邵維斌,朱 莉,顧 琳,夏春英,李 忻,荀 康,馮松濤

(江蘇省鎮(zhèn)江市第一人民醫(yī)院腎臟內(nèi)科,江蘇鎮(zhèn)江,212002)

腹膜纖維化和大量新生血管形成是導(dǎo)致長(zhǎng)期腹膜透析患者腹膜功能衰竭的主要原因[1]。大量研究[2-3]表明:隨著腹膜透析的進(jìn)行,非生理性透析液尤其是晚期糖基化終產(chǎn)物(AGEs)、葡萄糖降解產(chǎn)物等可引起腹膜間皮細(xì)胞逐漸喪失上皮細(xì)胞表型,發(fā)生上皮細(xì)胞間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT),這種發(fā)生EMT的腹膜間皮細(xì)胞具有浸潤(rùn)和遷移的能力,是導(dǎo)致腹膜纖維化和新生血管形成的關(guān)鍵環(huán)節(jié)[4],防止和逆轉(zhuǎn)晚期糖基化終產(chǎn)物等引起的腹膜間皮細(xì)胞EMT對(duì)于防治長(zhǎng)期腹膜透析患者腹膜功能衰竭具有重要意義。本研究探討防治晚期糖基化終產(chǎn)物引起的腹膜間皮細(xì)胞EMT的方法。

1 材料與方法

1.1 原代大鼠腹膜間皮細(xì)胞的培養(yǎng)

大鼠腹膜間皮細(xì)胞分離、培養(yǎng)及鑒定,腹膜間皮細(xì)胞呈圓形、橢圓形、多邊形等,融合后呈典型的鋪路石樣。免疫組化結(jié)果顯示細(xì)胞角蛋白、波形蛋白陽性。取第3代細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2 晚期糖基化終產(chǎn)物誘導(dǎo)大鼠腹膜間皮細(xì)胞上皮-間葉轉(zhuǎn)化

第3代大鼠腹膜間皮細(xì)胞經(jīng)含80 mmol/L AGEs-BSA的M 199培養(yǎng)基培養(yǎng)72h[5],以含80 mmol/L BSA的M199培養(yǎng)基為對(duì)照,正常大鼠腹膜間皮細(xì)胞呈鋪路石狀,在晚期糖基化終產(chǎn)物作用72 h后細(xì)胞出現(xiàn)明顯的梭形或不規(guī)則形改變,似成纖維細(xì)胞,部分細(xì)胞出現(xiàn)互相交叉重疊現(xiàn)象。實(shí)時(shí)定量PCR(RT-PCR)檢測(cè)結(jié)果顯示,晚期糖基化終產(chǎn)物刺激后,大鼠腹膜間皮細(xì)胞α平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-SMA)mRNA表達(dá)水平增加而E-cadherin mRNA表達(dá)水平下降;Western印跡結(jié)果顯示,晚期糖基化終產(chǎn)物刺激后,大鼠腹膜間皮細(xì)胞α-SMA蛋白表達(dá)水平增加,而 E-cadherin蛋白表達(dá)水平下降。與對(duì)照組及BSA組相比,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。表明晚期糖基化終產(chǎn)物誘導(dǎo)大鼠腹膜間皮細(xì)胞上皮-間葉轉(zhuǎn)化。

1.3 分組

對(duì)照組,含80 mmol/L AGEs-BSA的M199培養(yǎng)基;5ng/mL骨形成蛋白-7(BMP-7)組,含5 ng/mL和80 mmol/L AGEs-BSA(晚期糖基化終產(chǎn)物牛血清白蛋白)的M199培養(yǎng)基;10 ng/mL BMP-7組,含10 ng/mL 和80 mmol/L AGEs-BSA的M199培養(yǎng)基;晚期糖基化終產(chǎn)物誘導(dǎo)上皮-間葉轉(zhuǎn)化的大鼠腹膜間皮細(xì)胞經(jīng)上述各組培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h后收集細(xì)胞,分別提取 RNA、蛋白。

1.4 RT-PCR檢測(cè) E-cadherin、α-SMA 、Ⅰ型膠原(Collagen I)、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1(TGF-β1)、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)mRNA的表達(dá)

細(xì)胞總RNA抽提按Trizol試劑盒的方法進(jìn)行,運(yùn)用RT-PCR試劑盒(德國Qiagen)檢測(cè),反轉(zhuǎn)錄50℃20 min,E-cadherin 引物序列:正義鏈5′-ACCCCTGTTGGTGTCTTT-3′, 反義鏈 5′-TTCGGGCTTGTTGTCATTCT-3′。α-SMA 引物序列 :正義鏈 5′-GCTCTGTAAGGCGGGCTTTG-3′; 反義鏈5′-ACGAAGGAATAGCCACGCTCA-3′。CollagenI引物序列:正義鏈 5′-GGTAACGATGGTGCTGTCGG-3′, 反義鏈 5′-GGGACCTTGAACTCCAGCAG-3′。TGF-β1引物序列:正義鏈5′-CGAGGTGACCTGGGCACCATCC-3′,反義鏈 5′-CTGTGCTATTGCCTTGTC-3′。VEGF 引物序列:正義鏈 5′-TTACTGCTGTACCTCCAC-3′, 反義鏈5′-ACAGGACGGCTTGAAGATA-3′。 GAPDH 引物 序列:正義鏈 5′-TGAACGGGAAGCTCACTGG-3′, 反義鏈 5′-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3′。 HotStarTaq DNA多聚酶激活95℃15 min,E-cadherin反應(yīng)條件:94℃變性30s,55℃退火30s,72℃延伸45 s,35個(gè)連續(xù)循環(huán);-SMA反應(yīng)條件:94℃變性30s,57℃退火30s,72℃延伸45 s,28個(gè)連續(xù)循環(huán);CollagenI反應(yīng)條件:94℃變性30s,57℃退火30s,72℃延伸45 s,29個(gè)連續(xù)循環(huán)。TGF-β1反應(yīng)條件:94℃變性30s,55℃退火30s,72℃延伸45 s,35個(gè)連續(xù)循環(huán)。VEGF反應(yīng)條件:94℃變性30s,55℃退火30s,72℃延伸45 s,40個(gè)連續(xù)循環(huán)。得出Ct值按公式2-△△Ct求出基因表達(dá)的相對(duì)變化量,然后進(jìn)行各組間比較。

1.5 Western印跡法檢測(cè)E-cadherin、α-SMA蛋白的表達(dá)

裂解處理后的大鼠腹膜間皮細(xì)胞,4℃1000 r/min離心10 min后取裂解液上清測(cè)蛋白濃度,取細(xì)胞裂解蛋白(約 30 μg)經(jīng) SDS-PAGE凝膠電泳后電轉(zhuǎn)移至PVDF膜,5%脫脂奶粉封閉2 h,分別加入小鼠抗E-cadherin抗體(美國BD)、小鼠抗α-SMA抗體(丹麥,Dako)和小鼠抗β-actin抗體(美國CST)4℃過夜,洗膜后加辣根過氧化酶標(biāo)記的大鼠抗小鼠IgG抗體(美國CST),37℃1.5 h,洗膜后加ECL試劑,X線自顯影顯示結(jié)果,分析光帶的吸光度。

1.6 ELISA法測(cè)定細(xì)胞培養(yǎng)液中TGF-β1和VEGF

大鼠腹膜間皮細(xì)胞分組干預(yù)48 h和72 h后,離心收集細(xì)胞上清液,按ELISA試劑盒說明檢測(cè)TGF-β1和VEGF蛋白水平。

2 結(jié) 果

2.1 RT-PCR檢測(cè)E-cadherin 、α-SMA 、CollagenI、TGF-β、VEGF mRNA 表達(dá)結(jié)果

BMP-7作用48 h后,上皮-間葉轉(zhuǎn)化的大鼠腹膜間皮細(xì)胞E-cadherin mRNA表達(dá)水平增加(圖 1),而 α-SMA 、Collagen I、TGF-β、VEGF mRNA表達(dá)水平下降(圖2～圖5)。與對(duì)照組相比,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

圖1 各組間皮細(xì)胞E-cadherin mRNA的相對(duì)表達(dá)量

圖2 各組間皮細(xì)胞α-SMA mRNA的相對(duì)表達(dá)量

2.2 Western印跡測(cè)定E-cadherin、α-SMA 表達(dá)結(jié)果

BMP-7作用48 h后,上皮-間葉轉(zhuǎn)化的大鼠腹膜間皮細(xì)胞E-cadherin蛋白表達(dá)水平增加(圖6),而α-SMA蛋白表達(dá)水平下降(圖7)。與對(duì)照組相比,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

圖3 各組間皮細(xì)胞CollagenI mRNA的相對(duì)表達(dá)量

圖4 各組間皮細(xì)胞TGF-β1 mRNA的相對(duì)表達(dá)量

圖5 各組間皮細(xì)胞VEGF mRNA相對(duì)表達(dá)量

圖6 各組間皮細(xì)胞E-cadherin蛋白的相對(duì)表達(dá)量

圖7 各組間皮細(xì)胞α-SMA蛋白的相對(duì)表達(dá)量

2.3 ELISA 法測(cè)定TGF-β、VEGF蛋白表達(dá)水平

BMP-7作用48 h后,上皮-間葉轉(zhuǎn)化的大鼠腹膜間皮細(xì)胞TGF-β、VEGF蛋白表達(dá)水平下降(圖8～圖9),與對(duì)照組相比,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

圖8 各組間皮細(xì)胞TGF-β1蛋白的表達(dá)水平

圖9 各組間皮細(xì)胞VEGF蛋白的表達(dá)水平

3 討 論

腹膜透析是終末期腎功能衰竭的主要治療方法之一,已進(jìn)入臨床30余年,隨著其裝置的不斷改進(jìn),在我國越來越多慢性腎衰患者開始腎替代治療時(shí)首選腹膜透析療法。但是隨著腹膜透析時(shí)間延長(zhǎng),由于非生理性透析液尤其是高濃度葡萄糖、葡萄糖降解產(chǎn)物、晚期糖基化終產(chǎn)物等可引起腹膜結(jié)構(gòu)改變和腹膜功能衰竭,臨床上出現(xiàn)超濾失敗[6]。這是患者退出腹膜透析的主要原因之一,同時(shí)也制約了腹膜透析的應(yīng)用和發(fā)展[7]。長(zhǎng)期腹膜透析患者腹膜出現(xiàn)表層間皮細(xì)胞消失、大量新生血管形成及透明樣血管病變、纖維化等病理改變,腹膜纖維化和大量新生血管形成是導(dǎo)致腹膜功能衰竭的主要原因。最近的研究[1-3,8-9]發(fā)現(xiàn),隨著腹膜透析的進(jìn)行,腹膜透析患者腹膜間皮細(xì)胞逐漸喪失上皮細(xì)胞表型,同時(shí)獲得肌纖維母細(xì)胞樣的特性,即發(fā)生上皮-間葉轉(zhuǎn)化。越來越多的證據(jù)表明[1,10],腹膜透析患者腹膜組織中肌纖維母細(xì)胞明顯增多,這種細(xì)胞具有合成細(xì)胞外基質(zhì)、細(xì)胞因子、生長(zhǎng)因子及參與炎癥反應(yīng)的能力等特性,在各種修復(fù)及纖維化過程中起重要作用。研究[11-13]證明上皮-間葉轉(zhuǎn)化在腎、肝、肺等器官纖維化中有重要的作用,本研究先前表明:高濃度葡萄糖能和晚期糖基化終產(chǎn)物誘導(dǎo)大鼠腹膜間皮細(xì)胞上皮-間葉轉(zhuǎn)化[5,14],這種發(fā)生上皮-間葉轉(zhuǎn)化上調(diào)了 TGF-β、VEGF 的表達(dá),而 TGF-β、VEGF在腹膜透析時(shí)腹膜纖維化和腹膜新生血管形成過程中起重要作用,提示間皮細(xì)胞上皮-間葉轉(zhuǎn)化可能是導(dǎo)致腹膜透析時(shí)腹膜纖維化和新生血管形成的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。因而尋求防治間皮細(xì)胞上皮-間葉轉(zhuǎn)化的有效方法,具有重要的臨床意義。

本研究中探討B(tài)MP-7對(duì)晚期糖基化終產(chǎn)物誘導(dǎo)大鼠腹膜間皮細(xì)胞上皮-間葉轉(zhuǎn)化的影響。體外研究發(fā)現(xiàn):BMP-7能上調(diào)上皮-間葉轉(zhuǎn)化的大鼠腹膜間皮細(xì)胞E-cadherin表達(dá)和下調(diào)α-SMA、Collagen I表達(dá),表明BMP-7能逆轉(zhuǎn)晚期糖基化終產(chǎn)物誘導(dǎo)大鼠腹膜間皮細(xì)胞EMT。同時(shí)本研究還發(fā)現(xiàn)BMP-7能下調(diào)TGF-β、VEGF表達(dá),而 TGF-β、VEGF在腹膜纖維化和腹膜新生血管形成過程中起重要作用。表明BMP-7可能具有防治腹膜透析時(shí)腹膜纖維化和腹膜新生血管形成作用。本研究結(jié)果為進(jìn)一步探討防治腹膜透析時(shí)腹膜功能衰竭的有效方法提供依據(jù)。

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