朱 婧，王青艷，，劉演景，申乃坤，陳桂光，梁智群，*

(1.廣西科學(xué)院國家非糧生物質(zhì)能源工程技術(shù)研究中心，廣西南寧530007; 2.廣西大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，廣西南寧530005)

響應(yīng)面法分析優(yōu)化米曲霉產(chǎn)β-葡萄糖苷酶液體發(fā)酵培養(yǎng)基

朱 婧1，王青艷1，2，劉演景2，申乃坤1，陳桂光2，梁智群2，*

(1.廣西科學(xué)院國家非糧生物質(zhì)能源工程技術(shù)研究中心，廣西南寧530007; 2.廣西大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，廣西南寧530005)

利用快速有效的響應(yīng)面分析法對米曲霉ASPE0485產(chǎn)β－葡萄糖苷酶的發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化，利用Plackett－Burman顯著因子實驗和Box－Behnken響應(yīng)面分析優(yōu)化了β－葡萄糖苷酶產(chǎn)生菌的發(fā)酵培養(yǎng)基，確定搖瓶發(fā)酵的最佳培養(yǎng)基組成為(%，w/v):玉米芯3.8%、大豆蛋白胨0.5%、KH2PO40.5%、MgSO4·7H2O 0.05%、CaCl20.05%、吐溫－80 0.27%和接種量5.3%;在此條件下發(fā)酵，得到酶活為21.1U/mL比原始酶活(17.65U/mL)提高了19.55%。

米曲霉，β－葡萄糖苷酶，響應(yīng)面分析法

1 材料與方法

1.1 實驗材料

米曲霉ASPE0485(Aspergillus oryzae ASPE0485)廣西大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院食品與發(fā)酵工程研究所篩選并保藏;斜面培養(yǎng)基 10%(w/v)麩皮水煮30min，4層紗布過濾，濾液中添加2%葡萄糖，2%瓊脂，pH自然;種子培養(yǎng)基 50mL Mandels［4］微量元素鹽溶液中加入1%(W/V)植物蛋白胨，pH自然［5］;基礎(chǔ)搖瓶培養(yǎng)基 3%(W/V)玉米芯，0.2%(W/V)植物蛋白胨，0.4%(W/V)KH2PO4，0.04%(W/V)CaCl2，0.04%(W/V)MgSO4，pH自然，定容至50mL［4］。

表2 PB設(shè)計及其實驗結(jié)果Table 2 Experimental design and results of the PB

表3 PB設(shè)計的回歸分析結(jié)果Table 3 Results of the PB regression analysis

1.2 實驗方法

1.2.1 培養(yǎng)方法 種子液培養(yǎng)方法:250mL三角瓶裝液量50mL，每瓶種子培養(yǎng)基的接種量為1×106個孢子，培養(yǎng)溫度為28℃，搖床轉(zhuǎn)速為160r/min，培養(yǎng)時間為12h。

發(fā)酵培養(yǎng)方法:250mL三角瓶裝液量50mL，種子液以2%(V/V)的接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)基，培養(yǎng)溫度為28℃，搖床轉(zhuǎn)速為160r/min，培養(yǎng)時間為4d。

1.2.2 酶活力的測定

1.2.2.1 酶活力測定 以0.5%水楊苷為底物，準(zhǔn)備兩管平行樣及一個空白對照，各加入0.9mL底物(0.5%水楊苷)之后，各加入0.lmL酶液(以10s為間隔加樣)，空白對照以滅活的酶樣代替，50℃反應(yīng)30min后，測定OD540。

1.2.2.2 酶活力定義 在此反應(yīng)條件下(pH為4.8，溫度為50℃)，每分鐘每毫升酶液生成1μmol還原糖的酶量即一個酶活單位U，用U/mL表示［6］。

1.2.3 Plackett－Burman(PB)設(shè)計優(yōu)化［7］選取7個因素，實際實驗次數(shù)16次的Plackett－Burman(PB)設(shè)計，響應(yīng)值為β－葡萄糖苷酶酶活，為估計誤差增加4個中心點，實驗重復(fù)三次，實驗結(jié)果取3次的平均值。

1.2.4 最陡爬坡實驗 以實驗值變化的梯度方向為最陡爬坡法爬坡方向，根據(jù)各因素效應(yīng)值的大小確定變化步長逼近最佳值區(qū)域，初步估算響應(yīng)面實驗的中心點。

1.2.5 Box－Benhnken中心組合實驗設(shè)計［8－9］根據(jù)Box－Benhnken中心組合實驗設(shè)計原理，由Plackett－Burman實驗篩選出的三個顯著因子，并以最陡爬坡實驗結(jié)果確定實驗水平，設(shè)計了3因素3水平共15個實驗點的響應(yīng)面分析，如表1。

表1 Box－Behnken分析實驗因素水平表Table 1 Levels of the variables in the Box－Behnken design

本實驗用統(tǒng)計分析軟件Minitab對實驗結(jié)果進(jìn)行分析。每次實驗重復(fù)三次，每次三個平行。

2 結(jié)果與分析

2.1 Plackett－Burman(PB)設(shè)計實驗結(jié)果

實驗選用n=16的Plackett－Burman設(shè)計安排，各因素水平取值，實驗設(shè)計及結(jié)果分別見表2。

利用Minitab軟件分析各因素的主效應(yīng)，結(jié)果見表3，7個因素中對響應(yīng)值影響的顯著性順序為:玉米芯＞吐溫－80＞接種量＞KH2PO4＞CaCl2＞大豆蛋白胨＞MgSO4·7H2O。實驗中R2=0.9665。且根據(jù)表3中P值可知，玉米芯濃度、吐溫－80濃度、接種量這3個因素的可信度都在90%以上，對β－葡萄糖苷酶產(chǎn)量影響顯著，可考慮作為主要因素進(jìn)一步響應(yīng)面實驗，在其后的實驗中其他因素均為中心點水平。

2.2 最陡爬坡實驗結(jié)果

響應(yīng)面的擬合方程在考察的緊接鄰域里才能充分近似真實的情形，因此要先逼近最佳值區(qū)域，才可以建立有效的響應(yīng)面擬合方程。所以根據(jù)3個因素效應(yīng)大小的比例設(shè)定它們的變化方向及步長進(jìn)行實驗，設(shè)計及結(jié)果如表4所示?？梢?，最優(yōu)發(fā)酵條件在實驗2與實驗3之間，有顯著正效應(yīng)，故以實驗2的條件為響應(yīng)面實驗的中心點。

表4 最陡爬坡實驗設(shè)計和結(jié)果Table 4 Experimental design and results of steepest ascent

2.3 Box－Behnken設(shè)計和響應(yīng)面分析實驗結(jié)果

依據(jù)Plackett－Burman實驗和最陡爬坡實驗確定的3因素，分別為X1、X2、X3，根據(jù)Box－Benhnken的中心組合實驗設(shè)計原理，進(jìn)行3因素3水平共15個實驗點的實驗設(shè)計，實驗設(shè)計及結(jié)果見表5、表6。

表5 Box－Behnken實驗設(shè)計與結(jié)果Table 5 Experimental design and response of the Box－Behnken

利用Minitab統(tǒng)計軟件回歸擬合實驗數(shù)據(jù)(表6)可獲得三元二次回歸方程為:

回歸方程方差分析顯著性檢驗表明(表7)，該模型失擬不顯著，回歸顯著。并且該模型決定系數(shù)R2=0.9772，離回歸標(biāo)準(zhǔn)差S=0.67735，說明回歸方程的擬合程度較好，預(yù)測值和實測值之間具有高度的相關(guān)性可以應(yīng)用于β－葡萄糖苷酶生產(chǎn)的理論預(yù)測。

表6 Box－Behnken實驗的回歸分析結(jié)果Table 6 Results of the Box－Behnken regression analysis

表7 方差分析表Table 7 Analysis of variance and regression for the selected quadratic model

2.4 培養(yǎng)基最適組合

根據(jù)回歸方程可以利用Minitab繪出響應(yīng)面分析圖及其等高線，證實了擬合面有真實的極大值，見圖1～圖3。得出模型的極值點為:玉米芯濃度為3.824%(3.8%)，吐溫－80濃度為0.265%(0.27%)，接種量為5.266%(5.3%)，此時模型預(yù)測的極大值為21.80U/mL。

圖1 響應(yīng)面法(X1，X2)立體分析圖Fig.1 3D surface map of response surface(X1，X2)

2.5 回歸模型的驗證

在以上優(yōu)化條件下進(jìn)行驗證實驗，共進(jìn)行5批次250mL搖瓶實驗，取平均值為21.1U/mL。該結(jié)果與模型預(yù)測基本一致，表明所得的模型有一定的實驗指導(dǎo)意義。

3 結(jié)論與討論

現(xiàn)在許多研究工作顯示在微生物培養(yǎng)基的優(yōu)化工作中，合理地使用Plackett－Burman和響應(yīng)面分析法，能取得良好的效果，可以使研究、生產(chǎn)者在更廣泛的范圍內(nèi)考慮因素的組合。

圖2 響應(yīng)面法(X1，X3)立體分析圖Fig.2 3D surface map of Response surface(X1，X3)

圖3 響應(yīng)面法(X2，X3)立體分析圖Fig.3 3D surface map of Response surface(X2，X3)

本研究證明將Plackett－Burman篩選與響應(yīng)面分析相結(jié)合對米曲霉ASPE0485所產(chǎn)β－葡萄糖苷酶的培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化，效果顯著。確定顯著影響因子為碳源、接種量和表面活性劑，通過最陡爬坡及Box－Benhnken響應(yīng)面實驗確定最佳發(fā)酵培養(yǎng)基配方為(%，w/v):玉米芯3.8%、大豆蛋白胨0.5%、KH2PO40.5%、MgSO4·7H2O 0.05%、CaCl20.05%、吐溫－80 0.27%和接種量5.3%;在此條件下發(fā)酵，得到酶活為21.1U/mL，比原始酶活(17.65U/mL)提高了19.55%。由此可知響應(yīng)面法可快速有效且直觀的選擇實驗設(shè)計中的最優(yōu)化條件，能夠降低開發(fā)成本、優(yōu)化加工條件，為提高產(chǎn)品質(zhì)量、解決生產(chǎn)過程中的實際問題提供了一種有效方法。本文選用的響應(yīng)面分析法優(yōu)化培養(yǎng)基，提高了發(fā)酵水平，為發(fā)酵優(yōu)化方法提供一定的借鑒作用，為工業(yè)化發(fā)酵生產(chǎn)β－葡萄糖苷酶奠定了理論基礎(chǔ)。

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Optimization and analysis of β－glucosidase production by Aspergillus oryzae in liquid cultures using response surface methodology

ZHU Jing1，WANG Qing－yan1，2，LIU Yan－jing2，SHE Nai－kun1，CHEN Gui－guang2，LIANG Zhi－qun2，*
(1.National Engineering Research Center for Non－food Biorefinery，Guangxi Academy of Sciences，Nanning 530007，China; 2.Life Science and Technology College，Guangxi University，Nanning 530005，China)

Response surface analysis was conducted on Aspergillus oryzae ASPE0485 to determine the optimal culture medium for β－glucosidase fermentation.The Box－Behnken and Plackett－Burman design was utilized to the response surface analysis to determine the optimal culture medium consistents(%，w/v)were as follow:corncob 3.8%、soya peptone 0.5%、KH2PO40.5%、MgSO4·7H2O 0.05%、CaCl20.05%、tween－80 0.27%and inoculum size 5.3%.The β－glucosidase activity was 21.1U/mL under the optimal conditions，which was more 19.55%than the original strain activity(17.65U/mL).

Aspergillus oryzae;β－glucosidase;response surface analysis

TS201.3

A

1002－0306(2012)08－0215－04

β－葡萄糖苷酶(EC3，2，1，21)屬于水解酶系，廣泛地存在于自然界許多植物體及酵母、曲霉菌、木霉菌屬、細(xì)菌等微生物體系內(nèi)。它的作用是水解結(jié)合于未端、非還原性的β－D－糖苷鍵，同時釋放β－D－葡萄糖和相應(yīng)的配基。在纖維素的糖化作用中，β－葡萄糖苷酶的功能是將纖維素二糖和纖維素寡糖水解成葡萄糖［1］。β－葡萄糖苷酶是纖維素酶系的重要成員，而且由于其在纖維素酶組分中含量最少、活力普遍較低，成為纖維素酶解的主要瓶頸。因此，增強纖維素酶體系中β－葡萄糖苷酶的活力，是提高纖維素水解得率和葡萄糖產(chǎn)量的關(guān)鍵措施之一。米曲霉是美國食品與藥物管理局和美國飼料公司協(xié)會在1989年公布的40余種安全微生物菌種之一，已廣泛地應(yīng)用于食品、醫(yī)藥及飼料等工業(yè)中。本文采用響應(yīng)面法(RSM)對米曲霉ASPE0485所產(chǎn)的β－葡萄糖苷酶的發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化，從而提高β－葡萄糖苷酶產(chǎn)量，為規(guī)模化生產(chǎn) β－葡萄糖苷酶提供理論基礎(chǔ)［2－3］。

2011－07－11 *通訊聯(lián)系人

朱婧(1983－)，女，碩士研究生，研究實習(xí)員，研究方向:發(fā)酵工程。

桂科攻(09YJ17SW02);桂科攻(1099070)。