王國(guó)紅， 郭直岳， 尹雅玲， 魏林郁， 李新娟， 李東亮,2△

(1新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院生理學(xué)與神經(jīng)生物學(xué)教研室，河南 新鄉(xiāng) 453003； 2復(fù)旦大學(xué)醫(yī)學(xué)神經(jīng)生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200032)

1000-4718(2012)09-1597-08

2012-03-12

2012-07-11

河南省2009年科技發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目( No.092102310098);復(fù)旦大學(xué)神經(jīng)生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開(kāi)放課題(No.10-10)；新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院重點(diǎn)領(lǐng)域開(kāi)放課題(No.ZD2011-2)

△通訊作者 Tel: 0373-3029104; E-mail: xyldl8@126.com

三磷酸腺苷對(duì)N9小膠質(zhì)細(xì)胞的損傷作用及其機(jī)制*

王國(guó)紅1， 郭直岳1， 尹雅玲1， 魏林郁1， 李新娟1， 李東亮1,2△

(1新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院生理學(xué)與神經(jīng)生物學(xué)教研室，河南 新鄉(xiāng) 453003；2復(fù)旦大學(xué)醫(yī)學(xué)神經(jīng)生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200032)

目的研究三磷酸腺苷(ATP)對(duì)N9小膠質(zhì)細(xì)胞的損傷作用及其機(jī)制。方法取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期N9小膠質(zhì)細(xì)胞，隨機(jī)分為3組：(1)正常對(duì)照組：常規(guī)培養(yǎng)，不進(jìn)行ATP處理； (2)ATP組：接種24 h后行ATP處理； (3)KN-62 (P2X7受體阻斷劑)干預(yù)組： KN-62孵育30 min后行ATP處理，且KN-62存在于ATP作用整個(gè)過(guò)程。XTT法測(cè)各組N9小膠質(zhì)細(xì)胞的活力；倒置相差顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)變化；流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期及凋亡；細(xì)胞免疫熒光檢測(cè)P2X7受體表達(dá)；Western blotting檢測(cè)細(xì)胞P2X7受體蛋白水平；ELISA檢測(cè)細(xì)胞上清液中白細(xì)胞介素1β(IL-1β)含量。結(jié)果500 μmol/L ATP和1 mmol/L ATP對(duì)細(xì)胞活力損傷程度較小，作用24 h后，細(xì)胞活力仍可達(dá)88.5%±5.5%和88.2%±8.4%。當(dāng)ATP濃度達(dá)到或高于2 mmol/L時(shí)，細(xì)胞活力迅速降低，細(xì)胞發(fā)生皺縮，且隨ATP作用時(shí)間延長(zhǎng)，細(xì)胞活力逐漸降低，細(xì)胞密度逐漸減少，細(xì)胞皺縮程度加重，而KN-62干預(yù)后細(xì)胞活力較ATP組明顯增多，細(xì)胞密度及形態(tài)明顯好于ATP組。細(xì)胞周期及凋亡檢測(cè)結(jié)果顯示，ATP可使細(xì)胞周期阻滯于S期，細(xì)胞凋亡比例明顯較對(duì)照組增多(P<0.01)，KN-62干預(yù)可顯著減輕ATP引起的細(xì)胞周期阻滯，細(xì)胞凋亡比例顯著減少(P<0.01)。免疫熒光顯示，ATP及KN-62干預(yù)對(duì)N9小膠質(zhì)細(xì)胞上P2X7受體的表達(dá)分布沒(méi)有影響。Western blotting顯示，正常對(duì)照組、ATP組及KN-62干預(yù)組間P2X7受體蛋白水平?jīng)]有明顯差異(P>0.05)。ELISA結(jié)果顯示，ATP及KN-62干預(yù)對(duì)IL-1β的釋放沒(méi)有作用。結(jié)論高劑量ATP可誘發(fā)N9小膠質(zhì)細(xì)胞損傷，其機(jī)制可能與P2X7受體介導(dǎo)的細(xì)胞周期阻滯和細(xì)胞凋亡有關(guān)，而與小膠質(zhì)細(xì)胞的炎癥反應(yīng)無(wú)關(guān)。

三磷酸腺苷； 小膠質(zhì)細(xì)胞； 受體,嘌呤能P2X7； KN-62

三磷酸腺苷(adenosine triphosphate, ATP)是胞內(nèi)能量代謝的主要儲(chǔ)能和供能形式，由線粒體產(chǎn)生，正常情況下，釋放到胞外的ATP量很少，為高納摩爾級(jí)或低微摩爾級(jí)。當(dāng)腦受到損傷(如缺血缺氧損傷)時(shí)，大量ATP釋放到胞外，使胞外的ATP水平迅速升高，可達(dá)毫摩爾級(jí)，繼而引發(fā)系列反應(yīng)，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡壞死，引起繼發(fā)性腦損傷[1]。早在1998年，F(xiàn)rancesco就曾將ATP命名為死亡因子，然而近些年研究發(fā)現(xiàn)[2-4]，胞外ATP對(duì)有些細(xì)胞具有促增殖、抗凋亡的營(yíng)養(yǎng)作用，而對(duì)另一些細(xì)胞則具有促進(jìn)凋亡的損傷作用，甚至對(duì)同一種細(xì)胞在不同的作用時(shí)間分別表現(xiàn)出促增殖和促凋亡兩種截然相反的效應(yīng)，不僅如此，ATP發(fā)揮作用所涉及的機(jī)制和受體也各有不同。介導(dǎo)ATP作用的P2受體現(xiàn)已克隆出15個(gè)亞型，其中P2X7受體亞型近年來(lái)成為研究熱點(diǎn)，研究發(fā)現(xiàn)P2X7受體在神經(jīng)系統(tǒng)廣泛存在并發(fā)揮重要作用，與腦缺血、癲癇、阿爾茨海默病、神經(jīng)性疼痛等多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病密切相關(guān)，P2X7受體參與腦缺血后神經(jīng)細(xì)胞的死亡及小膠質(zhì)細(xì)胞的炎癥反應(yīng)[5-6]。小膠質(zhì)細(xì)胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)固有的免疫效應(yīng)細(xì)胞，目前被認(rèn)為在腦損傷尤其是缺血性腦損傷中發(fā)揮著重要作用[7]。本研究采用不同劑量ATP處理N9小膠質(zhì)細(xì)胞并結(jié)合P2X7受體阻斷劑KN-62的使用，觀察不同時(shí)間細(xì)胞活力、細(xì)胞形態(tài)、細(xì)胞周期和凋亡水平、P2X7受體表達(dá)和水平及胞外白細(xì)胞介素1β(interleukin-1β,IL-1β)含量的變化，以研究和探討胞外ATP水平對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞的作用及其所涉及的機(jī)制。

材 料 和 方 法

1材料

1.1主要試劑 四氮唑復(fù)合物{2,3-bis(2-methoxy-4-nitro-5-sulfophenyl)-5-[(phenylamino) carbonyl]-2H-tetrazolium hydroxide, XTT}、硫酸酚嗪甲酯(phenazinemethosulfate, PMS)、IMDM(Iscove’s modified Dulbecco’s medium)、碘化丙啶(propidium iodide, PI)、P2X7受體阻斷劑KN-62均購(gòu)自Sigma；RNase A (DNase free)、DAPI染色液、免疫熒光染色試劑盒——抗兔Alexa Fluor 488均購(gòu)自碧云天生物技術(shù)研究所；兔抗鼠P2X7受體多克隆抗體購(gòu)自Santa Cruz；小鼠IL-1β ELISA試劑盒購(gòu)自上海依科賽生物制品有限公司；胎牛血清購(gòu)自杭州四季青公司。

1.2細(xì)胞系 N9小膠質(zhì)細(xì)胞由上海中國(guó)科學(xué)院惠贈(zèng)。

2方法

2.1母液和工作液配制 ATP用無(wú)菌三蒸水配成濃度為500 mmol/L ATP母液，過(guò)濾后分裝，避光保存于-20 ℃,用前培養(yǎng)基稀釋成所需濃度的ATP工作液；KN-62用無(wú)菌DMSO溶解成濃度為1 mmol/L KN-62母液，分裝后避光保存于-20 ℃，用前培養(yǎng)基稀釋成特定濃度的KN-62工作液；培養(yǎng)基中加入特定量的ATP和KN-62母液配成KN-62干預(yù)工作液(含ATP)。

2.2細(xì)胞培養(yǎng)及實(shí)驗(yàn)分組 N9小膠質(zhì)細(xì)胞采用IMDM培養(yǎng)基培養(yǎng)，內(nèi)含5%胎牛血清、1×105U·L-1氨芐青霉素和1×105U· L-1鏈霉素，置于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)常規(guī)培養(yǎng)，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)分為正常對(duì)照組、ATP組和KN-62干預(yù)組。正常對(duì)照組：IMDM培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng)；ATP組：細(xì)胞接種24 h后，更換為特定摩爾濃度的ATP工作液；KN-62干預(yù)組：ATP處理前30 min加入KN-62工作液，孵育30 min后，更換為KN-62干預(yù)工作液。

2.3XTT法測(cè)細(xì)胞活力 取對(duì)數(shù)期細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為2×108cells·L-1，接種于96孔培養(yǎng)板，每孔100 μL細(xì)胞懸液，按上述方法分組，每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔，ATP處理一定時(shí)間后，用磷酸鹽緩沖液現(xiàn)配XTT溶液(1.00 g·L-1)及PMS溶液(0.15 g·L-1)，二者按一定比例混合后，每孔加入50 μL XTT/PMS混合液，上述配液及加液過(guò)程需避光操作，之后置培養(yǎng)箱中37 ℃孵育2 h，酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm波長(zhǎng)處吸光度(A)。根據(jù)下列公式計(jì)算各組細(xì)胞存活率：存活率(%)=A處理組-A空白組/A對(duì)照組-A空白組×100%，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2.4形態(tài)學(xué)觀察 將培養(yǎng)板置于倒置相差顯微鏡下觀察各組細(xì)胞形態(tài)變化，各組均取板孔正中視野進(jìn)行觀察并拍照。

2.5流式測(cè)細(xì)胞周期及凋亡 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為3×108cells·L-1，接種于培養(yǎng)瓶中，24 h后行各組處理，ATP作用3 h和6 h后，收集各組培養(yǎng)液，平衡鹽緩沖液漂洗2次并收集緩沖液，離心收集培養(yǎng)液及緩沖液中的細(xì)胞，胰酶消化收集瓶中其余貼壁細(xì)胞，1 000 r/min 離心5 min后棄去上清液，PBS重懸洗滌2次，細(xì)胞沉淀重懸于0.5 mL PBS緩沖液中，緩慢加入5 mL冰預(yù)冷的75%乙醇，4 ℃固定過(guò)夜。細(xì)胞上機(jī)檢測(cè)前先離心去乙醇，PBS洗滌2次，加入100 mg/L的 RNase A(DNase free)重懸細(xì)胞，37 ℃孵育30 min以消化RNA，離心后加入50 mg/L 的 PI 4 ℃避光染色30 min，200目濾網(wǎng)過(guò)濾，然后用流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行細(xì)胞周期時(shí)相動(dòng)力學(xué)及細(xì)胞凋亡檢測(cè)，根據(jù)所測(cè)得的DNA 分布圖用細(xì)胞周期及凋亡分析軟件進(jìn)行細(xì)胞周期及凋亡統(tǒng)計(jì)分析。

2.6免疫熒光細(xì)胞化學(xué)染色 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×108cells·L-1，接種于6孔板內(nèi)，板孔內(nèi)事先放有滅菌處理的長(zhǎng)條玻片，進(jìn)行爬片，24 h后行各組處理，于不同時(shí)點(diǎn)取出爬片，用預(yù)熱至37 ℃的PBS液漂洗3次，每次2 min，洗掉殘余培養(yǎng)液，免疫染色固定液常溫固定10 min。PBS 洗滌3次，每次5 min，0.1% Triton X-100作用5 min，PBS洗滌3次，每次5 min，3% BSA室溫孵育20 min，甩去多余液體不洗，滴加P2X7受體Ⅰ抗(PBS1∶100稀釋)4 ℃過(guò)夜，PBS漂洗3次，每次5 min，滴加Alexa Fluor 488熒光標(biāo)記Ⅱ抗(免疫熒光染色Ⅱ抗稀釋液1∶500稀釋) 4 ℃避光孵育60 min，PBS漂洗3次，每次5 min，滴加DAPI染色液室溫復(fù)染核5 min，PBS漂洗3次，每次5 min，抗熒光淬滅封片液封片，熒光顯微鏡下觀察拍照，隨機(jī)選取5個(gè)不同視野用Image-Pro Plus 6.0專業(yè)圖像分析軟件分析，得到的平均吸光度表示該視野平均熒光強(qiáng)度。

2.7Western blotting測(cè)P2X7受體蛋白水平 各組細(xì)胞用冰預(yù)冷PBS洗滌2次，加入細(xì)胞裂解液，冰上裂解30 min后，用細(xì)胞刮刀收集細(xì)胞，離心取上清，用BCA法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度。各組取變性蛋白30 μg進(jìn)行SDS-PAGE電泳分離蛋白質(zhì)后，轉(zhuǎn)至PVDF膜上，經(jīng)漂洗、封閉后加入兔源小鼠P2X7受體多克隆抗體(稀釋度為1∶200)，4 ℃孵育過(guò)夜，TBST洗膜3次，每次15 min，加堿性磷酸酯酶標(biāo)記的山羊抗兔Ⅱ抗37 ℃孵育1 h，TBST洗膜3次，每次15 min，BCIP/NBT顯色并掃描，以Band Scan 5.0凝膠圖像處理軟件進(jìn)行各條帶灰度分析。以GAPDH為內(nèi)參，各組P2X7受體與GAPDH條帶灰度比值表示該P(yáng)2X7受體相對(duì)含量。

2.8ELISA法測(cè)培養(yǎng)上清液中IL-1β含量 收集各組細(xì)胞上清液，離心后，依照試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，檢測(cè)各組細(xì)胞培養(yǎng)上清液中IL-1β含量。

3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié) 果

1ATP對(duì)N9小膠質(zhì)細(xì)胞活力的影響

XTT法檢測(cè)細(xì)胞活力結(jié)果如圖1所示，ATP對(duì)N9小膠質(zhì)細(xì)胞活力的損傷具有一定的劑量依賴性，500 μmol/L ATP和1 mmol/L ATP對(duì)N9小膠質(zhì)細(xì)胞活力的影響較小，作用24 h后，細(xì)胞活力分別為88.5%±5.5%和88.2%±8.4%。當(dāng)ATP增加到2 mmol/L 時(shí)，對(duì)細(xì)胞活力的損傷程度明顯增大，作用1 h、3 h、6 h、12 h和24 h后N9小膠質(zhì)細(xì)胞活力分別為71.2%±5.9%、67.5%±5.1%、61.2%±5.4%、18.9%±6.6%和11.6%±1.1%。而當(dāng)ATP濃度為5 mmol/L ATP和10 mmol/L ATP時(shí)，6 h后細(xì)胞活力分別為16.8%±1.6%和16.1%±2.0%，24 h后細(xì)胞活力僅為10.0%±0.3%和11.0%±0.8%。

Figure 1. Effect of ATP on the cell viability of N9 microglia.

圖1ATP對(duì)N9小膠質(zhì)細(xì)胞活力的影響

2KN-62對(duì)ATP損傷的N9小膠質(zhì)細(xì)胞活力的影響

如圖2所示，0.1%DMSO作用24 h后，N9小膠質(zhì)細(xì)胞活力為99.9%±5.2%，表明濃度≤0.1% DMSO對(duì)N9小膠質(zhì)細(xì)胞活力無(wú)影響。2 mmol/L ATP作用1 h、3 h、6 h、12 h和24 h后N9小膠質(zhì)細(xì)胞活力分別為71.2%±5.9%、67.5%±5.1%、61.2%±5.4%、18.9%±6.6%和11.6%±1.1%。而100 nmol/L KN-62干預(yù)后在2 mmol/L ATP作用的各時(shí)點(diǎn)細(xì)胞活力依次為66.5%±5.0%、64.9%±7.8%、58.9%±2.6%、19.1%±1.1%和16.3%±6.3%。而1 μmol/L KN-62干預(yù)后細(xì)胞活力在各時(shí)點(diǎn)分別為78.1%±5.9%、74.0%±7.6%、71.0%±4.7%、56.3%±3.7%和49.8%±2.8%。結(jié)果表明100 nmol/L KN-62對(duì)ATP損傷的N9小膠質(zhì)細(xì)胞沒(méi)有保護(hù)作用，而1 μmol/L KN-62干預(yù)則對(duì)ATP損傷的N9小膠質(zhì)細(xì)胞具有較好的保護(hù)作用。

Figure 2. Effect of KN-62 on the cell viability of N9 microglia injured by ATP.*P<0.05,**P<0.01vs2 mmol/L ATP group.

圖2KN-62對(duì)ATP損傷的N9小膠質(zhì)細(xì)胞活力的影響

3ATP及KN-62干預(yù)對(duì)N9小膠質(zhì)細(xì)胞形態(tài)的影響

如圖3所示，對(duì)照組N9小膠質(zhì)細(xì)胞多呈圓形，部分細(xì)胞有突起。隨培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)，細(xì)胞密度逐漸增大。ATP處理1h后，細(xì)胞突起消失，胞體回縮變圓，隨著ATP處理時(shí)間延長(zhǎng)，細(xì)胞皺縮程度增加，部分細(xì)胞開(kāi)始破裂，處理12 h及24 h后，與對(duì)照組相比，細(xì)胞密度明顯減少，大部分細(xì)胞嚴(yán)重皺縮死亡。而KN-62干預(yù)組細(xì)胞較為鋪展，隨時(shí)間延長(zhǎng)，KN-62干預(yù)組細(xì)胞密度顯著高于ATP組，形態(tài)也更接近于正常對(duì)照組。KN-62顯現(xiàn)出拮抗ATP毒性損傷的保護(hù)作用。

Figure 3. Effects of ATP and KN-62 intervention on the morphology of N9 microglia.Scale bar=300 μm.

圖3ATP和KN-62干預(yù)對(duì)N9小膠質(zhì)細(xì)胞形態(tài)的影響

4ATP及KN-62干預(yù)對(duì)N9小膠質(zhì)細(xì)胞凋亡的影響

如圖4A和D所示，對(duì)照組沒(méi)有細(xì)胞凋亡，而ATP作用3 h和6 h后，部分細(xì)胞發(fā)生凋亡，凋亡細(xì)胞比例分別為14.26%±0.72%和15.42%±0.93%，而KN-62可使ATP作用相應(yīng)時(shí)點(diǎn)的凋亡細(xì)胞比例分別下降至1.69%±0.09%和1.31%±0.07%。此結(jié)果表明,2 mmol/L ATP可以誘導(dǎo)N9小膠質(zhì)細(xì)胞凋亡，而阻斷劑KN-62則可以通過(guò)減少細(xì)胞凋亡、拮抗ATP引起的細(xì)胞損傷而起到保護(hù)作用。

圖4ATP和KN-62干預(yù)對(duì)N9小膠質(zhì)細(xì)胞周期和凋亡的影響

5ATP及KN-62干預(yù)對(duì)N9小膠質(zhì)細(xì)胞周期的影響

細(xì)胞周期檢測(cè)結(jié)果如圖4A、B和C所示，ATP作用3 h及6 h后，正常對(duì)照組、ATP組及KN-62干預(yù)組G0/G1期細(xì)胞比例無(wú)明顯差異(P>0.05)。而ATP組S期細(xì)胞比例明顯高于正常對(duì)照組(P<0.01)，而G2/M期細(xì)胞比例卻明顯低于對(duì)照組(P<0.01)。KN-62干預(yù)組與ATP組相比，S期細(xì)胞比例明顯降低(P<0.05)，而G2/M期細(xì)胞比例則顯著增多(P<0.05)。這些結(jié)果表明，ATP可使N9小膠質(zhì)細(xì)胞阻滯于S期，抑制細(xì)胞分裂增殖，而KN-62干預(yù)后可使細(xì)胞周期向正常方向恢復(fù)。

6ATP及KN-62干預(yù)對(duì)N9小膠質(zhì)細(xì)胞P2X7受體表達(dá)的影響

如圖5所示，P2X7受體在N9小膠質(zhì)細(xì)胞中廣泛地表達(dá)于胞膜、胞質(zhì)及核膜。ATP作用后，細(xì)胞胞體和胞核發(fā)生皺縮，細(xì)胞密度逐漸減少，但就單個(gè)細(xì)胞而言，P2X7受體表達(dá)部位并未見(jiàn)明顯改變，由于細(xì)胞皺縮變小，所以熒光強(qiáng)度稍強(qiáng)于對(duì)照組(P<0.05)。而KN-62干預(yù)組的細(xì)胞形態(tài)和密度更接近于正常對(duì)照組，細(xì)胞上P2X7受體表達(dá)分布也未見(jiàn)明顯改變。

圖5ATP和KN-62干預(yù)對(duì)P2X7受體表達(dá)的影響

7ATP及KN-62干預(yù)對(duì)N9小膠質(zhì)細(xì)胞P2X7受體蛋白水平的影響

如圖6所示，P2X7受體蛋白在N9小膠質(zhì)細(xì)胞中表達(dá)水平較高，ATP作用3 h后，正常對(duì)照組、2 mmol/L ATP組和KN-62+2 mmol/L ATP組3組之間P2X7受體蛋白的表達(dá)無(wú)明顯差異(P>0.05)，表明ATP作用及KN-62干預(yù)對(duì)P2X7受體蛋白的表達(dá)沒(méi)有調(diào)節(jié)作用。

圖6ATP和KN-62干預(yù)對(duì)N9小膠質(zhì)細(xì)胞P2X7受體蛋白表達(dá)的影響

8ATP及KN-62干預(yù)對(duì)N9小膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)液中IL-1β的影響

如表1所示，對(duì)照組細(xì)胞培養(yǎng)液中IL-1β水平低于試劑盒檢測(cè)下限4 ng·L-1，1 h后低、高ATP及KN-62干預(yù)組細(xì)胞培養(yǎng)液中的IL-1β仍然維持在較低水平，且各組間無(wú)差異(P>0.05)。隨著ATP處理時(shí)間延長(zhǎng)，各組IL-1β水平未出現(xiàn)明顯變化(P>0.05)，表明ATP及KN-62處理不增加N9小膠質(zhì)細(xì)胞釋放IL-1β。

表1 ATP和KN-62干預(yù)對(duì)N9小膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)液中IL-1β的影響

討 論

1970年，Burnstock首先提出ATP在胞外可以充當(dāng)信號(hào)分子的角色，并將其歸類為非膽堿能、非腎上腺素能的神經(jīng)遞質(zhì)。近些年來(lái)研究表明，ATP作為信號(hào)分子參與中樞及外周神經(jīng)系統(tǒng)的多種生理和病理過(guò)程，如胚胎和出生后早期發(fā)育、突觸可塑性、認(rèn)知功能、神經(jīng)性疼痛、痛覺(jué)過(guò)敏、神經(jīng)炎癥反應(yīng)、損傷、缺血、神經(jīng)退化性疾病、癲癇等[8-9]。目前關(guān)于ATP功能的研究正受到越來(lái)越多的關(guān)注。正常情況下，細(xì)胞外液中的ATP水平很低，但當(dāng)中樞神經(jīng)系統(tǒng)受到損傷(如缺血損傷)后，大量的ATP被釋放到胞外，導(dǎo)致細(xì)胞外液中的ATP濃度迅速升高，最終引起周圍神經(jīng)元及其它細(xì)胞的繼發(fā)性損傷和死亡。研究發(fā)現(xiàn)[10]，ATP對(duì)惡性腫瘤細(xì)胞如肝癌細(xì)胞、白血病細(xì)胞、結(jié)腸移植癌、人肺巨細(xì)胞癌及表皮樣癌等具有抑制增殖和誘發(fā)凋亡的作用。而本研究結(jié)果顯示，低劑量的ATP對(duì)N9小膠質(zhì)細(xì)胞活力的影響很小，當(dāng)ATP濃度達(dá)到或大于2 mmol/L ATP時(shí)，短時(shí)間內(nèi)就可以迅速引發(fā)N9小膠質(zhì)細(xì)胞活力降低，細(xì)胞形態(tài)發(fā)生改變，隨著ATP作用時(shí)間延長(zhǎng)，細(xì)胞活力進(jìn)一步降低，形態(tài)改變?cè)絹?lái)越明顯，P2X7受體阻斷劑KN-62可以拮抗ATP的損傷作用，ATP作用時(shí)間越長(zhǎng)，KN-62的拮抗作用就越明顯。此結(jié)果提示，P2X7受體介導(dǎo)了ATP對(duì)N9小膠質(zhì)細(xì)胞的毒性損傷作用。

為進(jìn)一步探討ATP對(duì)N9小膠質(zhì)細(xì)胞的損傷機(jī)制，采用流式細(xì)胞儀觀察ATP及KN-62干預(yù)對(duì)N9小膠質(zhì)細(xì)胞周期及凋亡的影響。一個(gè)完整的細(xì)胞周期包括：(1)G1期(gap1)：DNA復(fù)制前期；(2)S期(synthesis phase)：DNA復(fù)制期；(3)G2期(gap2)：有絲分裂前期；(4)M期(mitosis)：有絲分裂期。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，ATP對(duì)G0/G1期沒(méi)有影響，但是可將細(xì)胞阻滯在S期，不能進(jìn)入G2/M期，從而抑制細(xì)胞的分裂和增殖，且ATP處理可引起細(xì)胞發(fā)生較大比例凋亡，而KN-62干預(yù)之后，細(xì)胞S期阻滯情況得以緩解，細(xì)胞凋亡比例明顯下降。這些結(jié)果表明，ATP可通過(guò)P2X7受體的介導(dǎo)誘發(fā)細(xì)胞周期阻滯和凋亡從而造成對(duì)N9小膠質(zhì)細(xì)胞的損傷。

ATP的信使作用由膜上的P2受體介導(dǎo)，P2受體分為離子門控型P2X受體和G蛋白偶聯(lián)型P2Y受體兩類。目前，P2X受體已克隆出7個(gè)亞型，分別為P2X1-7，其中P2X7受體因其生理功能較為獨(dú)特且在多種生理病理過(guò)程中發(fā)揮重要作用，近些年來(lái)備受關(guān)注。體內(nèi)研究發(fā)現(xiàn)，病理情況下如腦缺血缺氧損傷后，往往會(huì)發(fā)生小膠質(zhì)細(xì)胞的大量激活增多和P2X7受體表達(dá)增加[5,11-12]，陳翀等[13]用ATP刺激原代培養(yǎng)的小膠質(zhì)細(xì)胞1 h后，免疫熒光檢測(cè)發(fā)現(xiàn)1 mmol/LATP和2 mmol/L ATP刺激組P2X7受體表達(dá)量增加，而3 mmol/L ATP刺激組細(xì)胞發(fā)生明顯凋亡，P2X7受體表達(dá)量減少。而本實(shí)驗(yàn)中免疫熒光和Western blotting檢測(cè)結(jié)果顯示，ATP及KN-62干預(yù)不改變P2X7受體在N9小膠質(zhì)細(xì)胞上的分布。2 mmol/L ATP作用3 h后，對(duì)照組、ATP組及KN-62干預(yù)組之間P2X7受體蛋白表達(dá)水平無(wú)明顯差異。這些結(jié)果提示在N9小膠質(zhì)細(xì)胞，ATP的毒性損傷作用只是通過(guò)激活P2X7受體的功能而實(shí)現(xiàn)的，并不涉及其分布和表達(dá)的改變。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果與前人體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果不一致可能是由于在體內(nèi)復(fù)雜的內(nèi)環(huán)境中，腦缺血損傷后往往出現(xiàn)小膠質(zhì)細(xì)胞的大量激活增多，而P2X7受體則在小膠質(zhì)細(xì)胞上有廣泛表達(dá)，因此，P2X7受體表達(dá)增多就不足為奇了。而體外實(shí)驗(yàn)中若培養(yǎng)條件有所不同，細(xì)胞對(duì)ATP的反應(yīng)敏感度就有差異。且文獻(xiàn)體外實(shí)驗(yàn)中只是根據(jù)細(xì)胞免疫熒光染色這一定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果判斷ATP上調(diào)了P2X7受體的表達(dá)，而本實(shí)驗(yàn)結(jié)合免疫熒光定性實(shí)驗(yàn)和Western blotting定量實(shí)驗(yàn)證明，ATP及KN-62干預(yù)不影響N9小膠質(zhì)細(xì)胞P2X7受體的分布和表達(dá)水平，因此結(jié)果更為可靠。

近幾年小膠質(zhì)細(xì)胞成為研究焦點(diǎn)，作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)的免疫細(xì)胞，它在急、慢性腦損傷疾病中的作用受到空前的關(guān)注。越來(lái)越多的研究發(fā)現(xiàn)小膠質(zhì)細(xì)胞在腦損傷尤其是腦缺血缺氧損傷中發(fā)揮著非常重要的作用。缺血缺氧損傷后，小膠質(zhì)細(xì)胞迅速激活，同時(shí)損傷的腦細(xì)胞釋放出大量的ATP，激活小膠質(zhì)細(xì)胞上的P2X7受體，隨后小膠質(zhì)細(xì)胞合成并釋放大量的炎性介質(zhì)，如IL-1β，引發(fā)炎性級(jí)聯(lián)效應(yīng)，最終導(dǎo)致其周圍腦細(xì)胞的繼發(fā)性損傷[5-6,14]。而Mingam等[15]體外研究發(fā)現(xiàn)采用ATP處理混合培養(yǎng)的原代膠質(zhì)細(xì)胞不能增加胞外液中IL-1β的水平。本研究結(jié)果也顯示，ATP雖然激活N9小膠質(zhì)細(xì)胞上的P2X7受體通道，但是卻沒(méi)有促進(jìn)IL-1β向胞外釋放。這些體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，在小膠質(zhì)細(xì)胞ATP雖可激活其上的P2X7受體，但卻不能引發(fā)炎癥反應(yīng)?？梢?jiàn)胞外ATP單獨(dú)誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷與小膠質(zhì)細(xì)胞的炎癥反應(yīng)無(wú)關(guān)。看來(lái)體內(nèi)胞外ATP誘導(dǎo)的繼發(fā)性腦損傷的機(jī)制還遠(yuǎn)未闡明，研究ATP嘌呤信號(hào)通路或許能發(fā)現(xiàn)神經(jīng)保護(hù)作用的新靶點(diǎn)，給腦損傷的防治帶來(lái)希望。

綜上所述，胞外高濃度的ATP(≥2 mmol/L)可迅速誘發(fā)N9小膠質(zhì)細(xì)胞的細(xì)胞周期阻滯和凋亡從而損傷細(xì)胞，而P2X7受體特異性阻斷劑KN-62則可通過(guò)減輕細(xì)胞周期阻滯和抑制細(xì)胞凋亡而拮抗ATP的損傷作用，表明ATP對(duì)N9小膠質(zhì)細(xì)胞的損傷機(jī)制與P2X7受體介導(dǎo)的細(xì)胞周期阻滯和凋亡有關(guān)；且由于ATP及KN-62均不影響N9小膠質(zhì)細(xì)胞炎癥因子的釋放，所以ATP對(duì)N9小膠質(zhì)細(xì)胞的損傷機(jī)制不涉及小膠質(zhì)細(xì)胞的炎癥反應(yīng)。至于ATP通過(guò)P2X7受體引發(fā)細(xì)胞周期阻滯和凋亡所涉及的具體通路和分子機(jī)制，除了P2X7受體外還有哪些受體及分子也參與了ATP對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞的損傷過(guò)程，這些問(wèn)題的闡明還需要更多的研究工作。

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InjuryeffectofadenosinetriphosphateonN9microglia

WANG Guo-hong1, GUO Zhi-yue1, YIN Ya-ling1, WEI Lin-yu1, LI Xin-juan1, LI Dong-liang1,2

(1DepartmentofPhysiologyandNeurobiology,XinxiangMedicalUniversity,Xinxiang453003,China;2StateKeyLaboratoryofMedicalNeurobiology,FudanUniversity,Shanghai200032,China.E-mail:xyldl8@126.com)

AIM: To investigate the injury effect of adenosine triphosphate (ATP) on N9 microglia.METHODSN9 microglia in logarithmic growth phase was randomly divided into 3 groups. In control group, the cells were cultured without ATP treatment. In ATP group, the cells were treatment with ATP after cultured for 24 h. In KN-62 intervention group, after pretreatment with KN-62 for 30 min, ATP was added in the cells. The cell viability was assessed by XTT assay. Cellular morphological changes were observed under phase-contrast microscope. The cell cycle and apoptosis were detected by flow cytometry. The expression of P2X7receptor was examined by immunofluorescence staining. The protein levels of P2X7receptor were measured by Western blotting. The concentration of IL-1β in the culture supernatant was detected by ELISA.RESULTSATP at dose of 500 μmol/L and 1 mmol/L only caused small damage to the cell viability of N9 microglia. The cell viability was 88.5%±5.5% and 88.2%±8.4% after treated with ATP for 24 h,respectively. The cell viability dropped rapidly and cell shrinkage occurred when the concentration of ATP increased to 2 mmol/L or higher. With the extension of experiment time, the cell viability and cell density decreased further and cell shrinkage was getting worse. KN-62 intervention improved the viability of N9 microglia injured by ATP. The morphology and density of N9 microglia in KN-62 intervention group were much better than those in ATP group. ATP arrested N9 microglia at S phase and increased cell apoptosis significantly (P<0.01vscontrol group). KN-62 intervention obviously relieved the cell cycle arrest and decreased the cell apoptosis caused by ATP (P<0.01). ATP and KN-62 intervention had no effect on the distribution of P2X7receptor. The protein levels of P2X7receptor had no significant difference among the 3 groups (P>0.05). ATP and KN-62 intervention had no effect on the release of IL-1β.CONCLUSIONHigh dose of ATP damages N9 microglia and its mechanism may be related to cell cycle arrest and apoptosis mediated by P2X7receptor but not to inflammatory response caused by microglia.

Adenosine triphosphate; Microglia; Receptors,purinergic P2X7; KN-62

R363

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2012.09.011