福建省南安市醫(yī)院（362300）黃德勝 莊宇亮

常規(guī)血液透析無(wú)法將蛋白質(zhì)結(jié)合尿毒癥毒素排出體外，導(dǎo)致患者受到蛋白質(zhì)結(jié)合尿毒癥毒素的危害[1][2][3]。當(dāng)氯化氧化劑的損傷后，所產(chǎn)生的含有雙酪氨酸的蛋白交聯(lián)產(chǎn)物即為AOPP[4]。AOPP可刺激單核細(xì)胞分泌TNF-α等炎癥因子[5]。腹膜表層間皮細(xì)胞（peritoneal mesothelial cells，PMCs）可維持腹膜結(jié)構(gòu)和功能穩(wěn)定[6][7]。AGEs可導(dǎo)致腹膜功能衰竭[8]。α-平滑肌肌動(dòng)蛋白（α-SMA）、E-鈣黏蛋白（E-cadherin）及轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1（TGF-β1）等與腹膜間皮細(xì)胞發(fā)生EMT相關(guān)。本研究探討尿毒癥晚期糖基化終產(chǎn)物和蛋白結(jié)合溶質(zhì)誘導(dǎo)腹膜間皮細(xì)胞功能障礙的機(jī)制。

1 方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng) 將人腹膜間皮細(xì)胞（HPMC）移至25mL的細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，補(bǔ)充含10%胎牛血清的M119培養(yǎng)基至5mL。將細(xì)胞置于37℃下的CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)和傳代。

1.2 MTT法測(cè)定各組細(xì)胞增殖抑制率 選取含有0、20、40、60、80、100和120mM的AGEs和AOPP分別作用于人腹膜間皮細(xì)胞，采用MTT法測(cè)定不同濃度的AGEs或AOPP對(duì)各組細(xì)胞的增殖抑制率。用酶標(biāo)儀在570nm處測(cè)定吸光度值。細(xì)胞增殖抑制率（%）=（1-試驗(yàn)組平均OD值/對(duì)照組平均OD值）×100%。

1.3 實(shí)時(shí)定量PCR（q-PCR）法 人腹膜間皮細(xì)胞分組為正常對(duì)照（Control）組、80mM AGEs處理（AGEs）組和60mM AOPP處理（AOPP）組。反轉(zhuǎn)錄體系為20μL：1μL總RNA，4μL 5×Reaction Mix，2μL10×Super Script Enzyme Mix，加入雙蒸水將體系補(bǔ)足至20μL，混勻后離心。反應(yīng)條件為：37℃下60min，95℃下5min，置于4℃保存?zhèn)溆??；虻南鄬?duì)表達(dá)用2-△△CT法進(jìn)行計(jì)算。

1.4 蛋白免疫印跡（Western Blot）法 電泳結(jié)束后，將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。一抗（1∶1000）4℃孵育過(guò)夜。用TBST洗膜三次，每次15min，二抗（1∶4000）室溫孵育2h，用TBST洗膜三次。化學(xué)發(fā)光法顯色。

附表1 MTT法測(cè)定不同濃度AGEs對(duì)人腹膜間皮細(xì)胞增殖抑制率（±s）

附表1 MTT法測(cè)定不同濃度AGEs對(duì)人腹膜間皮細(xì)胞增殖抑制率（±s）

注：與正常對(duì)照（0mMAGEs）組相比，*P＜0.05，**P＜0.01。

AGEs濃度（mM） 細(xì)胞增殖抑制率（%）0 0.00±0.00 20 6.75±0.42 40 8.58±0.64*60 11.18±0.53*80 19.33±0.62**100 14.55±0.68*120 10.52±0.35*

附表2 MTT法測(cè)定不同濃度AOPP對(duì)人腹膜間皮細(xì)胞增殖抑制率（±s）

注：與正常對(duì)照（0mMAOPP）組相比，*P＜0.05，**P＜0.01。

AOPP濃度（mM） 細(xì)胞增殖抑制率（%）0 0.00±0.00 20 4.32±0.32 40 6.52±0.25*60 18.25±0.67**80 12.36±0.73*100 9.53±0.65*120 7.54±0.56*

附表3 q-PCR法檢測(cè)各組細(xì)胞中KLF2的mRNA表達(dá)（±s）

注：與Control組相比，**P＜0.01。

組別 KLF2相對(duì)mRNA表達(dá)Control組 1.00 AGEs組 0.56±0.09**AOPP組 0.47±0.07**

附表4 q-PCR法檢測(cè)各組細(xì)胞中TGF-β1的mRNA表達(dá)（±s）

附表4 q-PCR法檢測(cè)各組細(xì)胞中TGF-β1的mRNA表達(dá)（±s）

注：與Control組相比，**P＜0.01。

組別 TGF-β1相對(duì)mRNA表達(dá)Control組 1.00 AGEs組 0.56±0.09**AOPP組 0.47±0.07**

2 結(jié)果

2.1 MTT法測(cè)定不同濃度AGEs對(duì)人腹膜間皮細(xì)胞增殖抑制率 見(jiàn)附表1。

2.2 MTT法測(cè)定不同濃度AOPP對(duì)人腹膜間皮細(xì)胞增殖抑制率 見(jiàn)附表2。

2.3 q-PCR法測(cè)定AGEs和AOPP對(duì)人腹膜間皮細(xì)胞中KLF2 mRNA表達(dá)的影響 見(jiàn)附表3。

2.4 q-PCR法測(cè)定AGEs和AOPP對(duì)人腹膜間皮細(xì)胞中TGF-β1 mRNA表達(dá)的影響 見(jiàn)附表4。

2.5 Western Blot法測(cè)定AGEs和AOPP對(duì)人腹膜間皮細(xì)胞中Collagen I 蛋白表達(dá)的影響 如附圖1所示，與正常對(duì)照組相比，AGEs組和AOPP組人腹膜間皮細(xì)胞中Collagen I的蛋白表達(dá)上調(diào)（P＜0.01）。

2.6 Western Blot法測(cè)定AGEs和AOPP對(duì)人腹膜間皮細(xì)胞中α-SMA蛋白表達(dá)的影響 如附圖2所示，與正常對(duì)照組相比，AGEs組和AOPP組人腹膜間皮細(xì)胞中α-SMA的蛋白表達(dá)上調(diào)，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。

2.7 Western Blot法測(cè)定AGEs和AOPP對(duì)人腹膜間皮細(xì)胞中E-cadherin蛋白表達(dá)的影響 如附圖3所示，與正常對(duì)照組相比，AGEs組和AOPP組人腹膜間皮細(xì)胞中E-cadherin的蛋白表達(dá)下調(diào)，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。

附圖1 Western Blot法測(cè)定AGEs和AOPP對(duì)人腹膜間皮細(xì)胞中Collagen I蛋白表達(dá)的影響

附圖2 Western Blot法測(cè)定AGEs和AOPP對(duì)人腹膜間皮細(xì)胞中α-SMA蛋白表達(dá)的影響

附圖3 Western Blot法測(cè)定AGEs和AOPP對(duì)人腹膜間皮細(xì)胞中E-cadherin蛋白表達(dá)的影響

3 討論

腹膜間皮細(xì)胞可抵抗非生理性的腹膜透析液對(duì)基底膜及膜下結(jié)締組織的損傷。腹膜間皮細(xì)胞對(duì)維持腹腔的抗菌防御、細(xì)胞外基質(zhì)的合成和降解、調(diào)節(jié)局部血管張力及腹腔內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定有重要的作用。尿毒癥晚期糖基化終產(chǎn)物（AGEs）和蛋白結(jié)合溶質(zhì)（AOPP）是尿毒癥患者透析過(guò)程中產(chǎn)生的非生理性的物質(zhì)，可損傷腹膜間皮細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和功能，導(dǎo)致腹膜功能衰竭。

KLF2因子可表達(dá)于成熟的內(nèi)皮細(xì)胞中，可通過(guò)抑制炎癥相關(guān)信號(hào)通路，從而發(fā)揮其抗炎功能。高濃度的糖含量抑制KLF2表達(dá)，從而加重內(nèi)皮細(xì)胞的損傷及炎癥反應(yīng)。本研究發(fā)現(xiàn)，AGE和AOPP均可抑制人腹膜間皮細(xì)胞中KLF2的mRNA表達(dá)。

本研究發(fā)現(xiàn)，AGE和AOPP均可提高人腹膜間皮細(xì)胞中TGF-β1的mRNA表達(dá)，促進(jìn)腹膜透析時(shí)腹膜纖維化和腹膜新生血管的形成。當(dāng)腹膜間皮細(xì)胞發(fā)生EMT后，細(xì)胞間粘附連接蛋白E-鈣黏蛋白(E-cadherin)、α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-SMA)和Ⅰ型膠原(Collagen I)的表達(dá)發(fā)生變化。α-SMA是細(xì)胞轉(zhuǎn)化為肌成纖維細(xì)胞的標(biāo)志性蛋白。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)，人腹膜間皮細(xì)胞在受到AGEs或AOPP刺激后，AGE和AOPP均可促進(jìn)人腹膜間皮細(xì)胞的EMT過(guò)程，誘導(dǎo)人腹膜間皮細(xì)胞功能障礙。

綜上所述，尿毒癥晚期糖基化終產(chǎn)物可通過(guò)抑制Krüppel-樣因子2上調(diào)TGF-β1、Collagen I和α-SMA的表達(dá)，下調(diào)E-cadherin的表達(dá)，誘導(dǎo)人腹膜間皮細(xì)胞的上皮-間葉轉(zhuǎn)化，進(jìn)而導(dǎo)致人腹膜間皮細(xì)胞功能障礙。