董慶利，高 翠，丁 甜，余華星

(1 上海理工大學(xué)食品科學(xué)與工程研究所，上海 200093;2 韓國(guó)國(guó)立江原大學(xué)食品科學(xué)與生物技術(shù)學(xué)科，韓國(guó)春川 200701)

氣單胞菌Aeromonas spp.屬于革蘭陰性兼性厭氧短桿菌，在近幾年的研究中被證實(shí)是一種人畜共患病的病原菌，有關(guān)該菌為胃腸炎和敗血癥的一種重要致病菌的報(bào)道日益增多［1－3］，同時(shí)該菌也是冷卻豬肉中的優(yōu)勢(shì)腐敗菌之一［4］.冷卻肉是指在衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)條件下，按照國(guó)家屠宰規(guī)范對(duì)畜禽進(jìn)行屠宰后24 h內(nèi)將肉冷卻，使得肉的中心溫度降至0～4℃，并在隨后的排酸、分割、剔骨、包裝、運(yùn)輸以及銷售過程中，肉溫始終保持在0～4℃［5］.冷卻豬肉的優(yōu)勢(shì)腐敗菌有假單胞菌Pseudomonas spp.、氣單胞菌、腸桿菌屬Enterobacteriaceae等［6］.在國(guó)內(nèi)外對(duì)冷卻豬肉中微生物進(jìn)行的相關(guān)研究中多是針對(duì)大腸埃希菌Escherichia coli、假單胞菌等病原菌，而針對(duì)氣單胞菌的相關(guān)研究較少.在對(duì)氣單胞菌的研究過程中發(fā)現(xiàn)除溫度外，pH和初始接種量對(duì)氣單胞菌的生長(zhǎng)也有顯著影響，所以設(shè)計(jì)試驗(yàn)研究這3種環(huán)境因子對(duì)冷卻豬肉中氣單胞菌生長(zhǎng)的影響，以便更好地監(jiān)測(cè)其生長(zhǎng)，降低病原菌污染食品的風(fēng)險(xiǎn).本研究將氣單胞菌直接接種到豬肉中，在不同的環(huán)境下進(jìn)行培養(yǎng)，觀測(cè)環(huán)境對(duì)其生長(zhǎng)的影響規(guī)律，用一級(jí)和二級(jí)微生物模型對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合，并通過數(shù)學(xué)檢驗(yàn)和隨機(jī)條件模擬，使得到的模型更接近于冷卻豬肉中氣單胞菌實(shí)際的生長(zhǎng)規(guī)律.

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

應(yīng)用 Design－Expert v.7.1.6 軟件(美國(guó) Stat－Ease公司)，參照預(yù)試驗(yàn)結(jié)果，對(duì)響應(yīng)曲面的水平值進(jìn)行中心組合設(shè)計(jì)(Central Composite Design，CCD)，如表1所示.

表1 中心組合設(shè)計(jì)的因素和水平1)Tab.1 Factors and levels from central composite design

1.2 材料

五豐上食優(yōu)質(zhì)精腿肉購于上海卜蜂蓮花超市，迅速置于0～4℃冰箱中冷藏備用.

1.3 菌種的選用及活化

氣單胞菌(No.23564)來源于中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏管理中心，于氣單胞菌液體培養(yǎng)基(蛋白胨5 g，酵母提取物3 g，胰蛋白胨10 g，L－鹽酸鳥苷酸 5 g，甘露醇 1 g，肌醇 10 g，Na2S2O3·5H2O 0.4 g，枸櫞酸鐵胺0.5 g，溴甲酚紫0.02 g，瓊脂3 g，溶于1000 mL蒸餾水)中，27℃下活化3次，進(jìn)而挑取良好的單菌落制得初始菌懸液.培養(yǎng)基的配制參照文獻(xiàn)［7］.

1.4 樣品接種和貯藏

按試驗(yàn)設(shè)計(jì)中的20組處理，用5 mol·L－1的HCl和5 mol·L－1的 NaOH 將生理鹽水(8.3 mg·L－1的NaCl溶液)調(diào)到所需pH，121℃滅菌15 min，配制無菌水.稱取25 g肉塊，懸浮于80℃無菌水中10 s進(jìn)行消毒.將1.3中制得的初始菌懸液用無菌生理鹽水進(jìn)行梯度稀釋，并根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)中比濁法標(biāo)準(zhǔn)曲線方程調(diào)整至設(shè)計(jì)中所需初始接種量，然后將滅菌后肉塊懸浮于其中15 s進(jìn)行接種.在無菌袋中注入20 mL相應(yīng)pH的無菌水，將接種后肉塊封裝于上述無菌袋中，按試驗(yàn)設(shè)計(jì)分別置于相應(yīng)溫度下恒溫培養(yǎng).

1.5 微生物計(jì)數(shù)

適時(shí)取上述肉樣，用滅菌剪刀將肉樣剪碎置于裝有205 mL滅菌生理鹽水的三角瓶中，然后將無菌袋中的液體和殘留菌沖至三角瓶中，充分搖勻，按10倍稀釋法稀釋到所需稀釋度，參照文獻(xiàn)［8］用平板計(jì)數(shù)法進(jìn)行氣單胞菌計(jì)數(shù).直至細(xì)菌生長(zhǎng)達(dá)到穩(wěn)定期.其中培養(yǎng)基參照Mccoy等［9］設(shè)計(jì)的氣單胞菌鑒別培養(yǎng)基.

1.6 生長(zhǎng)曲線的擬合和生長(zhǎng)參數(shù)的觀測(cè)

應(yīng)用Origin 8.0軟件(美國(guó)OriginLab公司)，用修正的Gompertz模型［10］對(duì)冷卻豬肉中氣單胞菌的生長(zhǎng)曲線進(jìn)行擬合，計(jì)算氣單胞菌生長(zhǎng)的最大比生長(zhǎng)速率(U/h－1)和遲滯期(LPD/h).具體如下:

1.7 二級(jí)生長(zhǎng)預(yù)測(cè)方程(RSM)的建立

應(yīng)用Design－Expert v.7.1.6軟件建立變量的不同水平與生長(zhǎng)參數(shù)之間的多元回歸方程，應(yīng)用方差分析及F檢驗(yàn)多元回歸方程及其系數(shù)的顯著性.統(tǒng)計(jì)分析得到多元回歸模型如下:

式中，y為L(zhǎng)PD或U的響應(yīng)值，b0(系統(tǒng)中心點(diǎn))和bj、bjj、bji為不同的常量系數(shù)，xj和 xi為因素溫度(θ)、pH和初始接菌量(N0)(其中 i≠j)，e為模型誤差［12］.

1.8 預(yù)測(cè)方程的驗(yàn)證和檢驗(yàn)

得到多元回歸方程后，在所設(shè)試驗(yàn)條件范圍內(nèi)［溫度20～30℃，pH6.0～7.0，N0為3 lg N～5 lg N，其中N為菌數(shù)/(cfu·g－1)］，設(shè)定10組隨機(jī)數(shù)據(jù)，按上述方法采用Origin 8.0軟件擬合生長(zhǎng)曲線，計(jì)算生長(zhǎng)參數(shù)U和LPD.

用所建的二級(jí)預(yù)測(cè)方程對(duì)用來建模的20組數(shù)據(jù)和用來驗(yàn)證的10組數(shù)據(jù)分別處理預(yù)測(cè)生長(zhǎng)參數(shù)U和 LPD，用均方誤差(Mean square error，MSE)、偏差因子(Bias factor，BF)和準(zhǔn)確因子(Accuracy factor，AF)［13－14］作為衡量模型的標(biāo)準(zhǔn).公式如下:

式中，Vo為用修正的Gompertz模型擬合生長(zhǎng)模型的參數(shù)U或LPD的觀測(cè)值;Vp為用建立的RSM方程得出的對(duì)U或LPD的預(yù)測(cè)值，n為測(cè)定重復(fù)數(shù)［12］.

2 結(jié)果與分析

2.1 生長(zhǎng)曲線的擬合與生長(zhǎng)參數(shù)的觀測(cè)

用修正的Gompertz模型擬合豬肉中氣單胞菌的生長(zhǎng)曲線，計(jì)算生長(zhǎng)曲線的參數(shù)U和LPD.結(jié)果(表2)表明，修正的Gompertz模型可以較好地模擬不同試驗(yàn)條件下冷卻豬肉中氣單胞菌的生長(zhǎng)情況(R2＞0.96).

2.2 RSM生長(zhǎng)預(yù)測(cè)方程的建立和驗(yàn)證

本研究中氣單胞菌的生長(zhǎng)曲線參數(shù)U和LPD都采用了常用對(duì)數(shù)的變化，以達(dá)到均一化目的［12］，然后用逐步回歸方法(引入水平為0.05，去除水平為0.10)建立生長(zhǎng)曲線參數(shù)U和LPD對(duì)因素θ、pH和N0的響應(yīng)曲面模型如下:

方程(6)說明自變量能夠解釋因變量81.0%的變化，擬合效果較好，對(duì)所得RSM模型進(jìn)行方差分析，模型和各系數(shù)顯著(P＜0.05)，失擬檢驗(yàn)不顯著(P＞0.05).方程(7)自變量能夠解釋因變量72.2%的變化，因自變量N0的概率P＞0.05，所以只有自變量θ和pH進(jìn)入最后模型中.建立的RSM模型能較好地模擬因素θ、pH和N0對(duì)冷卻豬肉中氣單胞菌的生長(zhǎng)曲線參數(shù)U和LPD的影響.初始接菌量(N0)對(duì)氣單胞菌的生長(zhǎng)率(U)影響顯著.

應(yīng)用建立的RSM生長(zhǎng)預(yù)測(cè)方程對(duì)建模的20組處理和驗(yàn)證的10組處理分別進(jìn)行生長(zhǎng)參數(shù)U和LPD的觀測(cè)和預(yù)測(cè)(表2和表3).

表2 由Gompertz模型所得出的氣單胞菌在不同試驗(yàn)條件下的生長(zhǎng)參數(shù)1)Tab.2 Growth parameters of Aeromonas spp.obtained from Gompertz model under different experimental conditions

表3 不同試驗(yàn)條件下用于驗(yàn)證的氣單胞菌的生長(zhǎng)觀測(cè)和預(yù)測(cè)結(jié)果1)Tab.3 Observed and predicted U and LPD of Aeromonas spp.by RSM for validation under different combined conditions

2.3 預(yù)測(cè)方程的數(shù)學(xué)檢驗(yàn)

用來對(duì)結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證的組合的預(yù)測(cè)值與觀測(cè)值的比較如圖1和圖2所示.說明所建預(yù)測(cè)模型可靠性能夠接受，可以較好地模擬在本試驗(yàn)條件下冷卻豬肉中氣單胞菌的生長(zhǎng)情況.

圖1 應(yīng)用RSM預(yù)測(cè)方程對(duì)U預(yù)測(cè)值與觀測(cè)值的圖形比較Fig.1 Graphical comparisons between observed and predicted U of Aeromonas spp.by RSM for validation

圖2 應(yīng)用RSM預(yù)測(cè)方程對(duì)LPD預(yù)測(cè)值與觀測(cè)值的圖形比較Fig.2 Graphical comparisons between observed and predicted LPD of Aeromonas spp.by RSM for validation

用于建模試驗(yàn)組合的RSM預(yù)測(cè)方程的數(shù)學(xué)固有檢驗(yàn)和用于驗(yàn)證試驗(yàn)組合的RSM預(yù)測(cè)方程的數(shù)學(xué)擴(kuò)展檢驗(yàn)如表4所示.MSE的值越小，說明模型表達(dá)試驗(yàn)數(shù)據(jù)越充分.用于建模試驗(yàn)組合的U和LPD的 MSE 分別為 2.0 ×10－4和 64.0 ×10－4，而用于驗(yàn)證的分別為0.1 ×10－4和36.0 ×10－4，表示預(yù)測(cè)值和觀測(cè)值相似，均方誤差較小，表明所得模型可以很好地?cái)M合試驗(yàn)數(shù)據(jù).

偏差因子(BF)是衡量模型的一個(gè)非常重要的參數(shù)，Ross［11］認(rèn)為，對(duì)于微生物生長(zhǎng)模型的驗(yàn)證，如果BF值在0.90～1.05的范圍之內(nèi)，認(rèn)為該模型能夠很好地預(yù)測(cè)微生物生長(zhǎng)速度和生長(zhǎng)狀況;如果BF值在0.7～0.9或者1.06～1.15范圍之內(nèi)，則該模型是可以被接受的;如果BF值大于1.15或者小于0.7，則說明該模型是失敗的.這一判斷方法也成功用于單增李斯特菌Listeria monocytogenes生長(zhǎng)模型的判定［15］.由表4可知，本試驗(yàn)所得用于建模試驗(yàn)組合的U和LPD的BF值分別為0.9807和0.9917，用于驗(yàn)證的分別為0.9898和0.9885，說明建立的模型可以較好地表達(dá)微生物的生長(zhǎng)狀況.當(dāng)AF=1的時(shí)候，說明模型有很高的精確性，數(shù)值越大，或者越小，說明該模型的準(zhǔn)確性越低［16］.如表4所示，用于建模試驗(yàn)組合的U的AF值都屬于可以接受的結(jié)果.本試驗(yàn)建立的預(yù)測(cè)方程適合預(yù)測(cè)不同試驗(yàn)條件下冷卻豬肉中氣單胞菌的生長(zhǎng)參數(shù).

表4 RSM預(yù)測(cè)方程的數(shù)學(xué)固有檢驗(yàn)和擴(kuò)展檢驗(yàn)Tab.4 Internal and external mathematical validation by RSM for model validation

3 討論與結(jié)論

本研究?jī)H對(duì)豬肉中優(yōu)勢(shì)腐敗菌之一的氣單胞菌開展研究，冷卻豬肉中氣單胞菌生長(zhǎng)情況復(fù)雜，影響模型建立的因素很多，冷卻豬肉中的氣單胞菌菌齡并不完全一樣，會(huì)對(duì)模型的參數(shù)產(chǎn)生影響.有研究表明，早期的環(huán)境和所處的生長(zhǎng)階段都會(huì)對(duì)細(xì)胞轉(zhuǎn)入新環(huán)境后適應(yīng)和再次生長(zhǎng)所用的時(shí)間產(chǎn)生影響［16］.另外，冷卻豬肉中存在的其他微生物也會(huì)對(duì)氣單胞菌的生長(zhǎng)有協(xié)同或拮抗作用，已有專門對(duì)試驗(yàn)條件下混合菌種的研究［17］，也可用單一的預(yù)測(cè)模型進(jìn)行模擬.同時(shí)，實(shí)際食品環(huán)境的復(fù)雜性遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于試驗(yàn)條件組合，一般認(rèn)為試驗(yàn)條件下的預(yù)測(cè)會(huì)出現(xiàn)Fail－Safe情況，試驗(yàn)條件下得到的生長(zhǎng)預(yù)測(cè)模型在用于生產(chǎn)實(shí)踐前，要經(jīng)過實(shí)際食品的驗(yàn)證才能真正推廣使用.

試驗(yàn)除了將溫度作為對(duì)微生物生長(zhǎng)的主要影響因素加以研究外，還將pH和初始接菌量作為顯著影響因素引進(jìn)了預(yù)測(cè)方程，從所建的生長(zhǎng)預(yù)測(cè)模型來看，溫度、pH都對(duì)冷卻豬肉中氣單胞菌的生長(zhǎng)有顯著影響，而初始接種量只對(duì)氣單胞菌生長(zhǎng)的最大比生長(zhǎng)速率U有影響，對(duì)遲滯期LPD的影響則可以忽略.本研究建立的生長(zhǎng)預(yù)測(cè)模型經(jīng)數(shù)學(xué)檢驗(yàn)預(yù)測(cè)誤差較低，擬合性較好，而且因?yàn)樵囼?yàn)是基于真正食品環(huán)境，比用培養(yǎng)基培養(yǎng)得出的結(jié)果更適合用于生產(chǎn)實(shí)踐.

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