徐志勇 陳 婕 肖 榮 朱 凡＊

乙型肝炎是在我國廣泛流行，嚴(yán)重危害人民健康的常見傳染病。由于乙型肝炎病毒（HBV）聚合酶在催化RNA中間體到DNA負(fù)鏈的逆轉(zhuǎn)錄過程中缺少校正活性，使HBV在各種內(nèi)源性（機(jī)體免疫變化）和外源性（藥物治療以及環(huán)境影響）壓力下，常常發(fā)生變異，特別是長期使用抗病毒藥物拉米夫定的HBV感染者，其體內(nèi)可檢測到DNA基序酪氨酸-蛋氨酸-天冬氨酸-天冬氨酸（YMDD）204位點(diǎn)突變（rtM204I／V），且常表現(xiàn)為野生株和變異株或是幾種變異株共生雜合狀態(tài)［1］。本文報(bào)道145例服用拉米夫定的乙肝患者發(fā)生HBV rtM204I／V位點(diǎn)突變與HBV數(shù)量和用藥時(shí)間的關(guān)系，為乙肝患者臨床個(gè)體化治療提供參考。

1 資料與方法

1.1 檢測對象

選擇2008年6月～2011年8月來自武漢普仁醫(yī)院、武漢市江夏區(qū)人民醫(yī)院等醫(yī)療機(jī)構(gòu)就診的145例乙肝患者（符合中華醫(yī)學(xué)會(huì)慢性乙型病毒性肝炎臨床診斷標(biāo)準(zhǔn)［2］），并排除其它病毒如丙型肝炎病毒（HCV）、丁型肝炎病毒（HDV）、甲型肝炎病毒（HAV）、戊型肝炎病毒（HEV）和艾滋病毒（HIV）等導(dǎo)致的肝臟損害者；用藥初期rtM204I／V檢測陰性。

145例患者中男76例，女69例，平均年齡35.80±12.50歲。所有患者均連續(xù)接受葛蘭素史克制藥（蘇州）有限公司生產(chǎn)的賀普?。ɡ追蚨ǎ┍∫缕▏?藥 準(zhǔn) 字 H20030581，0.1g／片 ）治 療，口 服100mg，每日1次，治療時(shí)間6～24個(gè)月。后文兩種分組中各組年齡、性別、肝功能情況等差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，具有可比性。

1.2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測HBV數(shù)量

采用真空促凝管采集患者治療結(jié)束后空腹靜脈血，離心后分離血清送檢。采用美國ABI 7300熒光定量PCR分析儀檢測HBV DNA數(shù)量，試劑盒來自艾康生物技術(shù)（杭州）有限公司，批號(hào)分別為國藥準(zhǔn)字S20060017和國食藥監(jiān)械（準(zhǔn)）字2011第3401263號(hào)，最低檢測下限500IU／ml。具體反應(yīng)體系的建立以及實(shí)驗(yàn)步驟嚴(yán)格按照試劑盒和儀器說明書進(jìn)行。

1.3 DNA測序

采用直接測序法。以熒光定量PCR檢測時(shí)提取的HBV DNA為模板，采用巢式PCR擴(kuò)增HBV P區(qū)基因，兩對引物分別為：F1：5’-CTG CTC AAG GAA CCT CTA TG-3’，R1：5’-AGG TGA AGC GAA GTG CAC-3’；F2：5’-CAT CCT GCT GCT ATG CCT C-3’，R2：5’-GTT CAA ATG TAT ACC CAA AG-3’。PCR體系為50μl，含10×buffer（Mg2+plus）5μl，dNTP 0.2μM，上、下游引物各10pmol，高保真 Taq酶（日本 ToYoBo公司）1.25U，DNA模板2μl。PCR擴(kuò)增條件為：94℃預(yù)變性2min；94℃ 30s，55℃25s，72℃ 40s，共35個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸2min。對以上PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳確認(rèn)后，送上海英俊生物技術(shù)有限公司測序。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 15.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件。計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料用百分率（%）表示，采用χ2檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 HBV DNA數(shù)量與YMDD變異病毒

將 HBV DNA數(shù)量以105IU／ml為界線［3］，分為 HBV DNA≥105IU／ml組（B組，68例）和＜105IU／ml組（A組，77例）。分別對兩組YMDD rtM204I／V進(jìn)行分析和比較，具體結(jié)果如表1：組間比較，B組的YMDD純合突變率高于A組，但其雜合突變率低于A組；組內(nèi)比較，B組的純合突變率高于雜合突變率，A組的純合突變率低于雜合突變率，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

表1 不同HBV DNA數(shù)量與YMDD突變率（n，%）

2.2 HBV YMDD突變率與治療時(shí)間

根據(jù)測序結(jié)果將145例患者分為未變異組（YMDD）、純 合 變 異 組 （YVDD、YIDD、YVDD／YIDD）和 雜 合 共 生 組 （YMDD／YIDD、YMDD／YVDD、YMDD／YVDD／YIDD），分析各組變異率和藥物治療時(shí)間。結(jié)果顯示，145例乙肝患者中，未發(fā)生變異者66例（45.52%），平均治療時(shí)間為252天；出現(xiàn)純合變異者46例（31.72%），平均治療時(shí)間為383天；出現(xiàn)雜合共生者33例（22.76%），平均治療時(shí)間為488天。統(tǒng)計(jì)分析表明，純合變異組突變率高于雜合共生組，但其拉米夫定治療時(shí)間短于雜合共生組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表2。

表2 HBV YMDD變異與藥物治療時(shí)間

3 討 論

慢性乙肝患者的治療是一個(gè)長期的過程，目前臨床上以核苷類藥物為主的抗病毒治療被普遍采用，隨之而來的是由藥物引起的病毒變異以及耐藥現(xiàn)象的出現(xiàn)。并且由于不同的病毒變異株對于相關(guān)藥物的反應(yīng)效果以及采用的具體治療方案之間有著很大的差異，所以在明確患者體內(nèi)的病毒數(shù)量以及相關(guān)免疫指標(biāo)的同時(shí)，在臨床治療，特別是初診中還需要明確患者體內(nèi)的病毒變異以及雜合共生狀態(tài)。

本文分析結(jié)果表明，乙肝患者HBV DNA≥105IU／ml組純合突變者比例顯著高于HBV DNA＜105IU／ml組。提示HBV數(shù)量較低時(shí)，乙肝患者體內(nèi)可能處于多種病毒株雜合狀態(tài)，特別是那些長期治療而遷延不愈的病人，需優(yōu)先考慮聯(lián)合用藥，以便對不同基因型毒株進(jìn)行抑制［4］。而對病毒數(shù)量較高的病人，由于其體內(nèi)病毒株可能比較單一，此時(shí)應(yīng)盡量采用單一藥物治療。對于HBV純合突變與雜合共生狀態(tài)的關(guān)系，推測可能是體內(nèi)不同病毒株相互抑制，導(dǎo)致每個(gè)單一毒株復(fù)制較慢，而使體內(nèi)總病毒數(shù)量不高；但當(dāng)其中某一個(gè)毒株在內(nèi)外環(huán)境壓力下開始大量復(fù)制，其它毒株被完全抑制時(shí)，體內(nèi)病毒株多為單一純合狀態(tài)［5］。但這種推測還需要大量實(shí)驗(yàn)予以證實(shí)。

本實(shí)驗(yàn)還證實(shí)HBV的變異與藥物拉米夫定治療的時(shí)間有關(guān)，治療時(shí)間較長者，容易產(chǎn)生YMDD變異（包括純合變異和雜合變異），這與Lai等［6］的觀察結(jié)果一致。

HBV變異是一個(gè)長期的、由單一野生純合狀態(tài)向多個(gè)變異株雜合共生狀態(tài)發(fā)展的過程。這種變異與目前臨床耐藥變化相吻合［7］。因此強(qiáng)調(diào)在對乙肝患者藥物治療時(shí)要注意控制總治療時(shí)間，盡量在治療早期取得效果，避免長期用藥引起HBV變異而給臨床治療帶來困難。

1 Mello FC，Lago BV，Lewis-Ximenez LL，et al.Detection of mixed populations of wild-type and YMDD hepatitis B variants by pyrosequencing in acutely and chronically infected patients［J］.BMC Microbiol，2012，12（1）：96～104.

2 賈繼東，李蘭娟.慢性乙型肝炎防治指南（2010年版）［J］.肝臟，2011，16（1）：2～16.

3 乙型肝炎病毒耐藥專家委員會(huì).乙型肝炎病毒耐藥專家共識(shí)［J］.中華預(yù)防醫(yī)學(xué)雜志，2009，43（9）：809～813.

4 Liu L，Tang YZ，Li JG，et al.Evolution of hepatitis B virus quasispecies during lamivudine-entecavir sequential therapy［J］.Zhonghua Gan Zang Bing Za Zhi，2010，18（6）：423～427.

5 Feng Liu，Li Chen，DM Yu，et al.Evolutionary patterns of hepatitis B virus quasispecies under different selective pressures：correlation with antiviral efficacy［J］.Gut，2011，60（9）：1 269～1 277.

6 Lai CL，Dienstag J，Schiff E，et al.Prevalence and clinical correlates of YMDD variants during lamivudine therapy for patients with chronic hepatitis B［J］.Clin Infect Dis，2003，36（6）：687～696.

7 Liang PP，Guo JJ，Li QL，et al.Evolution of hepatitis B virus quasispecies during antiviral therapy in one chronic hepatitis B patient［J］.Zhonghua Gan Zang Bing Za Zhi，2011，19（7）：516～520.