孫學(xué)玲，孫 巖，張娟娟，趙 娜，梁廣智，劉曉影，成 敏，高玉光

(山東濰坊醫(yī)學(xué)院口腔醫(yī)學(xué)研究所，山東濰坊 261053)

金屬基質(zhì)蛋白酶－20(matrix metalloproteinase 20，MMP20)是牙齒特異性表達(dá)的蛋白酶，在牙釉質(zhì)蛋白的降解中發(fā)揮主要的作用。有研究表明［1］，MMP20基因敲除小鼠的牙釉質(zhì)礦化程度及硬度均顯著降低。我們?cè)谝酝芯恐邪l(fā)現(xiàn)［2－3］TGF－β1參與了牙釉質(zhì)發(fā)育并調(diào)控成釉細(xì)胞MMP20基因的表達(dá)。為進(jìn)一步研究TGF－β1調(diào)控MMP20的分子機(jī)制，本實(shí)驗(yàn)觀察了轉(zhuǎn)錄因子Runx2在TGF－β1調(diào)控MMP20基因表達(dá)中的作用。

1 材料和方法

1.1 主要材料

小鼠成釉細(xì)胞系(日本Akita大學(xué)Sugiyama教授饋贈(zèng));雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)系統(tǒng)試劑盒、TransFastTMTransfection Reagent(Promega公司);RNAiso Plus、MutanBEST Kit、蛋白酶 K(TaKaRa 公司);SYBR Green PCR Master Mix(Roche公司);TGF－beta1(Perotech Inc公司);胰蛋白酶、DMEM培養(yǎng)基(Hyclone公司);胎牛血清(杭州四季青公司);割膠回收試劑盒、質(zhì)粒小抽提取試劑盒、pepstatin、aprotinin9(BBI公 司);IQ5TMPCR 儀(Bio－Rad 公 司 );SirinsL Tube Luminometer(Berthold公司);protein A agarose beads(Upstate公司);質(zhì)粒 PGL3－basic、內(nèi)參照質(zhì)粒 pRL40均為實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

小鼠成釉細(xì)胞系(ALC)常規(guī)復(fù)蘇后，用DMEM(含100 mL/L胎牛血清)培養(yǎng)液在37℃、50 mL/L CO2、飽和濕度條件下進(jìn)行培養(yǎng)并傳代，細(xì)胞傳至5代以上，用于實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)

待細(xì)胞長(zhǎng)滿至70% ～80%時(shí)，按照TransFastTMTransfection Reagent操作說(shuō)明書進(jìn)行質(zhì)粒轉(zhuǎn)染。以PGL3－basic為陰性對(duì)照，pRL40為內(nèi)參對(duì)照，實(shí)驗(yàn)分4 組。組1:PGL3－basic;組2:PGL3－basic+TGF－beta1;組 3:PGL3－MMP20;組 4:PGL3－MMP20+TGF－beta1;其中PGL3－MMP20為本實(shí)驗(yàn)室克隆并保存的鼠MMP20啟動(dòng)子不同長(zhǎng)度的熒光素酶表達(dá)載體的質(zhì)粒。待培養(yǎng)30 h后，加入0.5 ng/mL TGF－β1，繼續(xù)培養(yǎng)3 h。成釉細(xì)胞裂解前先用PBS洗滌1次，再用100 μL細(xì)胞裂解液PLB裂解細(xì)胞;在加樣管加入100 μL的Luciferase Assay ReagentⅡ(LARⅡ)，吸取20 μL細(xì)胞裂解液與之混勻，并加樣于熒光素酶檢測(cè)儀，檢測(cè)10 s時(shí)的螢火蟲熒光素酶(Firefly luciferase)激發(fā)底物釋放熒光的數(shù)值U1。然后加入100 μL 的stop＆Glo Reagent，檢測(cè)樣品中海腎熒光素酶(Renilla luciferase)激發(fā)底物釋放熒光的數(shù)值U2。每一樣品均取U1/U2之值為該質(zhì)粒報(bào)告基因的熒光素酶相對(duì)活性，每組3個(gè)樣本，重復(fù)3次。

1.2.3 染色體免疫共沉淀

利用TFSEARCH、AliBaba 2.1工具分析得到Runx2結(jié)合的特異性序列“TGTGGG”，該位點(diǎn)位于MMP20啟動(dòng)子－383～－375區(qū)域內(nèi)。針對(duì)這一潛在結(jié)合位點(diǎn)設(shè)計(jì)引物，上游 P1:5’－ATTCTTTTACAATAGGATGC－3’;下游 P2:5’－TTCAGTGACTCTTTACTCTTTA－3’。預(yù)計(jì)片段為 163 bp，由寶生物工程大連有限公司合成。反應(yīng)條件94℃4 min，94℃ 30 s，51℃ 30 s，72℃ 20 s，34個(gè)循環(huán)后72℃延伸5 min。取成釉細(xì)胞用終濃度為10 mL/L的甲醛溶液在37℃下固定10 min，裂解細(xì)胞并取上清液，用超聲波將DNA破碎至500 bp左右后，實(shí)驗(yàn)組按濃度1∶500滴加兔抗鼠Runx2抗體(Santa Cruz公司)，同時(shí)IgG組滴加等濃度的羊抗兔無(wú)關(guān)抗體，陰性對(duì)照不加任何抗體，4℃孵育過(guò)夜，瓊脂糖珠A沉淀離心，收集蛋白質(zhì)染色體免疫復(fù)合物，經(jīng)解交聯(lián)、消化蛋白后，每組取等量DNA純化液用PCR進(jìn)行DNA鑒定。其中陽(yáng)性對(duì)照組取等量DNA破碎原液為模板。

1.2.4 基因突變及雙熒光素酶報(bào)告基因載體的構(gòu)建

根據(jù)MutanBEST Kit試劑盒說(shuō)明設(shè)計(jì)5’端鄰接，3’端方向相反的引物，用以導(dǎo)入突變位點(diǎn)。將Runx2結(jié)合位點(diǎn)由“TGTGGG”突變?yōu)椤癟GTAAG”。上游引物 P3:5’－CCTGTAAGTGCAAATAAAGAGTAAAG－3’;下游引物 P4:5’－CAAGCCTGATGACCTGGGTT－3’;以本實(shí)驗(yàn)室克隆并保存的鼠MMP20啟動(dòng)子序列(－488～+23)為模板;將導(dǎo)入突變位點(diǎn)的啟動(dòng)子序列連至PGL3－basic，經(jīng)酶切測(cè)序鑒定正確后，命名質(zhì)粒為 PGL3－MMP20(－488～ +23)－MUT。

1.2.5 Western Blot

待Runx2 siRNA和control siRNA(均為實(shí)驗(yàn)室保存)轉(zhuǎn)染成釉細(xì)胞60 h后，裂解細(xì)胞，并提取蛋白上清，經(jīng)SDS－PAGE、半干轉(zhuǎn)印，轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素濾膜上(轉(zhuǎn)印條件15 V，轉(zhuǎn)印時(shí)間25 min)，用兔抗鼠的Runx2抗體與膜上的蛋白進(jìn)行抗原抗體反應(yīng)，ELC試劑盒檢測(cè)。

1.2.6 實(shí)時(shí)定量 RT－PCR

以成釉細(xì)胞提取的總RNA逆轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板，進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR，用于檢測(cè)MMP20基因表達(dá)的改變。引物序列:內(nèi)參對(duì)照GAPDH，F(xiàn):5'－ TGTGTCCGTCGTGGATCTGA－3';R:5'－TTGCTGTTGAAGTCGCAGGAG －3';MMP20，F(xiàn):5'－GGCGAGATGGTGGCAAGAG－3';R:5'－CTGGGAAGAGGCGGTAGTT－3'。反應(yīng)條件94℃ 4 min，94℃ 10 s，60℃ 15 s，72℃ 25 s，80℃ 15 s采集熒光，40個(gè)循環(huán)后72℃延伸5 min。反應(yīng)在IQ5TMPCR儀進(jìn)行，每個(gè)樣本3個(gè)復(fù)孔，重復(fù)3次。用配對(duì)t檢驗(yàn)分析實(shí)時(shí)定量RT－PCR結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 TGF－β1調(diào)控成釉細(xì)胞MMP20啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄活性

首先觀察TGF－β1對(duì)MMP20啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄活性的影響。待細(xì)胞長(zhǎng)滿至70% ～80%，分別將PGL3－basic或 PGL3－MMP20(圖 1a)與 pRL40 質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染30 h 后，加入0.5 ng/mL TGF－β1，繼續(xù)培養(yǎng)3 h。TGF－β1刺激成釉細(xì)胞后，PGL3－MMP20熒光活性在－87～+23區(qū)域無(wú)明顯變化外，其他各區(qū)域活性均上調(diào)，其中－488～+23區(qū)域熒光素酶的活性顯著增強(qiáng)(P﹤0.05)(圖1b)。

圖1 TGFβ－1調(diào)控成釉細(xì)胞MMP20啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄活性

2.2 Runx2調(diào)控成釉細(xì)胞MMP20啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄活性

首先利用TFSEARCH、AliBaba 2.1工具分析得到Runx2結(jié)合的特異性序列“TGTGGG”，該序列“TGTGGG”位于MMP20啟動(dòng)子－383～－375區(qū)域內(nèi)(圖2a)。由圖2b所示用PCR方法鑒定Runx2抗體沉淀分離出的特異性DNA序列。其中實(shí)驗(yàn)組與其他各組對(duì)照后，得到清晰顯著的條帶，與預(yù)計(jì)的大小相符，說(shuō)明該位點(diǎn)“TGTGGG”是Runx2特異性結(jié)合位點(diǎn)。進(jìn)一步將該位點(diǎn)突變后連至PGL3－Basic。以PMD 18 Simple T－MMP20(－488～ +23)(實(shí)驗(yàn)室保存)為模板，P3、P4為引物，擴(kuò)增出約3203 bp大小的片段，經(jīng)自身連接(環(huán)化反應(yīng))后，抽提質(zhì)粒連至PGL3－Basic，酶切測(cè)序鑒定證實(shí)特異性結(jié)合位點(diǎn)“TGTGGG”突變?yōu)椤癟GTAAG”(圖 2c、d)。最后將PGL3－MMP20(－488 ～ +23)－WT、PGL3－MMP20(－488～+23)－MUT與10 ng的Runx2共轉(zhuǎn)染細(xì)胞30 h。與野生型MMP20啟動(dòng)子相比，Runx2結(jié)合位點(diǎn)的突變明顯抑制MMP20啟動(dòng)子的活性(P﹤0.05)(圖2e)。

2.3 TGF－β1和 Runx2 siRNA調(diào)控成釉細(xì)胞MMP20基因表達(dá)的研究

為進(jìn)一步明確 Runx2參與介導(dǎo) TGF－β1對(duì)MMP20基因表達(dá)的調(diào)控，首先Western Blot結(jié)果顯示:成釉細(xì)胞中 Runx2蛋白表達(dá)水平顯著減弱(圖3a)。表明Runx2 siRNA有效阻斷Runx2蛋白的表達(dá)。將Runx2 siRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞60 h后，加入含TGF－β1(0.5 ng/mL)的 DMEM 培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)3 h。Runx2基因沉默后，顯著抑制 TGF－β1對(duì)成釉細(xì)胞MMP20 mRNA表達(dá)水平的上調(diào)作用(P ﹤0.05)(圖3b)。

圖2 Runx2調(diào)控成釉細(xì)胞MMP20啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄活性

圖3 Runx2介導(dǎo)TGF－β1調(diào)控MMP20基因的表達(dá)

3 討論

Runx2是牙齒發(fā)育過(guò)程中起關(guān)鍵作用的轉(zhuǎn)錄因子之一，研究已證實(shí)［4－5］:Runx2基因表達(dá)缺陷小鼠無(wú)牙本質(zhì)和釉質(zhì)發(fā)生。臨床上Runx2表達(dá)缺陷會(huì)導(dǎo)致鎖骨顱骨發(fā)育不全［6－8］，而且牙齒成熟延遲，但Runx2在釉質(zhì)發(fā)育中發(fā)揮作用的分子機(jī)制尚不清楚。在釉質(zhì)發(fā)育過(guò)程中，TGF－β1信號(hào)通路參與了 MMP20 基因表達(dá)的調(diào)控［2－3］，并且TGF－β1與MMP20在釉質(zhì)基質(zhì)的分泌期與成熟期早期呈現(xiàn)共表達(dá)特征［3，9］，因此推測(cè) Runx2 可能參與TGF－β1信號(hào)通路調(diào)控MMP20的表達(dá)。本實(shí)驗(yàn)以小鼠成釉細(xì)胞系為模型，首先利用雙熒光素酶基因報(bào)告系統(tǒng)探討了TGF－β1對(duì)不同長(zhǎng)度MMP20啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄活性的影響。我們以往研究表明，TGF－β1參與了成釉細(xì)胞MMP20啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄活性的調(diào)控［3］。本研究通過(guò)熒光素酶分析進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，對(duì)于不同長(zhǎng)度MMP20啟動(dòng)子，TGF－β1的作用存在明顯不同(圖1b)。我們利用生物學(xué)信息工具分析了MMP20啟動(dòng)子，發(fā)現(xiàn)該啟動(dòng)子在－383～－375區(qū)域內(nèi)存在潛在的Runx2結(jié)合位點(diǎn)“TGTGGG”，因此我們利用染色體免疫共沉淀技術(shù)觀察了Runx2與MMP20啟動(dòng)子“TGTGGG”序列的相互作用(圖2b)，進(jìn)一步表明成釉細(xì)胞內(nèi)Runx2與MMP20啟動(dòng)子存在相互作用。運(yùn)用基因定點(diǎn)突變技術(shù)我們將“TGTGGG”突變?yōu)椤癟GTAAG”后，再利用雙熒光素酶基因報(bào)告系統(tǒng)檢測(cè)MMP20啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄活性。與野生型 MMP20啟動(dòng)子相比，Runx2上調(diào)MMP20轉(zhuǎn)錄活性的作用因Runx2位點(diǎn)的突變而不明顯(圖2e)，提示轉(zhuǎn)錄因子Runx2參與了調(diào)控MMP20啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄活性。因此我們推測(cè)Runx2可能參與了成釉細(xì)胞MMP20基因的表達(dá)。我們將Runx2 siRNA片段轉(zhuǎn)染成釉細(xì)胞后，Runx2蛋白表達(dá)水平下降，TGF－β1上調(diào)MMP20基因表達(dá)的作用顯著減弱(圖3)，表明Runx2介導(dǎo)TGF－β1調(diào)控MMP20基因的表達(dá)。本實(shí)驗(yàn)分別在基因轉(zhuǎn)錄和基因表達(dá)水平上探討了Runx2在TGF－β1誘導(dǎo)MMP20基因表達(dá)中的作用機(jī)制，進(jìn)一步闡明了釉質(zhì)發(fā)育的分子調(diào)控機(jī)制。

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