。與常規(guī)溶劑浸提相比，微波場可以為浸取過程提供特殊形式的能量，使浸取濃度、浸取率和浸取效率有顯著提高。姜黃素抗氧化活性常通過清除自由基和增強(qiáng)抗氧化生物酶的活性來考察，而對DPPH自由基的清除能力可以表示抗氧化能力的強(qiáng)弱。故本實(shí)驗(yàn)研究以姜黃素的抗氧化活性(對DPPH自由基的清除率)為指標(biāo)，以乙醇為溶劑，優(yōu)化了微波輔助提取姜黃中姜黃素的工藝參數(shù)，以期為進(jìn)一步拓展姜黃素的生產(chǎn)及在食品工業(yè)中的應(yīng)用提供一定的理論依據(jù)。

2011－09－05

劉彩琴(1975－)，女，副教授，研究方向:食品科學(xué)。

浙江省優(yōu)秀青年教師資助計(jì)劃。