郝小軍，王勝，黃家風(fēng)

（石河子大學(xué)綠洲農(nóng)作物病害防控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，石河子832003）

椒樣薄荷（Mentha piperita L.）又名胡椒薄荷，歐洲薄荷、辣薄荷，為唇形科薄荷屬多年生宿根草本植物。其精油在化妝品、香水、牙膏以及口香糖、飲料、糖果、糕點(diǎn)制作中廣泛應(yīng)用［1］。新疆是我國(guó)最大的椒樣薄荷種植區(qū)，年產(chǎn)椒樣薄荷精油18萬kg，占全國(guó)總產(chǎn)量的80%以上。近年由于椒樣薄荷品種退化加重，造成新疆精油產(chǎn)量和品質(zhì)逐年降低［2－3］。大量資料顯示，病毒侵染是許多無性繁殖作物品種退化、品質(zhì)變差的主要因素之一。盡管薄荷屬植物約有30種，但侵染薄荷屬的病毒種類卻很少，目前已報(bào)道的有薄荷病毒X（MVX）、薄荷病毒A（MVA）、薄荷潛隱病毒（MLV）、草莓潛隱環(huán)斑病毒（SLRV）和巴基斯坦番茄曲葉病毒（To LCBV）等［4－5］。而有關(guān)椒樣薄荷的品種退化是否是病毒侵染所致，及可能的病毒種類尚未見相關(guān)報(bào)道。因此，進(jìn)行椒樣薄荷病毒種類鑒定時(shí)，由于缺乏相關(guān)的病毒信息，常規(guī)RT－PCR方法的應(yīng)用受到限制。

雙鏈RNA（dsRNA）分離技術(shù)的主要依據(jù)是大多數(shù)病毒或類病毒在復(fù)制時(shí)會(huì)產(chǎn)生較大分子量的dsRNA，而正常的植物組織則不產(chǎn)生，因此可將其作為植物病毒及類病毒檢測(cè)和診斷的依據(jù)。以dsRNA為模板通過單引物擴(kuò)增（single primer amplification technique，SPAT）獲得病毒基因組是鑒定病毒的一種主要方法。SPAT是在dsRNA 3′末端加上一段3′末端被氨基修飾了的DNA寡核苷酸序列作為接頭（primer A），然后用與此接頭互補(bǔ)的DNA寡核苷酸序列作為引物（primer B）進(jìn)行RTPCR，即可獲得大量cDNA產(chǎn)物。SPAT方法不受任何序列限制，適用于任何已知或未知序列的dsRNA 克?。?］。

本研究通過對(duì)椒樣薄荷病株進(jìn)行dsRNA分離、單引物擴(kuò)增，從病株中克隆到CMV的1a基因片段；根據(jù)所獲病毒信息，設(shè)計(jì)了3對(duì)針對(duì)CMV的特異引物，從病株中均能擴(kuò)增到相應(yīng)的目標(biāo)片段，從而明確CMV可以侵染椒樣薄荷。研究結(jié)果為探索椒樣薄荷品種退化、病害防治奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

葉片變紅并伴有花葉癥狀的2株椒樣薄荷MP1和MP2采自伊犁新疆兵團(tuán)農(nóng)四師65團(tuán)。纖維素CF－11購(gòu)自Promega公司；T4RNA Ligase、LA Taq TM、T4DNA Ligase、p MD18－T Vector購(gòu)自Ta KaRa公司；DTT、RNasin購(gòu)自Invitrogen公司；2×Taq DNA聚合酶 Mix為東盛生物公司產(chǎn)品；膠回收試劑盒為鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司產(chǎn)品；其余試劑為進(jìn)口或國(guó)產(chǎn)分析純。PCR引物由北京華大基因科技發(fā)展有限公司合成，RT－PCR所需引物如表1。

表1 PCR擴(kuò)增所用引物序列Tab.1 Sequences of primer pairs for PCR amplification

1.2 以dsRNA為模板的單引物擴(kuò)增、克隆與測(cè)序

取5 g新鮮感病椒樣薄荷葉片提取dsRNA，參考Chen等［6］的方法。以提取的dsRNA為材料，在T4RNA連接酶的作用下，將寡核苷酸接頭primer A與dsRNA模板的3′－OH連接。連接反應(yīng)如下：2 μL 10×T4RNA Ligase Buffer、10μL PEG（50%）、1μL BSA（0.1%）、0.5μL T4RNA Ligase、1μL T4DNA Ligase、4 μL dsRNA、1μL Primer A，用dd H2O補(bǔ)足20μL。16℃連接16 h。然后將連接產(chǎn)物進(jìn)行末端補(bǔ)平，反應(yīng)條件為：25μL連接產(chǎn)物、0.5μL d NTP、0.5μL Taq DNA polymerse、3μL 10×PCR Buffer，68℃水浴3 h，用無水乙醇抽提連接產(chǎn)物，溶于10μL的dd H2O。最后利用單一引物primer B進(jìn)行RT－PCR。PCR擴(kuò)增反應(yīng)參數(shù)設(shè)置如下：94℃5 min，94 ℃30 s，60℃45 s，72℃1 min，30個(gè)循環(huán)，72℃10 min?；厥誔CR產(chǎn)物并克隆到載體p MD18－T上，選擇PCR和酶切鑒定均為陽性的克隆進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序工作由北京華大基因科技發(fā)展有限公司完成。

1.3 以植物總RNA為模板的RT－PCR、克隆與測(cè)序

取新鮮感病椒樣薄荷葉片提取總RNA，采用改良的LiCl沉淀法進(jìn)行［7］。然后以CMV的3對(duì)特異引物進(jìn)行RT－PCR、克隆和測(cè)序。PCR擴(kuò)增反應(yīng)參數(shù)設(shè)置如下：94℃5 min，94℃30 s，退火溫度根據(jù)擴(kuò)增引物Tm值設(shè)定，時(shí)間30 s，72℃延伸1 min，35個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸10 min。

1.4 序列分析

測(cè)序結(jié)果提交NCBI進(jìn)行BLAST檢索比對(duì)。用軟件 DNAStar 5.02和 DNAMAN version 5.2.2進(jìn)行序列分析。多序列比較采用DNAStar clustal W方法，進(jìn)化樹構(gòu)建采用DNAMAN的鄰近相連法（Neighbor－joining）。

2 結(jié)果與分析

2.1 病毒dsRNA的分離

利用dsRNA分析法對(duì)病樣MP1和MP2進(jìn)行初步檢測(cè)，瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果（圖1）顯示，2個(gè)樣品均可電泳出3條帶，且?guī)拖嗤s為3.4、2.2和1.8 kb。由此說明，2個(gè)病株都受到了相同病毒的侵染。

圖1 椒樣薄荷病株dsRNA電泳分析Fig.1 Electrophoresis analysis of dsRNAs from M.piperita L.

2.2 以dsRNA為模板的單引物RT－PCR、克隆與序列分析

回收以上3.4、2.2和1.8 kb的電泳條帶，分別記作R1、R2和R3，然后分別作為模板，通過單引物法獲得cDNA并進(jìn)行PCR擴(kuò)增。以R1為模板擴(kuò)增到2個(gè)條帶，約為350和1000 bp；以R2為模板擴(kuò)增到1條350 bp左右的片段；而以R3為模板未擴(kuò)增任何條帶（圖2）

將R1為模板擴(kuò)增到的2個(gè)片段分別連接到p MD18－T上進(jìn)行克隆和測(cè)序，得到2個(gè)目標(biāo)片段的核苷酸序列分別為976和352 bp。將它們?cè)贕en－Bank中進(jìn)行BLAST，976 bp片段序列在GenBank中沒有相似的基因序列。352 bp片段的序列與CMV基因組RNA1組分具有很高的序列相似性，其中與CMV－LW 分離物RNA1組分（登錄號(hào)：EU414792）上的1a基因499～850位核苷酸的序列同源性高達(dá)97.2%，結(jié)果表明，新疆椒樣薄荷受到CMV的侵染。

圖2 單引物擴(kuò)增的RT－PCR結(jié)果Fig.2 RT－PCR results by single primer amplification technique

2.3 目標(biāo)基因的RT－PCR、克隆與序列分析

為了進(jìn)一步明確CMV侵染椒樣薄荷，由以上鑒定結(jié)果獲得的信息，根據(jù)GenBank中登錄的CMV基因組序列設(shè)計(jì)了3對(duì)針對(duì)CMV 2a基因、2b基因和CP基因的特異引物，對(duì)病毒分離物MP1和MP2進(jìn)行了相應(yīng)目標(biāo)基因的RT－PCR。結(jié)果均擴(kuò)增到預(yù)期的目標(biāo)片段，如圖4所示，用針對(duì)CMV 2a基因的引物2a－F和2a－R擴(kuò)增到約500 bp的目標(biāo)片段（圖3a）；用針對(duì)CMV 2b基因的引物2b－F和2b－R擴(kuò)增到約350 bp的目標(biāo)片段（圖3b）；用針對(duì)CMV CP基因的引物Cp－F和Cp－R擴(kuò)增到約770 bp的目標(biāo)片段（圖3c）。

圖3 病毒分離物MP1和MP2目標(biāo)基因的RT－PCR擴(kuò)增Fig.3 RT－PCR amplified of isolates MP1 and MP2

對(duì)MP1分離物的770 bp片段進(jìn)行克隆和測(cè)序，得到該片段序列為774個(gè)核苷酸 ?；驇?kù)檢索表明，該序列為CMV RNA3組分上的部分序列，含有1個(gè)由657個(gè)核苷酸的開放閱讀框（CP基因），編碼由219個(gè)氨基酸組成的CP蛋白。該片段核苷酸序列及其編碼的蛋白氨基酸序列與國(guó)內(nèi)外報(bào)道的其它CMV分離物有很高的序列相似性，核苷酸同源性高達(dá)93.4%～96.9%，氨基酸同源性高達(dá)95.4%～99.1%（表2）?；贑P基因構(gòu)建系統(tǒng)關(guān)系樹，MP1分離物與來自福建的PE分離物形成1個(gè)小的進(jìn)化分支，進(jìn)而與來自希臘、臺(tái)灣、意大利、西班牙、印度、中國(guó)江蘇和云南的分離物形成1個(gè)大的進(jìn)化分支，其它來自澳大利亞、廣東、臺(tái)灣和浙江的分離物形成1個(gè)進(jìn)化分支，湖北的2個(gè)分離物和意大利的1個(gè)分離物分別單獨(dú)形成1個(gè)進(jìn)化分支（圖4）。因此，CMV CP基因從進(jìn)化過程中不以地理分布為基礎(chǔ)，這與該病毒寄主范圍廣泛、世界分布相適應(yīng)性。

表2 CMV分離物MP1與其它分離物CP基因核苷酸和氨基酸同源性比較Tab.2 Comparison of nucleotide and amino acid sequence identities of CP gene and encoded proteins among MP1 and other isolates of CMV

圖4 基于CMV CP基因核苷酸序列構(gòu)建的系統(tǒng)關(guān)系樹Fig.4 Phylogenetic tree based on alignments of nucleotide sequences of CMV CP

3 結(jié)論與討論

通過對(duì)病組織進(jìn)行dsRNA分離、單引物擴(kuò)增、克隆和測(cè)序，從椒樣薄荷病樣中獲得CMV 1a基因的部分序列。CMV是一種三分體病毒，基因組由3個(gè)單鏈RNA（RNA1、RNA2和RNA3）分子組成。RNA1編碼1a基因；RNA2編碼2a和2b基因；RNA3編碼3a基因和CP基因。為了進(jìn)一步明確CMV侵染椒樣薄荷，針對(duì)CMV 2a基因、2b基因和CP基因設(shè)計(jì)特異引物，對(duì)病毒分離物MP1和MP2進(jìn)行了相應(yīng)目標(biāo)基因的RT－PCR，結(jié)果均擴(kuò)增到預(yù)期的目標(biāo)片段。由此說明，CMV的3個(gè)RNA組分都存在于椒樣薄荷病株中，椒樣薄荷受到CMV侵染。

本研究在分離dsRNA時(shí)獲得了3條大小不同的條帶，但利用SPAT方法只克隆到CMV RNA1部分基因片段和1段976 bp的未知序列，未知序列是一種新病毒還是寄主椒樣薄荷的某段序列還需要進(jìn)一步明確。雖然用該方法經(jīng)過多次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，也未能擴(kuò)增到3個(gè)條帶的全序列，可能是各基因組片段在寄主中的含量較低，或是分離dsRNA時(shí)椒樣薄荷的物質(zhì)去除不盡，抑制了以dsRNA為模板進(jìn)行單引物擴(kuò)增的某個(gè)過程。此外，dsRNA結(jié)構(gòu)相對(duì)穩(wěn)定、平末端接頭連接效率低、較大片段擴(kuò)增受限制等問題，也是影響該方法在克隆植物dsRNA病毒基因組的關(guān)鍵因素［8－9］。因此，利用該方法如何提高擴(kuò)增效率還需要進(jìn)行深入研究。

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