李海英， 張 力， 潘歡樂， 方 雅， 吳建波

(溫州醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院，浙江 溫州 325000)

1000-4718(2012)09-1623-04

2012-04-07

2012-08-08

浙江省自然科學(xué)基金資助項目(No.LQ12H16005)

△ 通訊作者 Tel: 0577-88069372; E-mail: 21182907@qq.com

Wnt信號通路在食管癌細(xì)胞放射抗拒性形成中的作用*

李海英， 張 力△， 潘歡樂， 方 雅， 吳建波

(溫州醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院，浙江 溫州 325000)

目的研究Wnt信號通路在食管癌細(xì)胞放射抗拒性形成中的作用。方法采用real-time RT-PCR檢測Wnt通路mRNA的表達(dá)；Western blotting和免疫熒光檢測Wnt通路蛋白的表達(dá)；動物成瘤實驗比較細(xì)胞在體內(nèi)的增殖和成瘤能力。結(jié)果Wnt1表達(dá)上調(diào)引起Wnt通路激活，繼而引起下游一系列的基因表達(dá)改變；β-連環(huán)蛋白(β-catenin)在細(xì)胞內(nèi)蓄積，并向核內(nèi)轉(zhuǎn)移，調(diào)控的下游蛋白細(xì)胞周期蛋白D1(cyclin D1)和WISP1表達(dá)量增多；放射抗拒性的食管癌細(xì)胞在小鼠體內(nèi)表現(xiàn)出更強的增殖和成瘤能力。結(jié)論Wnt信號通路引起的細(xì)胞增殖加速可能是食管癌細(xì)胞放射抗拒性形成的重要原因。

Wnt信號通路； 食管腫廇； 放射抗拒性

放射治療是早期食管癌的首選治療手段，但是，就像其它上皮癌細(xì)胞一樣，食管癌細(xì)胞對電離輻射僅僅中度敏感。大約50%的病人在同步放化療后出現(xiàn)局部復(fù)發(fā)，輻射劑量增加導(dǎo)致毒性增加而治療效果卻沒有改善[1-2]。食管癌在放療后經(jīng)常以小病灶的形式復(fù)發(fā)或進(jìn)展，提示有一部分腫瘤細(xì)胞能再生長或存在放射抗拒性。本課題組先前已經(jīng)報告了食管癌細(xì)胞株在分次照射后與其親代比放射抗拒性增強，同時證明分次照射建立的放射抗拒性食管癌細(xì)胞株表現(xiàn)出腫瘤干細(xì)胞樣特征[3]。我們又利用Agilent 4×44k全基因芯片對食管癌細(xì)胞原株和放射抗拒株的基因表達(dá)進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)Wnt(wingless-type MMTV integration site family)通路上有多個基因表達(dá)出現(xiàn)差異[4]，因此推測Wnt信號通路與放射抗拒性的形成有關(guān)。本實驗旨在研究Wnt信號通路在食管癌細(xì)胞放射抗拒性形成中的作用。

材 料 和 方 法

1試劑

β-連環(huán)蛋白(β-catenin)、GAPDH和Wnt1誘導(dǎo)信號通路蛋白1(Wnt1 inducible signaling pathway protein 1,WISP1)單抗購自Santa Cruz，糖原合成酶3β(glycogen synthase kinase 3 beta,GSK3β)、p-GSK3β(pS9)和細(xì)胞周期蛋白D1(cyclin D1)抗體購自Epitomics，p-β-catenin(Ser33/37/Thr41)抗體購自Cell Signaling Technology，熒光FITC標(biāo)記Ⅱ抗購自Santa Cruz。

2方法

2.1細(xì)胞培養(yǎng) 人食管鱗癌細(xì)胞株KYSE-150購自JCRB(Japanese Collection of Research Bioresources),放射抗拒性細(xì)胞株KYSE-150R為本室自建。細(xì)胞株貼壁培養(yǎng)在含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中,置37℃、5%CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng),0.25%胰酶(內(nèi)含0.02%EDTA)消化傳代。

2.2Real-time RT-PCR 我們選擇了Wnt通路上的多個基因表達(dá)進(jìn)行real-time RT-PCR，設(shè)計引物見表1,內(nèi)參照為GAPDH。首先用Trizol分別從KYSE-150和KYSE-150R細(xì)胞中提取總RNA，然后用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(First Strand cDNA Synthesis Kit, Fermentas)合成cDNA，采用ABI7500熒光定量PCR儀，SYBR Green熒光染料摻入法相對定量，以內(nèi)參照為對照，計算差異表達(dá)的倍數(shù)。實驗重復(fù)3次。

表1 引物序列

2.3Western blotting 將指數(shù)生長期的KYSE-150和KYSE-150R細(xì)胞用一次性刮刀輕輕刮下，按200 μL∶106細(xì)胞的比例加入蛋白抽提試劑(M-PER mammalian protein extraction reagent, Thermo scientific)提取蛋白，采用碧云天公司的BCA蛋白定量試劑盒做蛋白定量，每孔上樣50 μg進(jìn)行SDS-PAGE電泳，電泳后轉(zhuǎn)膜1 h，轉(zhuǎn)膜后5%牛奶封閉2 h，Ⅰ抗孵育4 ℃過夜，0.1%TBST洗3次，每次10 min，Ⅱ抗孵育1 h，再0.1%TBST洗3次，每次10 min，ECL曝光，膠片用Gel-Pro 3.1軟件分析。實驗重復(fù)3次。

2.4免疫熒光 將KYSE-150和KYSE-150R細(xì)胞做細(xì)胞爬片，甲醇固定15min，3%BSA封閉30 min，Ⅰ抗(1∶50)4℃孵育過夜，PBS洗3次，每次10 min，Ⅱ抗(1∶100)避光孵育1 h，PBS洗3次，每次10 min，DAPI復(fù)染10 min，封片，熒光顯微鏡鏡檢。

2.5動物成瘤實驗 為了驗證KYSE-150和KYSE-150R細(xì)胞在動物體內(nèi)的成瘤能力，我們將KYSE-150和KYSE-150R細(xì)胞數(shù)調(diào)整到1×105于NOD/SCID小鼠腋下進(jìn)行皮下注射，4周后，解剖小鼠取出腫塊，測量其長寬，并根據(jù)公式體積(V)=長×寬2×0.5計算腫瘤大小。

3統(tǒng)計學(xué)處理

結(jié) 果

1Real-timeRT-PCR結(jié)果

KYSE-150R細(xì)胞中的Wnt1表達(dá)上調(diào)，是KYSE-150細(xì)胞的(3.48±0.17)倍，β-catenin上調(diào)(1.37±0.15)倍，Wnt4下調(diào)(0.56±0.11)倍，WISP1上調(diào)(1.95±0.14)倍，GSK3β上調(diào)(1.19±0.23)倍，cyclin D1上調(diào)(1.60±0.15)倍，見圖1。

2Westernblotting結(jié)果

KYSE-150R細(xì)胞中p-β-catenin表達(dá)減少，p-GSK3β、β-catenin、WISP1與cyclin D1表達(dá)增多，見圖2。我們推測Wnt通路激活使得p-β-catenin減少，非磷酸化β-catenin出現(xiàn)蓄積，引起下游產(chǎn)物cyclin D1和WISP1的表達(dá)增多。

3免疫熒光結(jié)果

免疫熒光的結(jié)果也證明了KYSE-150R細(xì)胞中β-catenin表達(dá)量明顯增多，并向核內(nèi)聚集，見圖3。

4動物成瘤實驗

4周后KYSE-150R細(xì)胞長成明顯的團(tuán)塊而KYSE-150細(xì)胞只在部分小鼠中長出小結(jié)節(jié)，見圖4，其瘤體體積分別為(1 325.11±259.22)mm3和(132.67±10.52)mm3(P<0.01)，表明放射抗拒性食管癌細(xì)胞KYSE-150R表現(xiàn)出更強的增殖和成瘤能力。

圖1Wnt通路中的信號分子mRNA表達(dá)情況

圖2Wnt通路中的信號分子蛋白的表達(dá)

Figure 3. β-catenin expression in KYSE-150 and KYSE-150R cells (×1 000).

圖3KYSE-150和KYSE-150R細(xì)胞中β-catenin的表達(dá)

Figure 4. The tumorigenicity of KYSE-150 and KYSE-150R cells.

圖4KYSE-150和KYSE-150R細(xì)胞在小鼠體內(nèi)的成瘤結(jié)果

討 論

食管癌即使病理分型相同，其放射敏感性也并不相同[5]，食管癌細(xì)胞的放射抗拒性阻止了治療效率的提高。大部分的腫瘤科醫(yī)生將放射抗拒性歸因于腫瘤干細(xì)胞[6]。目前腫瘤干細(xì)胞的來源并不清楚，但資料顯示可能來源于干細(xì)胞，祖細(xì)胞或其它腫瘤細(xì)胞[7]，靶向腫瘤干細(xì)胞和大部份腫瘤細(xì)胞的治療可能抑制腫瘤的再生。

Wnt通路是一條十分保守的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，從低等生物果蠅直至高等哺乳動物，其成員都具有高度的同源性。國外學(xué)者認(rèn)為Wnt信號通路與調(diào)控基因表達(dá)、細(xì)胞行為、細(xì)胞黏附和細(xì)胞極性有關(guān)[8]，在腫瘤干細(xì)胞的維持中也起著重要的作用[9]。目前認(rèn)為Wnt通路的組成主要包括：細(xì)胞外因子(Wnt)、跨膜受體(Frizzled)、胞質(zhì)蛋白(β-catenin)及核內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子(transcription factor,TCF)等一系列蛋白，其調(diào)控下游的一系列靶基因包括：c-Myc、cyclin D1、WISP1、基質(zhì)金屬肽酶7(matrix metallopeptidase 7,MMP-7)、轉(zhuǎn)錄因子1(transcription factor 1，TCF-1)、CD44等。在經(jīng)典的Wnt通路中β-catenin處于中心地位。在正常情況下，Wnt基本處于失活狀態(tài)，酪蛋白激酶1α和GSK3β依次磷酸化β-catenin，p-β-catenin被蛋白酶體降解，使胞質(zhì)中的β-catenin始終維持較低的濃度。當(dāng)Wnt通路激活時，β-catenin的磷酸化被抑制，β-catenin得以不斷積蓄，并進(jìn)入細(xì)胞核與TCF結(jié)合，啟動下游基因轉(zhuǎn)錄。Mcmanus等也發(fā)現(xiàn)GSK3β S9可以被絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶(serine/threonine protein kinase, Akt)或其它蛋白激酶磷酸化,其來源多為其它生長因子信號通路(如IGF)。GSK3β S9磷酸化可以使GSK3β失活，從而不能持續(xù)磷酸化β-catenin, 使β-catenin可以積聚并得以繼續(xù)激活下游信號[10]。

我們在前期研究中利用Agilent 4×44k全基因芯片對食管癌放射抗拒性細(xì)胞株及其親本細(xì)胞進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)Wnt通路上有多達(dá)19個基因出現(xiàn)表達(dá)差異[4]。我們用real-time RT-PCR對其進(jìn)行了驗證，發(fā)現(xiàn)Wnt1、β-catenin、WISP1、GSK3β和cyclin D1表達(dá)上調(diào)，Wnt4表達(dá)下調(diào)，說明Wnt通路的激活可能是Wnt1表達(dá)上調(diào)引起，繼而引起下游一系列基因的改變。我們又對Wnt通路上蛋白的表達(dá)進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)Wnt通路的激活使得GSK3β S9位點磷酸化，繼而引起磷酸化的β-catenin減少，非磷酸化β-catenin出現(xiàn)蓄積，導(dǎo)致下游產(chǎn)物cyclin D1和WISP1的表達(dá)增多。免疫熒光的結(jié)果也證明了KYSE-150R細(xì)胞中β-catenin明顯增多，并向核內(nèi)聚集。

Cyclin D1是細(xì)胞周期的正調(diào)節(jié)因子，cyclin D1蛋白過表達(dá)可以加速細(xì)胞G1期向S期轉(zhuǎn)化，促使細(xì)胞增殖，使細(xì)胞處于不斷增殖的類似前體細(xì)胞的狀態(tài)。WISP1具有促進(jìn)細(xì)胞增殖、介導(dǎo)細(xì)胞黏附、刺激細(xì)胞轉(zhuǎn)移、促進(jìn)有絲分裂及細(xì)胞外基質(zhì)的形成等生物學(xué)功能。WISP1的表達(dá)水平與多種組織惡性腫瘤的發(fā)生、進(jìn)展、侵襲、轉(zhuǎn)移及其預(yù)后有著密切的聯(lián)系。在放射抗拒性細(xì)胞KYSE-150R細(xì)胞中，β-catenin蛋白增多，引起其調(diào)控的下游蛋白cyclin D1和WISP1表達(dá)增多，使得KYSE-150R細(xì)胞表現(xiàn)出更強的增殖能力，我們的動物實驗也證實了這一點。我們因此推測cyclin D1和WISP1引起的細(xì)胞加速增殖可能是KYSE-150R細(xì)胞獲得放射抗拒性的重要原因。

綜上所述，我們認(rèn)為Wnt通路在食管癌放射抗拒性的獲得中有重要作用，Wnt通路激活導(dǎo)致β-catenin蛋白的蓄積，引起下游cyclin D1和WISP1的表達(dá)升高，細(xì)胞增殖加速，可能是KYSE-150R細(xì)胞表現(xiàn)出放射抗拒性的重要原因。下一步，我們將研究抑制Wnt通路對食管癌細(xì)胞放射抗拒性的影響。

[1] Cooper JS, Guo MD, Herskovic A, et al. Chemoradiotherapy of locally advanced esophageal cancer: long-term follow-up of a prospective randomized trial (RTOG 85-01). Radiation Therapy Oncology Group[J]. JAMA, 1999, 281(17): 1623-1627.

[2] Minsky BD, Pajak TF, Ginsberg RJ, et al. INT 0123 (Radiation Therapy Oncology Group 94-05) phase III trial of combined-modality therapy for esophageal cancer: high-dose versus standard-dose radiation therapy[J]. J Clin Oncol, 2002, 20(5): 1167-1174.

[3] 張 力, 李海英, 吳式琇. X線反復(fù)照射人食管鱗癌細(xì)胞系KYSE-150的生物效應(yīng)研究[J]. 中華放射腫瘤學(xué)雜志，2010，19(1): 60-63.

[4] 蘇華芳，萬秋燕，鄒 燕，等．具干細(xì)胞特性食管癌耐放射細(xì)胞株基因表達(dá)分析[J]．腫瘤學(xué)雜志，2010，16(1)：40-45．

[5] Zhao KL, Shi XH, Jiang GL, et al. Late course accelerated hyperfractionated radiotherapy plus concurrent chemotherapy for squamous cell carcinoma of the esophagus: a phase III randomized study[J]. Int J Radiat Oncol Biol Phys, 2005, 62(4): 1014-1020.

[6] Clarke MF, Dick JE, Dirks PB, et al. Cancer stem cells-perspectives on current status and future directions: AACR Workshop on cancer stem cells[J]. Cancer Res, 2006, 66(19): 9339-9344.

[7] Takebe N, Harris PJ, Warren RQ, et al. Targeting cancer stem cells by inhibiting Wnt, Notch, and Hedgehog pathways[J]. Nat Rev Clin Oncol, 2011, 8(2): 97-106.

[8] Moon RT, Bowerman B, Boutros M, et al. The promise and perils of Wnt signaling through β-catenin[J]. Science, 2002, 296(5573): 1644-1646.

[9] Reya T, Clevers H. Wnt signalling in stem cells and cancer[J]. Nature, 2005, 434(7035): 843-850.

[10] McManus EJ, Sakamoto K, Armit LJ, et al. Role that phosphorylation of GSK3 plays in insulin and Wnt signalling defined by knockin analysis[J]. EMBO J, 2005, 24(8): 1571-1583.

RoleofWntsignalingpathwayindevelopmentofradioresistanceinesophagealcancer

LI Hai-ying, ZHANG Li, PAN Huan-le, FANG Ya, WU Jian-bo

(TheFirstAffiliatedHospitalofWenzhouMedicalCollege,Wenzhou325000,China.E-mail: 21182907@qq.com)

AIM: To investigate the role of Wnt signaling pathway in the development of radioresistance in esophageal cancer cells.METHODSThe mRNA expression of the genes involved in Wnt signaling pathway was determined by real-time RT-PCR. The protein levels involved in Wnt signaling pathway were also confirmed by Western blotting and immunofluorescence method. Xenograft assay was performed to compare the proliferation ability and tumorigenicity of the cell lines.RESULTSUp-regulation of Wnt1 induced the activation of Wnt signaling pathway and the variation of the downstream genes. β-catenin was accumulated and nuclear-transferred. The expression of downstream targeted genes such as cyclin D1 and WISP1 was increased. The radioresistant esophageal cancer cells showed higher proliferation ability and tumorigenicity in nude mouse xenograft.CONCLUSIONWnt signaling-induced acceleration of proliferation is important for the development of radioresistance in esophageal cancer cells.

Wnt signaling pathway; Esophageal neoplasms; Radioresistance

R735.1

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2012.09.015