徐 競(jìng)， 藍(lán) 丹， 楊光明， 李 濤， 劉良明

(第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院野戰(zhàn)外科研究所二室，創(chuàng)傷、燒傷與復(fù)合傷國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶 400042)

1000-4718(2012)09-1554-05

2011-10-25

2012-07-16

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No.30801189);重慶市自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No. 2008BB5103)

△通訊作者 Tel: 023-68757421;E-mail：Liuliangming2002@yahoo.com

Akt-eNOS-NO信號(hào)途徑介導(dǎo)了Ang-1和Ang-2對(duì)大鼠失血性休克早期血管高反應(yīng)性的調(diào)節(jié)作用*

徐 競(jìng)， 藍(lán) 丹， 楊光明， 李 濤， 劉良明△

(第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院野戰(zhàn)外科研究所二室，創(chuàng)傷、燒傷與復(fù)合傷國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶 400042)

目的觀察內(nèi)皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase, eNOS)在血管生成素1(angiopoietin-1, Ang-1)和血管生成素2(angiopoietin-2, Ang-2)調(diào)節(jié)失血性休克大鼠血管反應(yīng)性雙相變化中的作用及其機(jī)制。方法采用Western blotting技術(shù)觀察失血性休克后不同時(shí)點(diǎn)腸系膜上動(dòng)脈(superior mesenteric artery，SMA)中eNOS蛋白表達(dá)變化，采用離體微血管環(huán)張力測(cè)定技術(shù)觀察eNOS抑制劑對(duì)Ang-1和Ang-2調(diào)節(jié)缺氧早期和晚期血管反應(yīng)性作用的影響，并觀察給予Ang-1、Ang-2以及Tie-2、Akt、p38 MAPK、ERK抑制劑后缺氧血管內(nèi)皮細(xì)胞(vascular endothelial cells, VECs)和血管平滑肌細(xì)胞(vascular smooth muscle cells, VSMCs)混合培養(yǎng)物中eNOS蛋白表達(dá)和培養(yǎng)上清一氧化氮(nitric oxide, NO)含量的影響。結(jié)果(1) eNOS在正常SMA中表達(dá)很低，失血性休克后逐漸增高，休克10 min、30 min、1 h、2 h和4 h時(shí)分別增高至正常對(duì)照的1.95、2.10、3.01、3.42和3.57倍(P<0.01)。(2)eNOS抑制劑可顯著抑制缺氧10 min的血管高反應(yīng)性，去甲腎上腺素(NE)的Emax由13.479 mN降低至9.043 mN (P<0.01)，也可以顯著抑制Ang-1對(duì)缺氧10 min血管高反應(yīng)性的維持作用，NE的Emax由15.283 mN降低至11.219 mN (P<0.01)，但不改變Ang-2降低缺氧10 min血管高反應(yīng)性作用，也不改變?nèi)毖? h的血管低反應(yīng)性和Ang-1、 Ang-2對(duì)缺氧4 h血管反應(yīng)性的調(diào)節(jié)作用。(3)缺氧10 min的eNOS表達(dá)較正常對(duì)照增高，Ang-2和Tie-2、Akt抑制劑可抑制其增高(P<0.01)，p38 MAPK、ERK抑制劑對(duì)其無顯著影響。(4)NO含量在缺氧10 min顯著增高，Ang-2和Tie-2、Akt、eNOS抑制劑可抑制其增高 (P<0.01)，p38 MAPK、ERK抑制劑對(duì)其無顯著影響。結(jié)論失血性休克早期，Ang-1和Ang-2通過Akt-eNOS-NO途徑來調(diào)節(jié)血管高反應(yīng)性。

失血性休克； 血管反應(yīng)性； 雙相變化； 血管生成素1； 血管生成素2； 內(nèi)皮型一氧化氮合酶

血管生成素1(angiopoietin-1, Ang-1)和血管生成素2(angiopoietin-2, Ang-2)屬于血管內(nèi)皮細(xì)胞(vascular endothelia cells, VECs)特異的促血管新生因子家族——血管生成素家族，本實(shí)驗(yàn)室前期研究發(fā)現(xiàn)，Ang-1和Ang-2在失血性休克后的腸系膜上動(dòng)脈(superior mesenteric artery，SMA)中呈時(shí)間上的差異表達(dá)，并通過Tie-2受體參與了失血性休克血管反應(yīng)性雙相變化的形成[1]，蛋白激酶B(protein kinase B, PKB/Akt)、p38絲裂原活化蛋白激酶(p38 mitogen-activated protein kinase, p38 MAPK)、細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(extracellular signal-regulated kinase, ERK)幾種分子參與了其調(diào)節(jié)過程，但具體的調(diào)節(jié)機(jī)制如何，目前尚不清楚。 根據(jù)基礎(chǔ)研究，Ang-1和Ang-2激活VECs上的Tie-2受體之后，可經(jīng)磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase, PI3K)激活A(yù)kt，還可經(jīng)過銜接蛋白Grb2活化p38 MAPK和ERK，再通過調(diào)節(jié)內(nèi)皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase, eNOS)產(chǎn)生一氧化氮(nitric oxide, NO)[2-3]，而NO具有調(diào)節(jié)血管舒縮反應(yīng)性的作用[4]。那么Ang-1和Ang-2是否通過Akt、p38 MAPK和ERK，調(diào)節(jié)eNOS產(chǎn)生NO，來調(diào)節(jié)失血性休克血管反應(yīng)性的雙相變化？ 本實(shí)驗(yàn)采用Western blotting技術(shù)和離體微血管環(huán)張力測(cè)定技術(shù)，以大鼠SMA以及混合培養(yǎng)的VECs和血管平滑肌細(xì)胞(vascular smooth muscle cells, VSMCs)為研究對(duì)象，觀察失血性休克后不同時(shí)點(diǎn)SMA中eNOS蛋白表達(dá)變化，eNOS抑制劑對(duì)Ang-1和Ang-2調(diào)節(jié)缺氧早期和晚期血管反應(yīng)性作用的影響，給予Ang-1、Ang-2以及Tie-2、Akt、p38 MAPK和ERK抑制劑后缺氧培養(yǎng)的VECs和VSMCs中eNOS蛋白表達(dá)和培養(yǎng)上清NO含量的變化，以探討eNOS在Ang-1和Ang-2調(diào)節(jié)休克血管反應(yīng)性雙相變化中的作用及其信號(hào)途徑。

材 料 和 方 法

1動(dòng)物和細(xì)胞準(zhǔn)備

采用第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心清潔級(jí)SD大鼠，雌雄各半，體重200～230 g，戊巴比妥鈉(30 mg/kg大鼠體重)腹腔注射麻醉。

根據(jù)文獻(xiàn)分別進(jìn)行VECs 和VSMCs原代細(xì)胞培養(yǎng)[5]，取第3代至第5代的VECs 和VSMCs細(xì)胞，按照細(xì)胞計(jì)數(shù)1∶1比例進(jìn)行混合培養(yǎng)，次日進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

2動(dòng)物分組和方法

2.1失血性休克后eNOS的蛋白表達(dá)變化 將48只大鼠麻醉后右側(cè)股動(dòng)脈插管接血壓計(jì)[6]，隨機(jī)分組為：正常對(duì)照組、休克10 min、30 min、1 h、2 h、4 h組，每組8只，制作40 mmHg失血性休克模型，并按各組要求維持不同休克時(shí)間。休克完成后，活殺大鼠取SMA組織，常規(guī)Western blotting技術(shù)測(cè)定eNOS的蛋白表達(dá)。Quantity One軟件分析蛋白條帶，以eNOS/β-actin吸光度值之比反映eNOS蛋白表達(dá)。

2.2eNOS抑制劑對(duì)Ang-1和Ang-2調(diào)節(jié)缺氧早期和晚期血管反應(yīng)性的影響 取大鼠104只，麻醉后活殺取SMA一級(jí)分支血管環(huán)，隨機(jī)分為：正常對(duì)照組、缺氧10 min組、Ang-1+缺氧10 min組、Ang-2+缺氧10 min組、eNOS抑制劑+缺氧10 min組、eNOS抑制劑+Ang-1+缺氧10 min組、eNOS抑制劑+Ang-2+缺氧10 min組、缺氧4 h組、Ang-1+缺氧4 h組、Ang-2+缺氧4 h組和eNOS抑制劑+缺氧4 h組、eNOS抑制劑+Ang-1+缺氧4 h組、eNOS抑制劑+Ang-2+缺氧4 h組，每組8只血管環(huán)。將血管環(huán)浸入無糖Krebs-Henseleit(K-H)液中，進(jìn)行藥物處理，采用Ang-1和Ang-2的濃度均為200 μg/L，eNOS抑制劑L-N5-亞氨基乙基鳥氨酸二鹽酸鹽(L-N5-iminoethyl ornithine dihydrochloride,L-NIO)濃度為1×10-4mol/L。然后將血管環(huán)置于缺氧罐中，依次充入缺氧氣體(5%CO2和95%N2)15 min和夾閉10 min，循環(huán)5次，最后1次充氣完成后，按各實(shí)驗(yàn)組要求分別夾閉10 min或4 h完成缺氧[6]。再取出缺氧處理完成的血管環(huán)，將其固定在微血管肌動(dòng)描記儀上，浸入K-H液中，采用累積濃度法檢測(cè)微血管環(huán)對(duì)梯度濃度去甲腎上腺素(norepinephrine,NE)的反應(yīng)性，作量-效曲線，曲線擬合法求NE的最大收縮力 (Emax)，以NE的Emax評(píng)價(jià)血管反應(yīng)性[7]。

2.3Ang-1和Ang-2調(diào)節(jié)缺氧早期血管高反應(yīng)性時(shí)eNOS的蛋白表達(dá)變化和NO的含量變化 取混合培養(yǎng)的VECs 和VSMCs細(xì)胞32瓶，隨機(jī)分為：正常對(duì)照組、缺氧10 min組、Ang-2+缺氧10 min組、Tie-2抑制劑+缺氧10 min組、Akt抑制劑+缺氧10 min組、p38MAPK抑制劑+缺氧10 min組、ERK抑制劑+缺氧10 min組和eNOS抑制劑+缺氧10 min組，每組4瓶。先將細(xì)胞培養(yǎng)基換做無血清培養(yǎng)基，進(jìn)行藥物處理，Ang-1和Ang-2的濃度均為200 μg/L,Tie-2抑制劑為1∶100封閉抗體，Akt抑制劑 1×10-5mol/L,p38 MAPK抑制劑SB203580 1×10-5mol/L,ERK抑制劑PD98059 1×10-5mol/L，eNOS抑制劑L-NIO 1×10-4mol/L。再進(jìn)行不同時(shí)間缺氧處理(方法同前面SMA的缺氧處理)。完畢后取細(xì)胞培養(yǎng)上清，采用一氧化氮檢測(cè)試劑盒測(cè)定NO含量，收集細(xì)胞用于測(cè)定eNOS的蛋白表達(dá)。

3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié) 果

1失血性休克后eNOS的蛋白表達(dá)變化

eNOS在正常時(shí)表達(dá)很低(與β-actin的比值為0.0720)，失血性休克后表達(dá)逐漸增高。休克1 min、30 min、1 h、2 h和4 h時(shí)分別增高至0.1407、0.1509、0.2173、0.2462和0.2571 (P<0.01)，見圖1。

2eNOS抑制劑對(duì)Ang-1和Ang-2調(diào)節(jié)缺氧早期和晚期血管反應(yīng)性的影響

eNOS抑制劑可顯著抑制缺氧10 min的血管高反應(yīng)性，表現(xiàn)為量效曲線右移，NE的Emax由13.479 mN降低至9.043 mN (P<0.01)，也可以顯著抑制Ang-1對(duì)缺氧10 min血管高反應(yīng)性的維持作用，表現(xiàn)為量效曲線右移，NE的Emax由15.283 mN降低至11.219 mN (P<0.01)，但不改變Ang-2降低缺氧10 min血管高反應(yīng)性作用，也不改變?nèi)毖? h的血管低反應(yīng)性和Ang-1、Ang-2對(duì)缺氧4 h血管反應(yīng)性的調(diào)節(jié)作用，見圖2。

圖1失血性休克后eNOS蛋白表達(dá)

3Ang-1和Ang-2調(diào)節(jié)缺氧早期血管反應(yīng)性時(shí)eNOS的蛋白表達(dá)變化和NO含量變化

缺氧10 min的eNOS表達(dá)較正常對(duì)照顯著增高(P<0.01)，Ang-2、Tie-2抑制劑和Akt抑制劑可抑制其增高，使其由缺氧10 min的0.1354分別降低至0.0848、0.0724和0.0993 (P<0.01)，p38 MAPK和ERK抑制劑對(duì)缺氧10 min的eNOS表達(dá)無顯著影響，見圖3。

NO含量在缺氧10 min即顯著增高，Ang-2以及Tie-2、Akt和eNOS抑制劑可抑制其增高，使其分別降低41.88%、68.91%、70.69%和67.42% (P<0.01)，p38 MAPK和ERK抑制劑對(duì)其無顯著影響，見圖4。

討 論

失血性休克后血管反應(yīng)性呈早期增高和晚期降低的雙相變化[8]，其發(fā)生機(jī)制尚不清楚。本實(shí)驗(yàn)室前期研究發(fā)現(xiàn)，血管生成素家族中的Ang-1和Ang-2在失血性休克后的SMA中呈時(shí)間上的差異表達(dá)(即Ang-1蛋白表達(dá)在休克早期增高，晚期降低；Ang-2蛋白表達(dá)在休克早期變化不大，在晚期逐漸增高)，并通過Tie-2受體參與了失血性休克血管反應(yīng)性雙相變化的形成[1]，Akt、p38 MAPK和ERK幾種分子參與了其調(diào)節(jié)過程，但具體調(diào)節(jié)機(jī)制如何，尚無文獻(xiàn)報(bào)道。

圖2eNOS抑制劑對(duì)Ang-1和Ang-2調(diào)節(jié)缺氧早期和晚期血管反應(yīng)性的影響

圖3Ang-1和Ang-2調(diào)節(jié)缺氧早期血管反應(yīng)性時(shí)eNOS蛋白的表達(dá)

根據(jù)基礎(chǔ)研究，Ang-1和Ang-2激活VECs上的Tie-2受體之后，可經(jīng)PI3K激活A(yù)kt，還可經(jīng)過銜接蛋白Grb2活化p38 MAPK和ERK，再通過調(diào)節(jié)eNOS產(chǎn)生NO[2-3]。NO是目前已知的一種對(duì)血管舒縮反應(yīng)性有重要調(diào)節(jié)作用的分子，少量NO可增高血管收縮反應(yīng)性；過量NO可過度開放KATP和BKCa，導(dǎo)致VSMCs膜超極化，還可降低肌球蛋白輕鏈磷酸化，導(dǎo)致VSMCs鈣失敏，從而降低血管舒縮反應(yīng)性[4]。且有研究發(fā)現(xiàn)，在LPS誘導(dǎo)內(nèi)毒素休克的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞，LPS通過磷酸化和活化Akt、p38 MAPK和ERK，激活eNOS，產(chǎn)生NO，調(diào)節(jié)內(nèi)毒素休克的血管反應(yīng)性[9-10]。那么，Ang-1和Ang-2是否通過Akt、p38 MAPK和ERK，調(diào)節(jié)eNOS產(chǎn)生NO，來調(diào)節(jié)失血性休克血管反應(yīng)性的雙相變化？

本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，eNOS抑制劑可顯著抑制缺氧10 min的血管高反應(yīng)性，也可以顯著抑制Ang-1對(duì)缺氧10 min血管高反應(yīng)性的維持作用，但不改變?nèi)毖? h的血管低反應(yīng)性和Ang-1、Ang-2對(duì)缺氧4 h血管反應(yīng)性的調(diào)節(jié)作用，提示eNOS主要參與了Ang-1和Ang-2對(duì)失血性休克早期血管高反應(yīng)性的調(diào)節(jié)。失血性休克后SMA中的eNOS蛋白表達(dá)逐漸增高；在缺氧培養(yǎng)的VECs和VSMCs混合細(xì)胞中，Ang-2以及Tie-2和Akt抑制劑可顯著降低缺氧10 min的eNOS蛋白表達(dá)增高和NO含量增高，p38 MAPK和ERK抑制劑對(duì)其沒有顯著影響，提示失血性休克早期，Ang-1和Ang-2通過Akt調(diào)節(jié)eNOS的蛋白表達(dá)和NO產(chǎn)生，來調(diào)節(jié)血管高反應(yīng)性。

圖4Ang-1和Ang-2調(diào)節(jié)缺氧早期血管反應(yīng)性時(shí)NO含量的變化

然而，本實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)，盡管eNOS蛋白表達(dá)在休克晚期也是增高的，卻對(duì)于Ang-1和Ang-2調(diào)節(jié)休克晚期的血管低反應(yīng)性作用沒有顯著影響，提示Akt-eNOS-NO信號(hào)途徑并不介導(dǎo)Ang-1和Ang-2對(duì)休克晚期血管低反應(yīng)性的調(diào)節(jié)，那么Ang-1和Ang-2對(duì)休克晚期血管低反應(yīng)性的調(diào)節(jié)又是通過什么分子和信號(hào)通路實(shí)現(xiàn)的，還需要進(jìn)一步研究。

[1] 徐 競(jìng)，李 濤，楊光明，等. Ang-1、Ang-2差異表達(dá)在大鼠失血性休克血管反應(yīng)性雙相變化中的作用[J]. 中國(guó)病理生理雜志, 2010，26(9): 1684-1688.

[2] Brindle NP,Saharinen P,Alitalo K. Signaling and functions of angiopoietin-1 in vascular protection[J]. Circ Res, 2006，98 (8): 1014-1023.

[3] Chen JX, Lawrence ML, Cunningham G, et al. HSP90 and Akt modulate Ang-1 induced angiogenesis via NO in coronary artery endothelium[J]. J Appl Physiol, 2004，96(2): 612-620.

[4] Tokuno S, Chen F, Pernow J, et al. Effects of spontaneous or induced brain ischemia on vessel reactivity: the role of inducible nitric oxide synthase[J]. Life Sci, 2002，71(6): 679-692.

[5] Yang G, Xu J, Li T, et al. Role of V1areceptor in AVP -induced restoration of vascular hyporeactivity and its relationship to MLCP-MLC20phosphorylation pathway[J]. J Surg Res，2010,161(2):312-320.

[6] Li T, Liu L, Liu J, et al. Mechanism of Rho kinase regulation of vascular reactivity following hemorrhagic shock in rats[J]. Shock,2008,29 (1):65-70.

[7] Xu J, Yang G, Li T, et al. Involvement of CPI-17 and zipper-interacting protein kinase in the regulation of protein kinase C-α,protein kinase C-ε on vascular calcium sensitivity after hemorrhagic shock[J]. Shock, 2010, 33(1): 49-55.

[8] Liu LM, Dubick MA. Hemorrhagic shock-induced vascular hyporeactivity in the rat: relationship to gene expression of nitric oxide syntheas, endothelin-1, and select cytokines in corresponding organs[J]. J Surg Res,2005,125(2): 128-136.

[9] Connelly L, Madhani M, Hobbs AJ. Resistance to endotoxic shock in endothelial nitric oxide synthase (eNOS) knock-out mice: a proinflammatory role for eNOS-derived noinvivo[J]. J Biol Chem,2005,280(11): 10040-10046.

[10]Koide N, Mu MM, Hassan F, et al. Lipopolysaccharide enhances interferon-γ-induced nitric oxide (NO) production in murine vascular endothelial cells via augmentation of interferon regulatory factor-1 activation[J]. J Endotoxin Res, 2007,13(3): 167-175.

Akt-eNOS-NOsignalpathwaymediatesregulatoryeffectofAng-1andAng-2onvascularhyperreactivityinearlyhemorrhagicshockrats

XU Jing, LAN Dan, YANG Guang-ming, LI Tao, LIU Liang-ming

(StateKeyLaboratoryofTrauma,BurnandCombinedInjury,theSecondDepartmentofResearchInstituteofSurgery,DapingHospital,theThirdMilitaryMedicalUniversity,Chongqing400042,China.E-mail:Liuliangming2002@yahoo.com)

AIM: To observe the role of endothelial nitric oxide synthase (eNOS) in the regulatory effect of angiopoietin-1 (Ang-1) and angiopoietin-2 (Ang-2) on the biphasic change of vascular reactivity after hemorrhagic shock in rats.METHODSThe protein expression of eNOS was measured in the superior mesenteric artery (SMA) after hemorrhagic shock by Western blotting. The effect of eNOS inhibitor on the vascular reactivity of SMA treated with Ang-1 and Ang-2 in the early (hyperreactivity) and late (hyporeactivity) periods of hypoxia were observed via an isolated organ perfusion system. The protein levels of eNOS in the hypoxic mixture of vascular endothelial cells (VECs) and vascular smooth muscle cells (VSMCs), and the concentration of nitric oxide (NO) in the medium supernatant of the mixture cells treated with Ang-1, Ang-2 and the inhibitors of Tie-2, Akt, p38 MAPK and ERK were measured.RESULTSThe protein expression of eNOS in SMA was low in normal control group, and increased significantly after hemorrhagic shock, which was 1.84, 3.55, 4.75, 5.96 and 6.33 folds of the normal control level in shock 10 min, 30 min, 1 h, 2 h and 4 h groups, respectively (P<0.01). Inhibitor of eNOS decreased the vascular hyperreactivity in hypoxia 10 min group, in which the Emaxof norepinephrine (NE) was decreased from 13.479 mN to 9.043 mN (P<0.05). It also repressed the maintenance effect of Ang-1 on vascular reactivity in hypoxia 10 min group, in wihich the Emaxof NE was decreased from 15.283 mN to 11.219 mN (P<0.01). The effect of Ang-2 on the vascular hyperreactivity in hypoxia 10 min group, the vascular hyporeactivity in hypoxia 4 h group, or the effect of Ang-1 or Ang-2 on the vascular reactivity in hypoxia 4 h group did not change. The protein expression of eNOS was increased 10 min after hypoxia as compared with the normal control, which was decreased by Ang-2 and the inhibitors of Tie-2 and Akt (P<0.01), but was not decreased by p38 MAPK and ERK inhibitors. The concentration of NO in the medium supernatant was increased 10 min after hypoxia, and was significantly decreased by Ang-2 and the inhibitors of Tie-2, Akt and eNOS, while the inhibitors of p38 MAPK and ERK had no influence on it.CONCLUSIONAng-1 and Ang-2 regulate the vascular hyperreactivity in the early hemorrhagic shock rats through Akt-eNOS-NO pathway.

Hemorrhagic shock; Vascular reactivity; Biphasic change; Angiopoietin-1; Angiopoietin-2; Endothelial nitric oxide synthase

R605.971

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2012.09.004