徐 偉，王麗婷

(哈爾濱商業(yè)大學(xué)食品工程學(xué)院，黑龍江哈爾濱150076)

秸稈基質(zhì)中木質(zhì)素白腐菌降解的SEM特征觀察

徐 偉，王麗婷

(哈爾濱商業(yè)大學(xué)食品工程學(xué)院，黑龍江哈爾濱150076)

研究了黃孢原毛平革菌(Phanerochaete Chrysosporium Burdsall)對(duì)大豆和稻草秸稈中木質(zhì)素的降解條件及降解效果。結(jié)果顯示:在各5.0g秸稈中，加入合成培養(yǎng)液12mL、菌懸液濃度8.6×106cfu/mL時(shí)，種子添加量為0.8mL、培養(yǎng)基pH4.5，降解10d，測(cè)得木質(zhì)素降解率分別為大豆秸稈49.91%、稻草秸稈49.50%。利用SEM對(duì)發(fā)酵前后秸稈表觀結(jié)構(gòu)進(jìn)行觀察，得到黃孢原毛平革菌對(duì)大豆和稻草秸稈有明顯的降解效果。經(jīng)黃孢原毛平革菌降解10d的大豆和稻草秸稈表面空穴增多、增大，甚至相互連通，降解效果明顯。

大豆秸稈，稻草，黃孢原毛平革菌，木質(zhì)素，掃描電鏡(SEM)

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

黃孢原毛平革菌(Phanerochaete chrysosporium)購(gòu)于中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏中心(CICC)，菌種編號(hào):40719;大豆秸稈 內(nèi)蒙古莫旗;稻草 黑龍江省五常農(nóng)村;PDA培養(yǎng)基 去皮馬鈴薯200g/L、葡萄糖20g/L、瓊脂20g/L，pH自然;種子培養(yǎng)基［6］葡萄糖20g/L，玉米漿50mL/L，(NH4)2SO40.1g/L，KH2PO40.5g/L，MgSO4·7H2O 0.5g/L，VB10.5mg/L;發(fā)酵培養(yǎng)基 稱取5.0g大豆秸稈粉(稻草粉)于250mL三角瓶中，加入合成培養(yǎng)液，高壓蒸氣 121℃滅菌20～30min，取出后備用;合成培養(yǎng)液［7－8］(NH4)2SO415g/L、KH2PO44.0g/L、MgSO4·7H2O 0.2g/L、CaCl20.2g/L、VB110mg/L、FeSO4·7H2O 0.1g/L、CoCl2·6H2O 0.1g/L、ZnSO4·7H2O 0.1g/L、CuSO4·5H2O 0.02g/L、AlK(SO4)2·12H2O 0.02g/L、Na2B4O7·10H2O 0.05g/L、(NH4)2MoO4·4H2O 0.02g/L、吐溫－80 3mL/L。

LZDX－50KB高壓蒸汽滅菌鍋 上海申安醫(yī)療器械廠;DHG－9123電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱、DHP9162恒溫培養(yǎng)箱 上海一恒科技有限公司;HZQ－C空氣浴振蕩器 哈爾濱東聯(lián)電子開發(fā)技術(shù)有限公司;S－3400N掃描電子顯微鏡 HITACHI。

1.2 木質(zhì)素含量測(cè)定方法

采用王萬玉系統(tǒng)分析法［10］:

2 結(jié)果與分析

研究黃孢原毛平革菌對(duì)木質(zhì)素降解率的影響因素包括:合成培養(yǎng)液添加量、接種量和pH，均在溫度為35℃，濕度為86%的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)10d。

2.1 合成培養(yǎng)液添加量對(duì)降解率的影響

在培養(yǎng)基初始pH 4.5條件下，將種子液以每瓶0.8mL的接種量分別接到合成培養(yǎng)液添加量為6、8、10、12、14、16mL滅好菌的發(fā)酵的培養(yǎng)基中，測(cè)定10d后秸稈中木質(zhì)素的降解率，結(jié)果如圖1所示。

圖1 合成培養(yǎng)液添加量對(duì)大豆和稻草秸稈木質(zhì)素降解率的影響Fig.1 The effect of the amount of synthesis adding liquor on the degradation rate of soybean straw lignin and rice straw lignin

固體發(fā)酵培養(yǎng)時(shí)，合成培養(yǎng)液添加量過高，三角瓶?jī)?nèi)的濕度高、溶氧量低不易于菌體生長(zhǎng)，菌體產(chǎn)酶量低，導(dǎo)致木質(zhì)纖維素降解率低。合成培養(yǎng)液添加量過低，同樣會(huì)影響菌體生長(zhǎng)，導(dǎo)致木質(zhì)纖維素降解率低。在合成培養(yǎng)液添加量為12mL時(shí)，大豆秸稈和稻草秸稈木質(zhì)素降解率最高，分別為 49.91%和49.24%。

2.2 接種量對(duì)降解率的影響

將種子液(孢子懸液濃度8.6×106cfu/mL)、分別以0.2、0.5、0.8、1.1、1.4、1.7mL的接種量接種到已加入12mL合成培養(yǎng)液、初始pH4.5發(fā)酵培養(yǎng)基中，測(cè)定10d后秸稈中木質(zhì)素降解率，結(jié)果如圖2所示。

在實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行固體發(fā)酵時(shí)營(yíng)養(yǎng)條件是一定的，接種量低，菌體之間生存競(jìng)爭(zhēng)少，菌體生長(zhǎng)良好利于菌體產(chǎn)酶，但發(fā)酵周期長(zhǎng)。接種量高，菌體之間生存競(jìng)爭(zhēng)激烈，雖發(fā)酵周期短，但不利于菌體產(chǎn)酶，降解率低。不同菌種對(duì)環(huán)境條件以及營(yíng)養(yǎng)條件的不同需求，導(dǎo)致會(huì)有不同的適宜接種量。對(duì)于不同的菌種，接種量的選取是十分重要的。由圖2可知接種量達(dá)到0.8mL時(shí)，大豆和稻草秸稈木質(zhì)素降解率為49.35%和46.21%。

圖2 接種量對(duì)大豆和稻草秸稈木質(zhì)素降解率的影響Fig.2 The effect of inoculation on the degradation rate of soybean straw lignin and rice straw lignin

2.3 培養(yǎng)基初始pH對(duì)降解率的影響

將種子液以每瓶0.8mL的接種量接種到已加入12mL合成培養(yǎng)液的培養(yǎng)基中，調(diào)節(jié)pH分別為3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0，測(cè)定10d后秸稈中木質(zhì)素降解率，結(jié)果如圖3所示。

圖3 pH對(duì)大豆和稻草秸稈木質(zhì)素降解率的影響Fig.3 The degradation law’s effect of soybean straw lignin and rice straw lignin by pH

培養(yǎng)基初始pH直接影響菌株生長(zhǎng)和代謝活動(dòng)，一般要求初始pH應(yīng)使菌株快速生長(zhǎng)而且有利于目標(biāo)物質(zhì)的代謝合成。黃孢原毛平革菌最適生長(zhǎng)pH通常為弱酸性。由圖3可以看出pH為4.5時(shí)，大豆和稻草秸稈木質(zhì)素的降解率最高。這可能是偏酸性條件一方面會(huì)促進(jìn)白腐菌的生長(zhǎng)，另一方面是由于木質(zhì)纖維素酶系的最適pH偏酸性，能使分泌的酶保持較高的活性。侯紅漫［11］等認(rèn)為當(dāng)pH低于3時(shí)，不利于白腐菌菌體的生長(zhǎng)，pH高于6時(shí)，雖然可以讓菌體生長(zhǎng)良好，但是不利于酶的合成。

2.4 秸稈降解的表征分析觀察(SEM)

白腐菌降解大豆和稻草秸稈時(shí)，分泌木質(zhì)素過氧化物酶系、錳過氧化物酶系、漆酶及過氧化氫酶等，使大豆和稻草秸稈的表面受到破壞。研究秸稈表觀結(jié)構(gòu)在發(fā)酵中的變化，為深入探討白腐菌降解木質(zhì)素的效果提供參考。通過黃孢原毛平革菌對(duì)木質(zhì)素降解率的影響因素的實(shí)驗(yàn)，最后得到加入合成培養(yǎng)液12mL、種子添加量為0.8mL、培養(yǎng)基pH4.5條件下木質(zhì)素降解率是最高的。圖4是大豆和稻草秸稈降解前后橫切面和內(nèi)外表面掃描電鏡結(jié)果。

圖4 白腐菌以大豆與稻草秸稈為基質(zhì)降解10d后SEM結(jié)果Fig.4 The SEM results of degradation of soybean straw and rice straw by Phanerochaete Chrysosporium Burdsall for 10d

由圖4(a)、(b)、(e)、(f)可知，原始大豆秸稈表面及內(nèi)部纖維束均勻、整齊、平滑，呈自然伸展?fàn)顟B(tài)，結(jié)構(gòu)緊密規(guī)整，質(zhì)地堅(jiān)硬。維管內(nèi)部結(jié)構(gòu)致密、光滑，空穴偶有可見，橫切面維管束壁結(jié)構(gòu)比較緊湊;秸稈表面光滑，被一層蠟所覆蓋，無空穴。原始稻草秸稈的表觀結(jié)構(gòu)緊密規(guī)整，稻草秸稈內(nèi)表面光滑，被一層蠟所覆蓋，無空穴;外表面有些許凸起粗糙，結(jié)構(gòu)緊密無縫隙。

大豆和稻草秸稈經(jīng)過黃孢原毛平革菌降解10d后，由圖4(c)、(d)可見，大豆秸稈結(jié)構(gòu)遭到嚴(yán)重破壞，橫截面圖可明顯發(fā)現(xiàn)無完整維管束，大部分已被破壞;空穴增多、增大，秸稈被嚴(yán)重破壞。圖4(g)、(h)可見稻草秸稈的內(nèi)、外表面均存在很多的裂縫和孔洞。

3 結(jié)果與討論

木質(zhì)素是由苯基－丙烷結(jié)構(gòu)單元通過醚鍵、碳－碳鍵聯(lián)結(jié)而成的具有三維結(jié)構(gòu)的芳香族高分子化合物［12－15］。木質(zhì)素很難降解，同時(shí)也無法形成發(fā)酵性糖類，黃孢原毛平革菌中含有降解木質(zhì)素能力的酶類。通過實(shí)驗(yàn)得到在合成培養(yǎng)液12mL、種子添加量為0.8mL、培養(yǎng)基pH 4.5條件下，經(jīng)黃孢原毛平革菌降解10d木質(zhì)素降解率最高，測(cè)得降解率分別為大豆秸稈49.91%、稻草秸稈49.50%。同時(shí)通過大豆和稻草秸稈降解10d與未降解時(shí)的SEM對(duì)比觀察發(fā)現(xiàn)，降解10d的大豆和稻草秸稈表面空穴增多、增大，甚至相互連通，說明降解效果明顯。

黃孢原毛平革菌降解大豆和稻草秸稈時(shí)，先降解秸稈表面木質(zhì)素，生成空穴，之后菌絲通過空穴進(jìn)入秸稈內(nèi)部，分泌酶系進(jìn)一步降解秸稈內(nèi)部成分。黃孢原毛平革菌反應(yīng)條件溫和、處理成本低、能耗低、專一性強(qiáng)、不存在環(huán)境污染等優(yōu)點(diǎn)?？梢娪牲S孢原毛平革菌降解農(nóng)作物秸稈，使其資源化、環(huán)境化，是具有可行性的。

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Observation and utilization of characteristics of white－rotfungi degrades lignin of the straw’s stroma by SEM

XU Wei，WANG Li－ting

(College of Food Science and Engineering，Harbin University of Commerce，Harbin 150076，China)

The degradation law of soybean straw lignin and rice straw lignin by Phanerochaete chrysosporium was studied.The results showed that the amount of synthesis adding liquor was 12mL and quantity was 0.8mL in the two kind 5g straw powder，the quantity of inoculum which concentration of Phanerochaete Chrysosporium Burdsall was 8.6×106cfu/mL，inoculation was 0.8mL，the medium of initial pH was 4.5，the degradation time was 10d.Then the degradation rates of the soybean straw lignin was 49.91%and the rice straw lignin was 49.50%，respectiely.By using scanning electron microscopy(SEM)，the apparent structure of straw before and after fermentation was observed.The results showed that the capacities of degrading soybean straw and rice straw by Phanerochaete Chrysosporium Burdsall was strong.The surface holes of soybean straw and rice straw increased in number and largen in volume and evensome linked together after degradation for 10d by Phanerochaete Chrysosporium Burdsall.The degradation impaction was obvious.

soybean straw;rice straw;Phanerochaete Chrysosporium Burdsall;lignin;SEM

TS210.1

A

1002－0306(2012)08－0225－03

黑龍江省是全國(guó)農(nóng)業(yè)大省，大豆秸稈和稻草產(chǎn)量非常大，但大多秸稈資源被焚燒，造成了大氣污染。秸稈是一種豐富的纖維素資源，在木質(zhì)纖維質(zhì)原料的細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)中，纖維素是被木質(zhì)素和半纖維素包裹著的，因此，將木質(zhì)素降解，對(duì)其進(jìn)行預(yù)處理，是提高纖維質(zhì)原料后續(xù)發(fā)酵效率的重要方式。利用微生物降解大豆和稻草秸稈中的木質(zhì)素，是使其資源化、環(huán)境化的有效途徑。秸稈主要由木質(zhì)纖維素以及少量蛋白質(zhì)、脂肪、醇類、醛、酮和有機(jī)酸等組成［1－3］，木質(zhì)纖維素由木質(zhì)素、纖維素、半纖維素三者構(gòu)成［4］。大豆秸稈木質(zhì)素含量約為18%、稻草秸稈木質(zhì)素含量約為15%［5］。以含有木質(zhì)素的農(nóng)業(yè)廢棄物秸稈為基質(zhì)，利用黃孢原毛平革菌降解木質(zhì)纖維素的復(fù)雜結(jié)構(gòu)，對(duì)于有效地利用和轉(zhuǎn)化秸稈資源，擴(kuò)大發(fā)酵產(chǎn)品工業(yè)原料來源，減少工業(yè)用糧，降低發(fā)酵產(chǎn)物成本，都具有一定的現(xiàn)實(shí)意義。

2011－07－04

徐偉(1963－)，女，博士，副教授，研究方向:微生物發(fā)酵工程。

黑龍江教育廳科技面上項(xiàng)目(12511130)。